CN110804665A - 在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的引物及方法。本发明引物为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的引物对。本发明方法包括:用所述引物对对待测乳酸杆菌的基因组DNA进行PCR扩增,得到PCR产物;然后对所述PCR产物进行高通量测序,根据测序结果在种水平上确定所述待测乳酸杆菌。本发明提供的引物、试剂盒及方法能够在短时间内快速,准确地在种水平上鉴定环境样本中(包括益生菌产品以及人粪便样本等)的乳酸杆菌,相比于META更加节省成本,更加便捷。本发明应用前景广阔,为市场上相关乳酸菌产品的监管提供了新的思路,也为鉴定肠道样本或其他样本中具体的乳酸杆菌菌种提供了新的方法。

Description

在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的引物及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的引物及方法。
背景技术
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)广泛存在于自然界和人体消化系统中,除极少数外,绝大部分是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群。包括乳酸杆菌属,链球菌属,乳球菌属,肠球菌属,明串珠菌属,双歧杆菌属,魏斯氏菌属等。乳酸杆菌属是乳酸菌中最大的属,具有维持肠道菌群的微生态平衡,提高机体免疫力等功能。
随着生活水平的不断提高,人们已经不再满足于温饱的生活,健康的高质量的生活已经成为人民生活的目标。因此普通的膳食以外,有益生作用的膳食辅助产品的消费量越来越高。乳酸杆菌的产品是人民大众的生活最常见的保健食品,从酸奶、活菌饮料到乳酸菌的膳食辅助产品,已经被大众所认可并成为常规的消费产品,被称为“国民食品”。但随之而来的是乳酸菌使用的乱象,一些益生菌产品生产厂家在产品中添加与标识不符的乳酸菌菌种,有些可能用类似的乳酸菌代替获批的乳酸菌,有些可能添加的比例与标识不符。这些现象都严重损害了消费者的合法权益,但如何能快速、准确地检测益生菌产品,现在还没有一个有效的方法。
传统的乳酸菌鉴定是以伯杰氏手册中细菌的表型特征的相似性为基础,对于一些表型很近,理化性质一致的细菌很难区分。随着分子生物学的发展,细菌的16S rDNA基因的全长序列已经成为菌种鉴定的金标准,可以准确地鉴定分离出来的单一菌种。16S rDNA全长1.4Kb左右,包括10个高变区和11个恒定区,通过扩增16S rDNA的不同高变区,结合高通量测序的方法广泛地应用于环境菌群的检测,但是由于它的序列比较保守,片段过短,所得结果只能在属水平上区分细菌,对于亲缘性较近的菌种分辨率不高。如果要鉴定环境中的细菌菌种,就需要将16S rDNA的全长PCR产物克隆到质粒载体上再测序,该方法需要耗费大量的人力、物力。
发明内容
为了有效地解决上述问题,本发明的一个目的是提供一对用于在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的高通量测序引物及方法。
第一方面,本发明要求保护一对在种水平上鉴定乳酸杆菌的引物对。
本发明所提供的引物对由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成;
其中,所述引物对的上下游引物既可以分别单独包装,也可以均按照摩尔比为1:1的比例混合包装。
第二方面,本发明要求保护一种在种水平上鉴定乳酸杆菌的PCR试剂
本发明提供的PCR试剂包括所述引物对。
进一步地,所述PCR试剂中,组成所述引物对的上游引物和下游引物的摩尔比可为1:1。
更进一步地,所述PCR试剂中,组成所述引物对的上游引物和下游引物的浓度均可为0.2μM;
第三方面,本发明要求保护一种在种水平上鉴定乳酸杆菌的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒,含有前文所述的引物对或所述的PCR试剂。
第四方面,本发明要求保护前文所述的引物对或所述的PCR试剂或所述的试剂盒在如下中的应用:在种水平上鉴定乳酸杆菌。
第五方面,本发明要求保护一种在种水平上鉴定乳酸杆菌的方法。
本发明所提供的在种水平上鉴定乳酸杆菌的方法,可包括如下步骤:
(a1)用前文所述引物对对待测乳酸杆菌的基因组DNA进行PCR扩增,得到PCR产物;
(a2)对所述PCR产物进行高通量测序,根据测序结果在种水平上确定所述待测乳酸杆菌。
