CN110592248B - 一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用 - Google Patents
一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110592248B CN110592248B CN201911020692.5A CN201911020692A CN110592248B CN 110592248 B CN110592248 B CN 110592248B CN 201911020692 A CN201911020692 A CN 201911020692A CN 110592248 B CN110592248 B CN 110592248B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- clostridium
- clostridium butyricum
- screening
- butyricum
- pcr amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明根据丁酸梭状芽孢杆菌核心基因设计特异性引物，将特异性引物用于丁酸梭状芽孢杆菌的筛选和鉴定。与基于TSN选择性培养基的传统筛选方法相比，本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌PCR方法，准确度高，准确率可达100％；特异性强；灵敏度高，检出限为7.95×10‑3ng/μL，可以缩小筛选样品的范围，提高筛选到目的菌株的几率，有效缩短筛选周期，降低工作量，提高筛选效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)，又名酪酸梭菌，是芽孢杆菌科、梭菌属的一种革兰氏阳性厌氧细菌。广泛存在于奶酪、天然酸奶、人与动物粪便及土壤中。丁酸梭状芽孢杆菌发酵过程中产气,发酵产物包括乙酸、丁酸、丁醇、淀粉酶、脂肪酶、维生素等。丁酸梭状芽孢杆菌作为微生态制剂的研究是1933年日本千叶医学院博士首先发现并报告。此后,丁酸梭状芽孢杆菌由于可调节人体肠道微生态平衡，具有极强的整肠作用等益生功能，被广泛用作肠炎治疗药物、食品添加剂、兽药和饲料添加剂。
因此，筛选大量不同来源的丁酸梭状芽孢杆菌，构建丁酸梭状芽孢杆菌资源库，对于挖掘我国益生菌的资源、选择具有优良益生特性的丁酸梭状芽孢杆菌用于治疗和缓解人类疾病意义重大。
丁酸梭状芽孢杆菌作为厌氧菌，主要从粪便和土壤中筛选，目前，普遍采用RCM以及TSN琼脂培养基进行筛选，最后分离株通过生理生化实验及16S rRNA测序进行鉴定。然而RCM琼脂培养基特异性差，同时丁酸梭状芽孢杆菌不是肠道和土壤中的优势菌株，其相对丰度低导致最终筛选较为困难。TSN琼脂培养基特异性较RCM琼脂培养基高，但由于丁酸梭状芽孢杆菌在样本中分布不均一，特别是粪便样本，含有丁酸梭状芽孢杆菌的样本比例低，工作量大且不易获得目标菌株这使得丁酸梭状芽孢杆菌的筛选和分离具有偶然性和随机性，工作量大且不易获得目标菌株，大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。因而发展高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法具有重要的应用价值。
发明内容
本发明所述高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是通过设计丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物，凝胶电泳检测PCR扩增结果来确定粪便样品中是否含有丁酸梭状芽孢杆菌，缩小筛选样品的范围来进行的。
本发明的第一个目的是提供一种高效鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是以(a)～(c)任一所示的引物对微生物进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特异性条带的为丁酸梭状芽孢杆菌；其中，
(a)正向引物：5＇-TCAATTAGAAGGCAGAGTACC-3＇(SEQ ID NO:1)；
反向引物：5＇-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3＇(SEQ ID NO:2)；
(b)正向引物：5＇-CAAAGTCATCATCTAGTCGT-3＇(SEQ ID NO:3)；
反向引物：5＇-TCCATTATAAGCTGGTGCAT-3＇(SEQ ID NO:4)；
(c)正向引物：5＇-TACACTCCTATCATCACCCTTAT-3＇(SEQ ID NO:5)；
反向引物：5＇-CACCTAAATCGGCAGCAGCAT-3＇(SEQ ID NO:6)。
本发明的第二个目的是提供一种筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，是以所述(a)～(c)任一所示的引物对样品进行PCR扩增，经凝胶电泳获得特定大小特异性条带的样品含有丁酸梭状芽孢杆菌。
在一种实施方式中，所述方法采用(a)所示的引物进行PCR扩增，并获得1022bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。
在一种实施方式中，所述方法采用(b)所示的引物进行PCR扩增，并获得491bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。
在一种实施方式中，所述方法采用(c)所示的引物进行PCR扩增，并获得445bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。
在一种实施方式中，用于所述PCR扩增的反应体系中含有DNA模板、2×Taq PlusMasterMix(Dye)、正向引物、反向引物和无菌双蒸水的体积比为4:25:1:1:19。
在一种实施方式中，DNA模板的终浓度为10-20ng/μL。
在一种实施方式中，PCR扩增反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
本发明还要求保护所述方法在微生物技术领域筛选或鉴定丁酸梭状芽孢杆菌方面的应用。
在一种实施方式中，所述方法采用选择性培养基培养样品中的微生物，挑取单菌落，以单菌落或其DNA为模板进行PCR扩增；所述选择性培养基含有：酵母粉、蛋白胨、亚硫酸钠、柠檬酸铁、新霉素和多粘菌素B。
在一种实施方式中，所述选择性培养基为TSN培养基，每L含有：酵母粉10g，蛋白胨15g，亚硫酸钠1g，柠檬酸铁0.5g，新霉素0.05g，多粘菌素B 0.02g，琼脂粉20g。
有益效果：
(1)准确度高、特异性强
