CN103667509A - 检测食品中乳酸菌的方法及检测用引物 - Google Patents

检测食品中乳酸菌的方法及检测用引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测食品中乳酸菌的方法，其包括，(1)提取食品中细菌基因组DNA；(2)进行PCR扩增，其中所使用的引物对是兼并引物对；(3)对PCR扩增的产物进行电泳检测，如检测到唯一PCR扩增条带，则检测结果为阳性，否则检测结果为阴性；如检测结果为阳性则不需要进行步骤(4)，如检测结果为阴性则需要进行步骤(4)；(4)任选对PCR扩增的产物进行测序。本发明还提供了其中所用的引物等。本发明方法，直接可对各厂家的含一种或多种乳酸菌的制品进行检测，检测结果可以有效排除假阳性，从而便于推广实施，而对于检测阴性的制品，再配合测序，可以确保检测结果的正确性。

Description

检测食品中乳酸菌的方法及检测用引物
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体而言，本发明涉及食用乳酸菌检测的方法以及其中所使用的引物对等。
背景技术
乳酸菌是一群形态、代谢性能和生理学特征不完全相同的革兰氏阳性菌。由于具有许多有益的代谢特征，被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上划分为23个属，常用于微生态制剂的菌种有双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌、肠球菌、链球菌、明串珠菌、片球菌和地衣芽孢杆菌等。
多数乳酸菌通常被认为是安全的，因此相应的检测标准不完善，所以对乳酸菌的检测一致为人所忽视。目前市场上销售的含乳酸菌制品，仅在标签中列明菌种名称，缺乏一些具体的菌种信息，甚至部分菌种名称是厂家自行命名的，与国际标准数据库的信息无法对应，也就无法溯源，更不用提相应产品质量的稳定性。尤其是，近来的一些研究表明，部分乳酸菌也可能致病(参见刘小青，等.乳酸菌的安全性研究.中国微生态学杂志，21(10)：952-955)。因此，本发明人认为，在食品安全日益引起重视的今天，确定食品生产厂家所用乳酸菌的菌种、菌株及其所内在决定的稳定性和安全性是非常有必要的。
要保证乳酸菌及其制剂的安全性和质量，需要对其菌“株”在投产前进行生物学、遗传学特征的检测，以便核实其安全性。由于即使菌株进行保藏、培养，通常也难以分辨。而最有效的检测方法是DNA测序，但是由于含乳酸菌制品成分复杂，往往是多种乳酸菌的混合物，直接测序的干扰严重；分离菌株并培养后再测序，耗费的时间长。更为严重的是，DNA测序的成本较高，厂家和食品监督机构日常使用的成本太高，不易施行，即使制定相应方法也难以大面积实施，使得该方法形同虚设。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的检测食品中乳酸菌的方法，其能够对含一种或多种乳酸菌的制品进行检测，检测结果可以有效排除假阳性。另外，本发明还提供了该方法中所用的引物或引物对及其应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了检测食品中乳酸菌的方法，其包括，
(1)提取食品中乳酸菌基因组DNA；
(2)对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，其中所使用的引物对是兼并引物对；
(3)将步骤(2)的PCR扩增的产物进行电泳检测；如检测到唯一PCR扩增条带，则检测结果为阳性，否则检测结果为阴性；如检测结果为阳性则不需要进行步骤(4)，如检测结果为阴性则需要进行步骤(4)；
(4)任选对步骤(2)的PCR扩增的产物进行测序。
在本发明的具体实施方式中，食品是酸奶。
优选在本发明的第一方面的方法中，乳酸菌是嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热乳链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳酸菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌中的一种或多种。
在本发明中，兼并引物对指的是引物对中的正向和／或反向引物中至少有一条是兼并引物。在本发明中，兼并引物是本领域技术人员来说是熟知的，即引物的至少有一个位置上具有两种或两种以上核苷酸。在核酸合成仪顺序合成引物的过程中，通过当要合成具有两种或两种以上核苷酸的位置时，同时加入该两种或两种以上核苷酸即可。这对于本领域技术人员来说是完全能够合成的，并且有商业化的公司提供合成服务。优选在本发明的第一方面的方法中，引物对中的引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10。
更优选在本发明的第一方面的方法中，引物对中的正向引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和／或，引物对中的反向引物选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
优选地，步骤(2)中，所述PCR扩增的体系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot StartVersion试剂盒，如下：
TaKaRa Ex Taq HS(5U／μl)0.25μl
10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5μl
dNTP Mixture(各2.5mM)4μl
正向和反向引物(各20μM)各0.5μl
细菌基因组提取液中的DNA50ng
加水定容至50μl；
所述PCR扩增条件为：95℃2min预变性；95℃30s，55℃30s，72℃40s，45个循环；72℃延伸5min。
优选在本发明的第一方面的方法中，步骤(3)中，如果PCR扩增的产物经电泳检测是大小为250-300bp的唯一一条PCR扩增条带，则检测结果为阳性，不进行步骤(4)；如果出现该条带的同时也出现了其他条带，则检测结果为阴性，进行步骤(4)。