进一步地,步骤(a1)中,所述PCR扩增的退火温度可为56℃。更进一步地,所述PCR扩增的反应程序为:95℃预变性2min,95℃30s,56℃30s,72℃30s,40个循环;最后72℃延伸5min,反应结束。
进一步地,步骤(a2)中,对所述PCR产物进行高通量测序可为:利用IlluminaHiSeq2500测序平台对所述PCR产物进行双端250bp测序。
更进一步地,步骤(a2)中,可按照包括如下步骤的方法根据所述测序结果在种水平上确定所述待测乳酸杆菌:将对所述PCR产物进行所述高通量测序所得的测序结果与含有不同乳酸杆菌菌种的gyr B基因序列数据库(如NCBI数据库,或者从NCBI数据库中提取相关gyr B数据信息后得到的数据库)进行比对,同一性达到90%以上确定为同一菌种。
在本发明的具体实施方式中,具体是按照包括如下步骤的方法根据所述测序结果在种水平上确定所述待测乳酸杆菌的:将对所述PCR产物进行所述高通量测序(利用Illumina HiSeq 2500测序平台对所述PCR产物进行双端250bp测序)所得的测序结果序列文本以fasta格式保存至本地服务器,并通过本地的blast比对软件进行blast比对,并对参数进行修改。指定blast搜索用的数据库为基于NCBI的公开基因组数据,从中提取相关gyrB数据信息后得到的数据库,输出格式为表格形式。使用perl脚本对blast比对结果进行筛选统计。将同一性阈值设定为90%,即设定比对结果同一性达到90%以上为同一菌种;长度阈值设定为250bp。随后筛选出同一性大于90%,长度大于250bp的菌种。
在所述方法中,所述乳酸杆菌来源可为人体粪便,也可为市售益生菌菌剂等。
在上述第一至五方面中,所述乳酸杆菌具体可为鼠李糖乳杆菌、干酪/副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、粘膜乳杆菌、唾液乳杆菌等。
本发明提供了一种高效,快速,准确地在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的方法。通过本发明提供的方法,可以对目前市面上的乳酸菌产品,人肠道中益生菌的种类进行鉴定,应用范围广且限制少。不仅能够有效地监管乳酸菌市场的乱象,使消费者买到真正有效的产品,而且通过对人肠道乳酸菌种类的鉴定,能够及时补充所需要的乳酸菌种。
附图说明
图1为乳酸菌单菌gyrB基因PCR扩增结果的电泳检测图谱,M:100bp的Marker;1-15为样本编号。
图2为编号为5的乳酸杆菌单菌的特异性PCR扩增产物的一代测序图谱。
图3为人粪便gyrB基因PCR扩增结果的电泳检测图谱,M:100bp的Marker;1’-8’为样本编号。
图4为益生菌产品gyrB基因PCR扩增结果的电泳检测图谱,M:100bp的Marker;1’-9’为样本编号。
图5为益生菌产品特异性引物PCR扩增的Illumina测序结果,C1-C9为样本编号。图例中从上到下,乳酸杆菌的中文名称为:Lac.helveticus瑞士乳杆菌;Lac.plantarum植物乳杆菌;Lac.paracasei副干酪乳杆菌;Lac.fermentum发酵乳杆菌;Lac.rhamnosus鼠李糖乳杆菌;Lac.acidophicus嗜酸乳杆菌;Lac.delbrueckii德氏乳杆菌;Lac.reuteri罗伊氏乳杆菌;Lac.salivarius唾液乳杆菌。
图6为益生菌产品META分析的结果,C1-C9为样本编号。图例中从上到下,乳酸杆菌的中文名称为:Lac.zeae玉米乳杆菌;Lac.delbrueckii德氏乳杆菌;Lac.acidophicus嗜酸乳杆菌;Lac.rhamnosus鼠李糖乳杆菌;Lac.fermentum发酵乳杆菌;Lac.casei_paracasei干酪/副干酪乳杆菌;Lac.plantarum植物乳杆菌;Lac.helveticus瑞士乳杆菌。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、乳酸杆菌菌种鉴定专用引物及方法
一、乳酸杆菌菌种鉴定专用引物的设计与合成
根据gyrB基因设计不同乳酸杆菌菌种的gyrB基因通用引物,参照了4种标准菌株(Lactobacillus fermentum发酵乳杆菌,Lactobacillus mucosae粘膜乳杆菌,Lactobacillus ruminis瘤胃乳杆菌,Lactobacillus salivarius唾液乳杆菌),均为已被获批添加到相关益生菌产品中的乳酸杆菌菌种。应用pal2nal软件进行引物设计,选取序列保守性较高,GC含量均匀的序列作为设计的特异性细菌种属甄别的引物序列。最后结合测序以及序列比对技术,可以在核酸水平上实现对乳酸杆菌菌种的分类鉴定。
乳酸杆菌的gyrB基因通用引物组成如下:
上游引物F:5’-ytr atc atc atg acy gat g-3’(SEQ ID No.1);
下游引物R:5’-gtt crg crt cca ttt cvc c-3’(SEQ ID No.2)。
人工合成上述各条引物。引物中的r表示a或g;v表示a或g或c;y表示t或c。
二、乳酸杆菌菌种鉴定专用引物的实验验证
提取分离的乳酸杆菌单菌(共15个样本)的基因组DNA,作为PCR模板进行引物验证。其中,菌株1、3、4、8、9、11为鼠李糖乳杆菌;菌株2、5、10为副干酪乳杆菌;7、12、13、14为发酵乳杆菌;6为屎肠球乳杆菌;15为瑞士乳杆菌。
1、乳酸杆菌单菌基因组DNA的提取
挑取在MRS培养平板上的乳杆菌单菌,接种至液体培养基中37℃静置过夜培养,用于提取DNA。由于乳杆菌的细胞壁比较厚,本发明对天根公司的单菌基因组DNA提取试剂盒做了改良,使其更有效地提取DNA。改良如下:离心收集菌体之后,弃掉上清液,在菌体沉淀中加入TE,离心管中放入与菌体等量的0.5mm玻璃珠,在Bead-beater中破碎2min;加入溶菌酶,使其终浓度为25mg/mL,充分与菌体沉淀混匀,37℃孵育半小时以上,裂解细胞壁;加大蛋白酶K的用量以充分分解杂质蛋白。提取出的DNA要用nanodrop测浓度以及260/280值。
2、gyr B基因PCR扩增
用合成的特异引物分别扩增乳酸菌单菌DNA来验证引物。
PCR反应体系为25μL,其中KAPA HiFi GC Buffer(5X)5μL,KAPA HiFi HotStartDNA Polymerase用0.5μL,KAPA dNTP Mix用0.5μL(均为美国KAPA Biosystems公司产品),上下游引物各用0.5μL(上下游引物在PCR反应体系中的终浓度为0.2μM),DNA加量为2μL,灭菌水16μL。
PCR反应条件为:95℃预变性2min,95℃30s,56℃30s,72℃30s,40个循环;最后72℃延伸5min,反应结束。
3、扩增产物的测序和比对
扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,条件为100V,40min,得到约250bp的扩增产物。15个样本的PCR产物电泳结果见图1,将PCR产物用ampure磁珠纯化之后做一代测序;图2所示为样本5的测序图谱,测序结果在NCBI中进行blast比对。结果显示:15个样本的比对结果与实际菌种信息符合,序列同一性均达到95%以上。这说明设计的专一性引物能够用于乳酸杆菌种水平上的鉴定。
实施例2、环境样本中乳酸杆菌菌种的鉴定
检测的环境样本包括:市场售卖的益生菌产品、人粪便样本。
1、基因组DNA的提取
益生菌产品(表1)来源于相关产品公司,共9个样本,编号为C1-C9,用天根公司的粪便基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA;粪便样本来源于北大妇产医院,用天根公司的粪便基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
表1 益生菌产品标注的乳酸杆菌成分
2、gyr B基因PCR扩增
分别以粪便样本以及益生菌产品的基因组DNA作为扩增模板,用实施例1中的PCR扩增的方法进行扩增,得到不同样本的PCR扩增产物。PCR产物纯化之后,加Barcode,进行高通量测序,进一步分析结果。
3、扩增产物的测序和比对
将上述步骤2获得的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,人粪便样本PCR扩增产物电泳图如图3所示,益生菌产品样本PCR扩增产物电泳图如图4所示。可以看出,实施例1设计合成的专一性引物能够扩增粪便样本以及益生菌产品中的乳酸杆菌,目的片段在350bp(由于这里用了文库制备的长引物,扩增片段长度变长,片段大小在300-400bp)左右。将不同样本对应的350bp的扩增产物回收,纯化,定量合格之后进行高通量测序。本方法采用的是Illumina HiSeq2500测序平台进行的双端250bp测序。益生菌产品测序结果经过去冗余和序列比对后的结果整理如图5,相应的META测序结果见图6。粪便样本的PCR扩增产物经过高通量测序及测序结果比对(将利用Illumina HiSeq 2500测序平台对所述PCR产物进行双端250bp测序所得的测序结果序列文本以fasta格式保存至本地服务器,并通过本地的blast比对软件进行blast比对,并对参数进行修改。指定blast搜索用的数据库为基于NCBI的公开基因组数据,从中提取相关gyr B数据信息后得到的数据库,输出格式为表格形式。使用perl脚本对blast比对结果进行筛选统计。将同一性阈值设定为90%,即设定比对结果同一性达到90%以上为同一菌种;长度阈值设定为250bp。随后筛选出同一性大于90%,长度大于250bp的菌种)后所得结果整理如表2所示。
