CN109825617B - 一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。与传统的基于MRS平板筛选以及16S rRNA比对的方法相比，本发明的方法基于卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物，这使得本发明的方法仅需通过一次PCR扩增、一次琼脂糖凝胶电泳检测，无需测序，即可鉴定出菌株是否为卷曲乳杆菌，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果；利用本发明的方法进行卷曲乳杆菌的筛选以及鉴定，准确性较高，在发明涉及的卷曲乳杆菌样本内，准确率为100％。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)是Brygoo和Aladame于1953年发现的一类革兰氏阳性菌，属于乳杆菌科乳杆菌属，主要分离自人体肠道、生殖道、鸡嗉囊和盲肠，是我国食品目录可用菌株。大量国内外研究表明，卷曲乳杆菌具有调节免疫、改善过敏、抗肿瘤等益生功能。此外，卷曲乳杆菌作为女性生殖道内主要优势菌株，可通过产生抗菌物质，竞争粘附及调节免疫等作用，抑制生殖道病原菌的生长，对于维持女性生殖道健康具有重要意义。
因此，筛选大量不同来源的卷曲乳杆菌，构建卷曲乳杆菌资源库，对于挖掘我国益生菌的资源、选择具有优良益生特性的卷曲乳杆菌用于治疗和预防女性生殖道疾病意义重大。
传统的基于天然生长环境的卷曲乳杆菌的筛选方法主要是先将人体粪便、女性生殖道拭子、鸡粪等以一定比例梯度稀释后，涂布于MRS平板筛选，然后将得到的菌株通过生理生化特性及16S rRNA测序进行鉴定。
但是，由于MRS平板的选择性较差，往往一个样品需要挑取大量的菌株才有可能得到1～2株目的菌，这使得传统的基于天然生长环境的卷曲乳杆菌的筛选方法操作繁琐且成本较高，盲目性高且容易漏筛，不适于卷曲乳杆菌资源库的快速建立。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种准确性和效率更高的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段，所述DNA片段为卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段和/或可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物；所述卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示；
或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:5所示；
或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，先提取需筛选或鉴定样本的基因组DNA，然后将提取得到的基因组DNA用上述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，最后将扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌；
或者，先将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落，再挑取单菌落进行培养，得到菌液，接着将得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板，然后将得到的扩增模板用权利要求1-3任一所述的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，得到扩增片段，最后将得到的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示；
或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:5所示；
或者，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7所示。
在本发明的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述特异性扩增条带的大小为764bp。
本发明还提供了一种可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物。
在本发明的一种实施方式中，所述可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了上述可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的DNA片段或上述一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法或上述一种可用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的试剂盒在筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌方面的应用。
[有益效果]
(1)与传统的基于MRS平板筛选以及16S rRNA比对的方法相比，本发明的方法基于卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物，这使得本发明的方法仅需通过一次PCR扩增、一次琼脂糖凝胶电泳检测，无需测序，即可鉴定出菌株是否为卷曲乳杆菌，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果；
(2)利用本发明的方法进行卷曲乳杆菌的筛选以及鉴定，准确性较高，在发明涉及的卷曲乳杆菌样本内，准确率为100％。
附图说明
图1：53株已知卷曲乳杆菌MCL聚类结果的韦恩图。
图2：卷曲乳杆菌标准菌株ST1的675个同源基因的蛋白序列与已知39株乳杆菌属其他乳杆菌的蛋白序列的MCL聚类结果的韦恩图。
图3：实施例3中方法A的分离自粪便和生殖道样品中的20株卷曲乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为阴性对照，2～21为卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)。
图4：实施例4中方法A的分离自粪便和生殖道样品中的22株乳杆菌属其他乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)，2为阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginal)，3为弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)，4为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，5为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，6为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，7为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，8为食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)，9为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，10为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，11为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，12为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，13为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，14为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，15为鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)，16为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，17为能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)，18为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，19为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，20为瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)，21为口乳杆菌(Lactobacillus oris)，22为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，23为阴性对照。
图5：实施例3中方法B的分离自粪便和生殖道样品中的20株卷曲乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为阴性对照，2～21为卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)。