优选在本发明的第一方面的方法中，测序是illumina genome analyzer测序。Illuminagenome analyzer测序是一种基于单分子簇的边合成边测序的方法。具体而言，测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flow cell)，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。IIllumina Genome Analyzer测序技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等工作，测序通量有着若干个数量级的提高。
在第二方面，本发明提供了引物，其选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10。
另外，本发明还提供了引物对，引物对由正向引物和反向引物组成，其中引物对中的正向引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，而且其中引物对中的反向引物选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面的引物或引物对在检测食品中乳酸菌的方法中的应用。优选检测食品中乳酸菌的方法是本发明的第一方面的方法。
本发明的有益效果在于，本发明结合含乳酸菌制品中乳酸菌优势的特点，基于PCR方法建立了一套简便易行的检测识别乳酸菌的方法，直接可对各厂家的含一种或多种乳酸菌的制品进行检测，检测结果可以有效排除假阳性，从而便于推广实施，而对于检测阴性的制品，再配合测序，可以确保检测结果的正确性。应用于食品工业时，能检测含多种乳酸菌的制品，适应性好；检测速度快，绝大多数可以在2～3小时内完成检测；操作简便，成本低，绝大多数无需动用昂贵的测序工序；检测准确率高，尤其是假阳性率很低，因而便于推广应用。
以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
附图说明
图1是本发明实施例2中的PCR扩增产物的电泳检测图谱。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未尽之处，可以参考相应的PCR和基因测序的实验手册。
实施例1食品中包括乳酸菌的细菌基因组的提取
从市场可以购买的进出口酸奶样本24个，其中进口产品11种，国产或合资品牌13种，采用Tiangen细菌DNA提取试剂盒(商品编号DP302-02)分别提取24种酸奶产品中细菌的全基因组DNA。即取不同样本酸奶液1ml，以10000rpm离心1分钟，弃去上清液体，然后将沉淀参照试剂盒的厂商说明书进行提取，得细菌基因组提取液。通过测定提取液OD260／280比值，确定DNA浓度。
实施例2乳酸菌菌株的PCR检测
根据本发明人前期对各厂商的菌株安全性和测序研究，设计了如下表1所示的兼并引物对，委托上海英骏生物科技有限公司合成，分别针对实施例1记载的从各厂商酸奶中提取的细菌基因组提取液进行PCR扩增，另取大肠杆菌、阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)基因组提取液作为对照。
表1
Figure BSA0000099670770000041
Figure BSA0000099670770000051
注：表1中，W表示等摩尔量的A和T，Y表示等摩尔量的T和C，R表示等摩尔量的A和G；引物A2的序列如SEQ ID NO.1所示，引物A3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物A4的序列如SEQ ID NO.3所示，引物A5的序列如SEQ ID NO.4所示，引物S2的序列如SEQ IDNO.5所示，引物S3的序列如SEQ ID NO.6所示，引物S4的序列如SEQ ID NO.7所示，引物S5的序列如SEQ ID NO.8所示，引物S6的序列如SEQ ID NO.9所示，引物S7的序列如SEQID NO.10。
PCR扩增体系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot Start Version试剂盒(商品编号DRR006A)，如下：
TaKaRa Ex Taq HS(5U／μl)0.25μl
10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5μl
dNTP Mixture(各2.5mM)4μl
正向和反向引物(各20μM)各0.5μl
细菌基因组提取液中的DNA50ng
加水定容至50μl
PCR扩增条件为：95℃2min预变性；95℃30s，55℃30s，72℃40s，45个循环；72℃延伸5min。
扩增产物各取2μL用2％琼脂糖凝胶电泳检测，部分结果如图1所示，所有24个含乳酸菌的制剂都检测到了清晰可见的唯一PCR扩增条带，大小约为1450bp，而对照没有该条带，另外如果出现该条带的同时也出现了其他条带，则也认定为阴性(有杂菌污染)。
实施例3PCR检测乳酸菌菌株的结果的测序验证
对厂商明示菌株稳定的上述24个产品的各批次产品进行如实施例2的检测，99.2％都呈现阳性结果，0.8％呈现阴性结果。为了进一步验证，对阳性结果和阴性结果中所用的PCR扩增的产物，分别抽样进行常规的16S rRNA基因测序(利用Illumina genomeanalyzer使用100bppaired-end模式进行高通量测序)，结果阳性结果中无1例假阳性结果，而阴性结果中有25％的假阴性结果。由于利用本发明的方法假阳性率低，即使叠加测序，也可以排除99％以上的需要测序的工作量。
Figure ISA0000099670790000011
Figure ISA0000099670790000021
Figure ISA0000099670790000031
Figure ISA0000099670790000041