本发明提供的丁酸梭状芽孢杆菌的PCR扩增引物具有高度特异性，在本发明涉及的丁酸梭菌菌株内，准确率达100％。可以特异性检测出丁酸梭状芽孢杆菌，所检测的阴性对照如索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、Clostridiumsulfidigenes、Clostridium aerotolerans和水对照均无阳性结果。
(2)灵敏度高，检测结果准确
使用传统筛选方法筛选丁酸梭状芽孢杆菌，对样品中是否含有丁酸梭状芽孢杆菌是未知的，导致筛选的盲目性、工作量大。
本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的PCR扩增引物具有灵敏度高的特点，最小检出限为103CFU/μL。即使样品中丁酸梭状芽孢杆菌含量低或已经失活，使用本发明的PCR扩增引物进行扩增也可以检测到，因而做出正确的判定，为筛选样品指明了方向，加快了实验进程，提高了筛选效率。
(3)耗时少，迅速获得结果
传统筛选丁酸梭状芽孢杆菌方法具有盲目性、随机性，筛选周期长、工作量大。一个样品筛选周期为4-5天。分离得到的菌株经16S rRNA鉴定将耗时2-3天才能得到准确结果。本发明通过一次特定的PCR扩增即可完成粪便样品的筛选，缩小筛选样品范围，减少了约90％不含丁酸梭状芽孢杆菌样品不必要的筛选工作。同时，分离得到的菌株可以经16SrRNA鉴定，也可以通过本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的PCR扩增引物进行鉴定，从PCR扩增到琼脂糖凝胶电泳检测判定只需要4-5个小时。利用本发明提供的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，在时间成本、工作量、经济成本等方面具有明显的优势。
附图说明
图1为实施例2中特异性引物CBU21F/CBU1023R对20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为DNA maker，C泳道为阴性对照，1-20号泳道为20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果。
图2为实施例2中特异性引物CBU80F/CBU551R对20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为DNA maker，C泳道为阴性对照，1-20号泳道为20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果。
图3为实施例2中特异性引物CBU64F/CBU488R对20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为DNA maker，C泳道为阴性对照，1-20号泳道为20株丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果。
图4为实施例3中特异性引物CBU21F/CBU1023R对12株梭菌属其他梭菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为DNA maker，P泳道为丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果即阳性对照，N泳道为阴性对照，1-12号泳道分别为索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)、Clostridium sulfidigenes、Clostridium aerotolerans DNA的扩增结果。
图5为实施例3中特异性引物CBU80F/CBU551R对12株梭菌属其他梭菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为DNA maker，P泳道为丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果即阳性对照，N泳道为阴性对照，1-12号泳道分别为索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)、Clostridium sulfidigenes、Clostridium aerotolerans DNA的扩增结果。
图6为实施例3中特异性引物CBU64F/CBU488R对12株梭菌属其他梭菌DNA扩增产物的凝胶电泳检测图。其中，M泳道为DNA maker，P泳道为丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果即阳性对照，N泳道为阴性对照，1-12号泳道分别为索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridiumparaputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)、Clostridium sulfidigenes、Clostridium aerotolerans DNA的扩增结果。
图7为实施例4中特异性引物CBU21F/CBU1023R灵敏度检测结果。其中，M泳道为DNAmaker，C泳道为阴性对照，1-7泳道分别为106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、101CFU/μL、100CFU/μL浓度的丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增结果。
图8为实施例4中特异性引物CBU80F/CBU551R灵敏度检测结果。其中，M泳道为DNAmaker，C泳道为阴性对照，1-7泳道分别为106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、101CFU/μL、100CFU/μL浓度的丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增结果。
图9为实施例4中特异性引物CBU64F/CBU488R灵敏度检测结果。其中，M泳道为DNAmaker，C泳道为阴性对照，1-7泳道分别为106CFU/μL、105CFU/μL、104CFU/μL、103CFU/μL、102CFU/μL、101CFU/μL、100CFU/μL浓度的丁酸梭状芽孢杆菌DNA扩增结果。
图10的A为实施例6中特异性引物CBU21F/CBU1023R对22份粪便样品DNA扩增产物的凝胶电泳检测图；其中，M泳道为DNA maker，P泳道为丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果即阳性对照，N泳道为阴性对照，1-22号泳道为22份粪便样品DNA的扩增结果；B为实施例6中特异性引物CBU21F/CBU1023R对另22份粪便样品DNA扩增产物的凝胶电泳检测图；其中，M泳道为DNA maker，P泳道为丁酸梭状芽孢杆菌DNA的扩增结果即阳性对照，N泳道为阴性对照，1-22号泳道为22份粪便样品DNA的扩增结果。