图6：实施例4中方法B的分离自粪便和生殖道样品中的22株乳杆菌属其他乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)，2为阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginal)，3为弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)，4为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，5为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，6为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，7为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，8为食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)，9为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，10为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，11为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，12为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，13为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，14为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，15为鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)，16为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，17为能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)，18为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，19为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，20为瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)，21为口乳杆菌(Lactobacillus oris)，22为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，23为阴性对照。
图7：实施例3中方法C的分离自粪便和生殖道样品中的20株卷曲乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为阴性对照，2～21为卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)。
图8：实施例4中方法C的分离自粪便和生殖道样品中的22株乳杆菌属其他乳杆菌PCR扩增产物的电泳检测图；其中，M为分子量标准，1为詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)，2为阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginal)，3为弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)，4为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，5为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，6为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，7为唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，8为食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)，9为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，10为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，11为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，12为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，13为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，14为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，15为鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)，16为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，17为能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)，18为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，19为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，20为瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)，21为口乳杆菌(Lactobacillus oris)，22为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，23为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：牛肉膏10.0g、蛋白陈10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、无水乙酸钠2.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4·H2O 0.25g、柠檬酸氢二胺2g、K2HPO4·3H2O 2.6g、吐温801mL，蒸馏水定容至1000mL，pH值为6.2～6.4，115℃高压灭菌20min后备用。
实施例1：卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的获取
具体步骤如下：
(1)从数据库NCBI(National Center for Biotechnology Information)下载53株已知卷曲乳杆菌的全部蛋白编码序列(具体见表1)；
(2)利用生物信息学手段，通过编写脚本，按照一定相似度进行聚类分析，得到53株已知卷曲乳杆菌MCL聚类结果的韦恩图(具体见图1)，如图1所示，53株已知卷曲乳杆菌共有675个同源基因；
(3)提取标准菌株Lactobacillus crispatus ST1的675个同源基因的蛋白编码序列，从数据库NCBI(National Center for Biotechnology Information)下载除卷曲乳杆菌之外的39株乳杆菌属其他乳杆菌种的蛋白编码序列；
(4)利用生物信息学手段，通过编写脚本，按照一定相似度进行聚类分析，得到标准菌株Lactobacillus crispatus ST1的675个同源基因的蛋白序列与其他39株乳杆菌MCL聚类结果的韦恩图(具体见图2)，如图2所示，相比于其他39种乳杆菌，卷曲乳杆菌共有3个特异性基因，分别命名为特异性基因A、特异性基因B、特异性基因C，这三个特异性基因的NCBI登录号分别为CBL51439.1(长度为459bp)、CBL50253.1(长度为276bp)和CBL49471.1(长度为1068bp、SEQ ID NO:1)，选取其中序列长度合适的基因CBL49471.1作为卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段，在NCBI上下载此特异性基因的核苷酸序列作为可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段；
(5)将下载得到的核苷酸序列用MEGA6.0进行比对分析，根据序列比对结果选取序列的保守区利用软件Oligo设计引物，获得可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物；
引物A的序列如下：
上游引物(F)：5’-TTTGATACTAAGGCTAACGAG-3’(SEQ ID NO:4)；
下游引物(F)：5’-ATACGCTGAGCATAACACC-3’(SEQ ID NO:5)；
引物B的序列如下：
上游引物(F)：5’-CAAAACGAAACAACGCCTA-3’(SEQ ID NO:6)；
下游引物(F)：5’-GATTTTACCTCGTTAGCCTT-3’(SEQ ID NO:7)；
引物C的序列如下：
上游引物(F)：5’-ATTGATCGGAAGCGCAGTCT-3’(SEQ ID NO:2)；
下游引物(F)：5’-CAGTTGGAGTGCGTGAAAGG-3’(SEQ ID NO:3)。
表1 NCBI 53株已知卷曲乳杆菌的信息
实施例2：一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法的构建
方法A：根据实施例1获得的卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段(SEQ ID NO:1)以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物A(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)构建筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，具体步骤如下：
(1)提取需筛选或鉴定样品的基因组DNA，将获得的基因组DNA用可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增；
(2)将步骤(1)获得的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳检测，在200～300bp处产生特异性扩增条带的菌株即为卷曲乳杆菌；
或者，具体步骤如下：