Claims (10)

1.检测食品中乳酸菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取食品中细菌基因组DNA；
(2)对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，其中所使用的引物对是兼并引物对；其中所述引物对是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.7、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9、以及SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10；
(3)将步骤(2)的PCR扩增的产物进行电泳检测；如检测到唯一PCR扩增条带，则检测结果为阳性，否则检测结果为阴性；如检测结果为阳性则不需要进行步骤(4)，如检测结果为阴性则需要进行步骤(4)；
(4)任选对步骤(2)的PCR扩增的产物进行测序。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品是酸奶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌是嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热乳链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳酸菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的体系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot Start Version试剂盒，如下：
5U／μl的TaKaRaExTaqHS0.25μl
加Mg2+的10×Ex Taq Buffer5μl
各2.5mM的dNTPMixture4μl
各20μM的正向和反向引物各0.5μl
细菌基因组提取液中的DNA50ng
加水定容至50μl；
所述PCR扩增条件为：95℃2min预变性；95℃30s，55℃30s，72℃40s，45个循环；72℃延伸5min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，如果PCR扩增的产物经电泳检测是大小为250-300bp的唯一一条PCR扩增条带，则检测结果为阳性，不进行步骤(4)；如果出现该条带的同时也出现了其他条带，则检测结果为阴性，进行步骤(4)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述测序是illimina genome analyzer测序。
7.用于检测食品中乳酸菌的引物对，其特征在于，所述引物对是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.7、SEQ IDNO.2和SEQ IDNO.8、SEQ IDNO.2和SEQ IDNO.9、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9、以及SEQ IDNO.4和SEQ IDNO.10。
8.如权利要求7所述的引物对在检测食品中乳酸菌的方法中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述检测食品中乳酸菌的方法是权利要求1～7之任一所述的方法。
10.检测酸奶中嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热乳链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳酸菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取酸奶中细菌基因组DNA；
(2)对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，其中所使用的引物对是兼并引物对；其中所述引物对是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.8、SEQ IDNO.4和SEQ IDNO.9、以及SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.10；
(3)将步骤(2)的PCR扩增的产物进行电泳检测；如检测到唯一PCR扩增条带，则检测结果为阳性，否则检测结果为阴性；如检测结果为阳性则不需要进行步骤(4)，如检测结果为阴性则需要进行步骤(4)；
(4)任选对步骤(2)的PCR扩增的产物进行测序。
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