具体实施方式
具体实施方式中所涉及的生物材料：20株丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)、其他梭菌如索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、Clostridiumsulfidigenes、Clostridium aerotolerans各1株，都取自江南大学食品学院食品生物技术研究中心的菌种保藏中心(中国无锡)。细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
实施例1鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法
设计如下引物：
(1)引物CBU21F/CBU1023R序列分别为：
Forward primer：5＇-TCAATTAGAAGGCAGAGTACC-3＇(SEQ ID NO:1)
Reverse primer：5＇-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3＇(SEQ ID NO:2)
扩增的目的基因片段大小为1022bp；
(2)引物CBU80F/CBU551R序列分别为：
Forward primer：5＇-CAAAGTCATCATCTAGTCGT-3＇(SEQ ID NO:3)
Reverse primer：5＇-TCCATTATAAGCTGGTGCAT-3＇(SEQ ID NO:4)
扩增的目的基因片段大小为491bp；
(3)引物CBU64F/CBU488R序列分别为：
Forward primer：5＇-TACACTCCTATCATCACCCTTAT-3＇(SEQ ID NO:5)
Reverse primer：5＇-CACCTAAATCGGCAGCAGCAT-3＇SEQ ID NO:6
扩增的目的基因片段大小为445bp。
模板DNA的提取：使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，北京天根生化科技有限公司)提取20个丁酸梭状芽孢杆菌和作为对照的12株细菌培养物的基因组DNA。
PCR反应体系建立如表1所示；
表1 PCR反应体系
| 试剂 | 25μL反应体系 | 终浓度 |
| 2*Taq Plus Master Mix(Dye) | 12.5μL | 1* |
| Forward Primer,20μM | 0.5μL | 0.4μM |
| Reverse Primer,20μM | 0.5μL | 0.4μM |
| Template DNA | 2μL | 10-20ng/μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 9.5μL | / |
PCR反应程序：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃60s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
结果判定：所述的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的PCR方法结果判定是采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法：将PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察是否有目的条带。首先阳性对照和阴性对照成立，如果从粪便样品DNA中扩增出了特异性条带，则说明该样品存在丁酸梭状芽孢杆菌，可进行丁酸梭状芽孢杆菌筛选；如果粪便样品DNA没有扩增出特异性条带，则说明该样品不含有丁酸梭状芽孢杆菌，从而不需要进行丁酸梭状芽孢杆菌筛选。
实施例2筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法
基于TSN选择性培养基完成对扩增出目的条带的粪便样品中丁酸梭状芽孢杆菌的筛选。将样品梯度稀释，每个稀释度取100μL涂布于TSN选择性培养基平板上，37℃厌氧培养48h，挑选厌氧条件下正常生长的单菌落在TSN选择性培养基平板上进行划线分离，37℃培养48h后，挑选菌落形态与丁酸梭状芽孢杆菌相似的单菌落。按照实施例1的方式进行PCR扩增，获得相应特异性目的条带的为目标菌株。
实施例3高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌PCR扩增引物的准确度检测
分别以CBU21F/CBU1023R、CBU80F/CBU551R和CBU64F/CBU488R为引物进行PCR扩增引物的准确度检测。
提取20株来自不同样品的丁酸梭状芽孢杆菌的基因组DNA，使用实施例1中优化好的引物CBU21F/CBU1023R和反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，从图1可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物CBU21F/CBU1023R，能够准确的扩增出20株丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表示本发明的PCR扩增引物具有高准确度，在发明涉及的丁酸梭状芽孢杆菌样本内，准确率为100％；
提取20株来自不同样品的丁酸梭状芽孢杆菌的基因组DNA，使用实施例1中优化好的引物CBU80F/CBU551R和反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，从图2可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物CBU80F/CBU551R，能够准确的扩增出20株丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表示本发明的PCR扩增引物具有高准确度，在发明涉及的丁酸梭状芽孢杆菌样本内，准确率为100％；
提取20株来自不同样品的丁酸梭状芽孢杆菌的基因组DNA，使用实施例1中优化好的引物CBU64F/CBU488R和反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，从图3可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物CBU64F/CBU488R，能够准确的扩增出20株丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表示本发明的PCR扩增引物具有高准确度，在发明涉及的丁酸梭状芽孢杆菌样本内，准确率为100％；