(1)将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落；
(2)挑取步骤(1)得到的单菌落进行培养，得到菌液；
(3)将步骤(2)得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板；
(4)将步骤(3)得到的扩增模板用可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，得到扩增片段；
(5)将步骤(4)得到的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在200～300bp处产生特异性扩增条带的菌株即为卷曲乳杆菌。
方法B：根据实施例1获得的卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段(SEQ ID NO:1)以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物B(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)构建筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，具体步骤如下：
(1)提取需筛选或鉴定样品的基因组DNA，将获得的基因组DNA用可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增；
(2)将步骤(1)获得的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳检测，在700～800bp处产生特异性扩增条带的菌株即为卷曲乳杆菌；
或者，具体步骤如下：
(1)将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落；
(2)挑取步骤(1)得到的单菌落进行培养，得到菌液；
(3)将步骤(2)得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板；
(4)将步骤(3)得到的扩增模板用可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，得到扩增片段；
(5)将步骤(4)得到的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在700～800bp处产生特异性扩增条带的菌株即为卷曲乳杆菌。
方法C：根据实施例1获得的卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段(SEQ ID NO:1)以及可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物C(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)构建筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，具体步骤如下：
(1)提取需筛选或鉴定样品的基因组DNA，将获得的基因组DNA用可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增；
(2)将步骤(1)获得的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳检测，在700～800bp处产生特异性扩增条带的菌株即为卷曲乳杆菌；
或者，具体步骤如下：
(1)将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落；
(2)挑取步骤(1)得到的单菌落进行培养，得到菌液；
(3)将步骤(2)得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板；
(4)将步骤(3)得到的扩增模板用可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物进行扩增，得到扩增片段；
(5)将步骤(4)得到的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在700～800bp处产生特异性扩增条带的菌株即为卷曲乳杆菌。
实施例3：一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法的验证
具体步骤如下：
方法A：
(1)随机选取20株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的卷曲乳杆菌，挑取单菌落于5mL的含有MRS液体培养基的试管中，于37℃厌氧培养24h，得到菌液；
(2)取1mL菌液于1.5mL离心管中以8000r/min的转速离心3min，弃上清，用无菌水洗涤两次，最后弃上清，加入200μL无菌水，制成PCR模板，以无菌水作为阴性对照；
(3)将获得的PCR模板用实施例1获得的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)进行扩增；
其中，PCR反应体系见表2；PCR反应条件为：95℃预变性5min后，完成如下34个循环：95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸10min；
(4)扩增反应结束后，将扩增得到的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，在200～300bp有条带的即为卷曲乳杆菌，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，随机选取的20株卷曲乳杆菌中只有16株可以扩增出目的条带。
可见，实施例2的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法A准确性较低。
方法B：
(1)选取与方法A同样的20株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16SrRNA鉴定的卷曲乳杆菌，挑取单菌落于5mL的含有MRS液体培养基的试管中，于37℃厌氧培养24h，得到菌液；
(2)取1mL菌液于1.5mL离心管中以8000r/min的转速离心3min，弃上清，用无菌水洗涤两次，最后弃上清，加入200μL无菌水，制成PCR模板，以无菌水作为阴性对照；
(3)将获得的PCR模板用实施例1获得的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)进行扩增；
其中，PCR反应体系见表2；PCR反应条件为：95℃预变性5min后，完成如下34个循环：95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸10min；
(4)扩增反应结束后，将扩增得到的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，在700～800bp有条带的即为卷曲乳杆菌，琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，选取的20株卷曲乳杆菌中只有10株可以扩增出目的条带。
可见，实施例2的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法B准确性较低。
方法C：
(1)选取与方法A同样的20株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16SrRNA鉴定的卷曲乳杆菌，挑取单菌落于5mL的含有MRS液体培养基的试管中，于37℃厌氧培养24h，得到菌液；
(2)取1mL菌液于1.5mL离心管中以8000r/min的转速离心3min，弃上清，用无菌水洗涤两次，最后弃上清，加入200μL无菌水，制成PCR模板，以无菌水作为阴性对照；
(3)将获得的PCR模板用实施例1获得的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)进行扩增；
其中，PCR反应体系见表2；PCR反应条件为：95℃预变性5min后，完成如下34个循环：95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s；最后72℃延伸10min；
(4)扩增反应结束后，将扩增得到的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，在700～800bp有条带的即为卷曲乳杆菌，琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示，选取的20株卷曲乳杆菌均能扩增出条带。
可见，实施例2的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法C准确性较高，在步骤(1)选取的20株卷曲乳杆菌的样本内，准确性为100％，应选择方法C。
表2 PCR反应体系
| 试剂 | 25μL反应体系 | 终浓度 |
| 2*TaqPlus MasterMix(Dye) | 12.5μL | 1* |
| Forward Primer,20μM | 0.5μL | 0.4μM |
| Reverse Primer,20μM | 0.5μL | 0.4μM |
| Template DNA | 1μL | <0.5μg/50μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.5μL |
实施例4：一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法的验证
具体步骤如下：
方法A：
实施例4为在实施例3的基础上将随机选取的20株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的卷曲乳杆菌替换为随机选取的22株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的乳杆菌属其他乳杆菌，这22株乳杆菌属其他乳杆菌分别为詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、阴道乳杆菌(Lactobacillusvaginal)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)以及粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。