结果表明:通过图5与图6的对比,发现Illumina测序的结果与META的结果基本符合,丰度也基本一致,能准确地鉴定到菌种水平上。在益生菌样本C1和C9中,META的结果与引物特异性扩增结果一致,而与样本标注信息有所差别,这时考虑样本信息错误。样本相较于META,所设计的两对引物只针对乳杆菌,特异性强,且扩增后得到的测序结果准确性高,成本以更低,应用范围广,不失为一种更好的在种水平上鉴定乳酸菌杆菌的新方法。
表2 人粪便样本的PCR扩增产物测序结果
Figure BDA0001755153400000061
实验结果表明,本发明所建立的PCR方法能够快速,准确地在种水平上鉴定乳酸杆菌,而且适用范围广,可以应用于肠道中和益生菌产品中的乳酸杆菌菌种检测,具有很好的应用前景。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 在种水平上鉴定环境样本中乳酸菌的引物及方法
<130> GNCLN181235
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> y为t或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> r为a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> y为t或c
<400> 1
ytratcatca tgacygatg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> r为a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> r为a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> v为a或g或c
<400> 2
gttcrgcrtc catttcvcc 19

Claims (10)

1.在种水平上鉴定乳酸杆菌的引物对,由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成。
2.在种水平上鉴定乳酸杆菌的PCR试剂,含有权利要求1中所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂,其特征在于:所述PCR试剂中,组成所述引物对的上游引物和下游引物的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂,其特征在于:所述PCR试剂中,组成所述引物对的上游引物和下游引物的浓度均为0.2μM。
5.在种水平上鉴定乳酸杆菌的试剂盒,含有权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂。
6.权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在如下中的应用:在种水平上鉴定乳酸杆菌。
7.一种在种水平上鉴定乳酸杆菌的方法,包括如下步骤:
(a1)用权利要求1所述引物对对待测乳酸杆菌的基因组DNA进行PCR扩增,得到PCR产物;
(a2)对所述PCR产物进行高通量测序,根据测序结果在种水平上确定所述待测乳酸杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:步骤(a1)中,所述PCR扩增的的退火温度为56℃。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:步骤(a2)中,对所述PCR产物进行高通量测序为:利用IlluminaHiSeq2500测序平台对所述PCR产物进行双端250bp测序;和/或
步骤(a2)中,是按照包括如下步骤的方法根据所述测序结果在种水平上确定所述待测乳酸杆菌的:将对所述PCR产物进行所述高通量测序所得的测序结果与含有不同乳酸杆菌菌种的gyrB基因序列数据库进行比对,同一性达到90%以上确定为同一菌种。
10.根据权利要求1-9中任一所述的引物对或PCR试剂或试剂盒或应用或方法,其特征在于:所述乳酸杆菌为鼠李糖乳杆菌、干酪/副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、粘膜乳杆菌或唾液乳杆菌。
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