实施例4：高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌PCR扩增引物的特异性检测
分别以CBU21F/CBU1023R、CBU80F/CBU551R和CBU64F/CBU488R为引物进行PCR扩增引物的特异性检测。
提取丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)、索氏梭菌(Clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、Clostridium sulfidigenes、Clostridium aerotolerans的基因组DNA，使用实施例1中引物CBU21F/CBU1023R和优化好的反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示，从图4中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物CBU21F/CBU1023R，能够准确的扩增出丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，其他梭菌细菌DNA和水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表明本发明的PCR扩增引物具有很好地特异性；
提取丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)、索氏梭菌(Clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、Clostridium sulfidigenes、Clostridium aerotolerans的基因组DNA，使用实施例1中优化好的引物CBU80F/CBU551R和反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示，从图5中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物CBU80F/CBU551R，能够准确的扩增出丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，其他梭菌细菌DNA和水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表明本发明的PCR扩增引物具有很好地特异性；
提取丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)、索氏梭菌(Clostridiumsordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、巴氏梭菌(Clostridium barati)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肖氏梭菌(Clostridium chauvoei)、Clostridium sulfidigenes、Clostridium aerotolerans的基因组DNA，使用实施例1中优化好的引物CBU64F/CBU488R和反应体系和反应程序进行PCR扩增，检测本发明的PCR扩增引物的特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图6所示，从图6中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物CBU64F/CBU488R，能够准确的扩增出丁酸梭状芽孢杆菌的靶标序列片段，为阳性结果，其他梭菌细菌DNA和水对照反应未检测到扩增条带，为阴性结果，表明本发明的PCR扩增引物具有很好地特异性，但是存在杂带。
实施例5：高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌PCR扩增引物的灵敏度检测
分别以CBU21F/CBU1023R、CBU80F/CBU551R和CBU64F/CBU488R为引物进行PCR扩增引物的灵敏度检测。
将起始浓度为106CFU/μL的丁酸梭状芽孢杆菌基因组DNA，用灭菌双蒸水连续10倍倍比稀释后作为模板DNA，采用实施例1中引物CBU21F/CBU1023R和优化的反应体系和反应程序进行PCR扩增，进行特异性引物CBU21F/CBU1023R的灵敏度验证实验。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图7所示，从图7中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物最低检出限为103CFU/μL。
将起始浓度为106CFU/μL的丁酸梭状芽孢杆菌基因组DNA，用灭菌双蒸水连续10倍倍比稀释后作为模板DNA，采用实施例1中引物CBU80F/CBU551R和优化的反应体系和反应程序进行PCR扩增，进行特异性引物CBU80F/CBU551R的灵敏度验证实验。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8所示，从图8中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物最低检出限为104CFU/μL。
将起始浓度为106CFU/μL的丁酸梭状芽孢杆菌基因组DNA，用灭菌双蒸水连续10倍倍比稀释后作为模板DNA，采用实施例1中引物CBU64F/CBU488R和优化的反应体系和反应程序进行PCR扩增，进行特异性引物CBU64F/CBU488R的灵敏度验证实验。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9所示，从图9中可以看出本实施方式用于扩增丁酸梭状芽孢杆菌的特异性引物最低检出限为104CFU/μL。
综合实施例2-4，引物CBU21F/CBU1023R不仅准确性高、特异性强，而且灵敏度高，综合性能优于引物CBU80F/CBU551R和引物CBU64F/CBU488R。
实施例6：丁酸梭状芽孢杆菌传统筛选方法
随机选取44份人粪便样品，梯度稀释，每个稀释度取100μL涂布于TSN选择性培养基平板上，37℃厌氧培养48h，挑选厌氧条件下正常生长的单菌落在TSN选择性培养基平板上进行划线分离，37℃培养48h后，挑选菌落形态、生长特性等与丁酸梭状芽孢杆菌相似的单菌落，采用16S rRNA菌株鉴定。结果显示，44份粪便样品获得450个单菌落，经16S rRNA鉴定，获得丁酸梭状芽孢杆菌1株。筛选周期长达4周，筛选工作效率为11份/周，样品筛选成功率为2.3％以及单菌落筛选成功率为0.2％。
实施例7：一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌方法的验证