将这22株乳杆菌属其他乳杆菌用实施例1获得的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的引物序列(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5)进行扩增后，将扩增得到的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，随机选取的22株乳杆菌属其他乳杆菌均未能扩增出条带，但由于一些非特异性结合，产生了杂带。
方法B：
实施例4为在实施例3的基础上将选取的20株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的卷曲乳杆菌替换为与方法A同样的22株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的乳杆菌属其他乳杆菌，这22株乳杆菌属其他乳杆菌分别为詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、阴道乳杆菌(Lactobacillusvaginal)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)以及粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。
将这22株乳杆菌属其他乳杆菌用实施例1获得的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的引物序列(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7)进行扩增后，将扩增得到的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，随机选取的22株乳杆菌属其他乳杆菌均未能扩增出条带。
方法C：
实施例4为在实施例3的基础上将选取的20株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的卷曲乳杆菌替换为与方法A同样的22株从不同的粪便和生殖道样品中分离出的已进行过16S rRNA鉴定的乳杆菌属其他乳杆菌，这22株乳杆菌属其他乳杆菌分别为詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、阴道乳杆菌(Lactobacillusvaginal)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、能动乳杆菌(Lactobacillus agilis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)以及粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)。
将这22株乳杆菌属其他乳杆菌用实施例1获得的可用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的引物序列(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)进行扩增后，将扩增得到的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图8所示，随机选取的22株乳杆菌属其他乳杆菌均未能扩增出条带。
综合实施例3～4，实施例2的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法C准确性最高，且在琼脂糖凝胶电泳过程中不产生杂带，应选择方法C。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法及其应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaaaagt tattgatcgg aagcgcagtc ttagctgcct tattaattaa agaaaatatc 60
gcagtaaatg cggcaataga gcaaaacgaa acaacgccta ggattgcagt tactgacaaa 120
aaagagaagc caaaagacca gtttgataat agtttggcag gtcattatga ccaagagaca 180
aattttatta cctgggaaat aaggctgaat cccaagaaag aaaaatatac tggtgatttg 240
aagttggaaa atttaattcc agaaggctta gttctagatc cagatacgat tgaagtaatt 300
aagaatgata attttattca aaattctagt ttagttaaat tgaagaaaaa caaattaaca 360
gctgaatttc ctgctaagaa gtattcagag agcacaattt tgattaagta tcgaaccaag 420
gtggaagcag agcctaatga gcctaattat cttcgggtga gtcagtcctt tactttgggc 480
gatgatcgag ttcaagaata cgagcaagaa attaaatacg atcgaagtaa taagaatttt 540
aacattgaag cgccacataa atctacgttt agagatgata atcaaatttc gttaattaaa 600
aaatctaaaa ataatgaaga acgctctgaa gattggctta aacgtctagc agagctgatt 660
attaataaaa aagaaactac ttcagataaa ggaggtgaaa aagttcaagg acaggtcaaa 720
gatcaaaagc agcaagtttc cccagaaaat acaaaccttt cacgcactcc aactgtcaaa 780
ggcttgactg gttttgatac taaggctaac gaggtaaaat ccacggctaa aatagattct 840
gattcagtaa aaactactct agataaagac gagattaagg acaatgcaag tactatctcg 900
cctaagtcgc aaaaacacga tactcatgtc acactcccta aaagtgacac atcagaaact 960
aaggcaaaat tacctaaagc tggtgaaact gccggtgtta tgctcagcgt attaggcata 1020
attttaataa ttgcagggtg gacagttcga acaaaattct taaaataa 1068
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attgatcgga agcgcagtct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagttggagt gcgtgaaagg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttgatacta aggctaacga g 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atacgctgag cataacacc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caaaacgaaa caacgccta 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gattttacct cgttagcctt 20
Claims (5)
1.用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的引物，其特征在于，是用于扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ IDNO:3所示。
2.一种不以疾病的诊断为目的的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，其特征在于，先提取需筛选或鉴定样本的基因组DNA，然后将提取得到的基因组DNA用核苷酸序列如SEQ IDNO:2以及SEQ ID NO:3所示的特异性引物进行扩增，最后将扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌；
或者，先将需筛选或鉴定样本进行分离培养，得到单菌落，再挑取单菌落进行培养，得到菌液，接着将得到的菌液离心后用无菌水重悬，得到扩增模板，然后将得到的扩增模板用核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示的特异性引物进行扩增，得到扩增片段，最后将得到的扩增片段回收后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产生特异性扩增条带，则表明待筛选的样品中含有卷曲乳杆菌或待鉴定的菌株为卷曲乳杆菌。
3.如权利要求2所述的一种不以疾病的诊断为目的的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的方法，其特征在于，所述卷曲乳杆菌的基因组的核心DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种用于筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物，所述扩增卷曲乳杆菌基因组的核心DNA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3所示。
5.权利要求4所述的试剂盒在不以疾病的诊断为目的的筛选和/或鉴定卷曲乳杆菌方面的应用。
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