由于粪便样品中存在较多干扰PCR扩增的杂质，对粪便样品的DNA进行提取，以去除大部分杂质。随机选取与实施例6中同等数量的44份人粪便样品DNA，使用本发明的高效筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，采用特异性引物CBU21F/CBU1023R分别进行PCR扩增。结果显示(图10A、10B)，总共有2份粪便样品DNA检测出丁酸梭状芽孢杆菌的特异性条带，为阳性结果。采用实施例6相同的操作方式即筛选这2份粪便样品，结果显示，共获得20个单菌落，经特异性引物CBU21F/CBU1023R鉴定，获得10株丁酸梭状芽孢杆菌，均来自同一份粪便样品。该方法减少了42份不含丁酸梭状芽孢杆菌粪便样品的筛选工作，筛选周期仅5天，筛选工作效率为44份/周，样品筛选成功率为50％以及单菌落筛选成功率为50％。
实施例7与实施例6对比可得，筛选工作效率从11份/周提升至44份/周，提升了300％；样品筛选成功率从2.3％提升至50％；单菌落筛选成功率从0.2％提升至50％。
发明人应用实施例7的方法进行了多次筛选实验，与实施例6现有的TSN选择性平培养基筛选方法相比，筛选成功率均不同程度提升，对于未筛选到目的菌株的粪便样品原因可能是样品中丁酸梭状芽孢杆菌含量低或保藏不当已经失活。本发明的方法克服了筛选过程中目的菌株培养条件探索困难、易受杂菌干扰等瓶颈问题，极大缩短了筛选所需的周期。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaattagaa ggcagagtac c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctaaaactga ctgtggcatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caaagtcatc atctagtcgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tccattataa gctggtgcat 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tacactccta tcatcaccct tat 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacctaaatc ggcagcagca t 21
Claims (5)
1.一种筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法，其特征在于，以下述引物对样品进行PCR扩增，经凝胶电泳获得1022bp大小的特异性条带的样品含有丁酸梭状芽孢杆菌；采用选择性培养基培养含有丁酸梭状芽孢杆菌样品中的微生物，挑取单菌落，以单菌落或其DNA为模板，采用丁酸梭状芽孢杆菌下述引物进行PCR扩增，获得1022 bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌；所述样品为人粪便样品；所述丁酸梭状芽孢杆菌为非致病菌；其中，引物序列如下：
正向引物：5＇- TCAATTAGAAGGCAGAGTACC -3＇；
反向引物：5＇- CTAAAACTGACTGTGGCATT -3＇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择性培养基含有：酵母粉、蛋白胨、亚硫酸钠、柠檬酸铁、新霉素和多粘菌素B。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于所述PCR扩增的反应体系中DNA模板的终浓度为10-20ng/μL，正向引物和反向引物的终浓度分别为0.4μM。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于， PCR扩增反应条件为：预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，退火54℃ 30s，延伸72℃ 60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
5.一种高效鉴定丁酸梭状芽孢杆菌的方法，其特征在于，以下述引物对微生物进行PCR扩增，获得1022 bp大小的特异性条带的菌株为丁酸梭状芽孢杆菌；所述丁酸梭状芽孢杆菌为非致病菌；其中，引物序列如下：
正向引物：5＇- TCAATTAGAAGGCAGAGTACC -3＇；
反向引物：5＇- CTAAAACTGACTGTGGCATT -3＇。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911020692.5A CN110592248B (zh) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | 一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911020692.5A CN110592248B (zh) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | 一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110592248A CN110592248A (zh) | 2019-12-20 |
| CN110592248B true CN110592248B (zh) | 2020-12-29 |
Family
ID=68850420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911020692.5A Active CN110592248B (zh) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | 一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110592248B (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003164282A (ja) * | 2001-11-29 | 2003-06-10 | Rakan:Kk | 微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット |
| CN104611411A (zh) * | 2014-10-11 | 2015-05-13 | 浙江大学 | 产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选法 |
| CN106420840A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-02-22 | 青岛东海药业有限公司 | 酪酸梭菌在制备预防或治疗抑郁症制剂中的应用 |
-
2019
- 2019-10-25 CN CN201911020692.5A patent/CN110592248B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110592248A (zh) | 2019-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McAllister et al. | Silage review: using molecular approaches to define the microbial ecology of silage | |
| Liu et al. | Prevalence and diversity of lactic acid bacteria in Chinese traditional sourdough revealed by culture dependent and pyrosequencing approaches | |
| CN102127592B (zh) | 快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的pcr方法及试剂盒 | |
| CN109971822B (zh) | 一种菌群绝对定量方法及在中国白酒发酵过程中的应用 | |
| Valdes la Hens et al. | Prevalence of L actobacillus plantarum and O enococcus oeni during spontaneous malolactic fermentation in P atagonian red wines revealed by polymerase chain reaction‐denaturing gradient gel electrophoresis with two targeted genes | |
| CN109593868B (zh) | 一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法 | |
| Vegas et al. | Evaluation of representativity of the acetic acid bacteria species identified by culture-dependent method during a traditional wine vinegar production | |
| Franquès et al. | Presence of Oenococcus oeni and other lactic acid bacteria in grapes and wines from Priorat (Catalonia, Spain) | |
| CN111286550A (zh) | 一种用于扩增副干酪乳杆菌的特异性引物及其应用 | |
| CN107937581B (zh) | 用于乳酸菌测序的扩增引物对、乳酸菌种属鉴定方法及应用 | |
| CN112143820B (zh) | 用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法 | |
| Khelaifia et al. | Noncontiguous finished genome sequence and description of Virgibacillus massiliensis sp. nov., a moderately halophilic bacterium isolated from human gut | |
| CN109825617B (zh) | 一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用 | |
| CN110592248B (zh) | 一种高效鉴定/筛选丁酸梭状芽孢杆菌的方法及其应用 | |
| Rettenmaier et al. | Comparison of sampling techniques and different media for the enrichment and isolation of cellulolytic organisms from biogas fermenters | |
| Nurliana et al. | Identification of cellulolytic lactic acid bacteria from the intestines of laying hens given AKBISprob based on 16S ribosomal ribonucleic acid gene analysis | |
| Asano et al. | Application of multiplex PCR to the detection of beer-spoilage bacteria | |
| CN116121415A (zh) | 一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量pcr试剂盒、应用及检测方法 | |
| CN102329858A (zh) | 甘蔗黑穗病菌巢式pcr快速检测方法 | |
| CN102936621B (zh) | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| CN110283926B (zh) | 一种玉米秸秆生物饲料发酵过程中菌群变化的检测方法及其应用 | |
| CN112899382A (zh) | 一种鉴定拟无枝酸菌的检测方法 | |
| KR101695059B1 (ko) | 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법 | |
| JPH1118780A (ja) | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた判定法 | |
| CN112176080A (zh) | 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No. 1800 road 214000 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province Applicant after: Jiangnan University Address before: 214000 Zhang Yong, 1800 Lihu Avenue, Binhu District, Wuxi City, Jiangsu Province Applicant before: Jiangnan University |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |