CN101717828A - 一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速检测的方法。该方法应用聚合酶链式反应技术与变性梯度凝胶电泳技术相结合的方法，通过对乳酸16S rDNA V3可变区域的扩增和对聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的分析来确定乳酸菌菌种的有无，从而在两个工作日内快速完成对发酵乳制品中乳酸菌种类的检测。
Description
【技术领域】
本发明属于食品有益微生物检测领域，特别是涉及运用PCR技术与变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技术相结合的方法对发酵乳制品中乳酸菌种类进行的快速定性检测。
【背景技术】
发酵乳制品因其独特的口感和丰富的营养价值而日益受到人们的追捧。目前市场上发酵乳制品种类繁多，良莠不齐，并且每种发酵乳制品都宣称含有多种乳酸菌，如此以来，对其质量的监督管理，尤其对其所含乳酸菌种类的定性检测就显得尤为重要。传统方法对发酵乳制品中乳酸菌种类的定性检测仍采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。这种方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，且受外界环境因素和培养基性能的影响较大，检测过程耗时耗力，检测结果也缺乏稳定性和可靠性。聚合酶链式反应(PCR)技术一经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域，变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gelelectrophoresis，DGGE)的出现更是解决了菌种多样性分析必须经过纯培养这个耗时耗力的难题。
所以目前需要一种基于PCR技术与DGGE技术的更加简便、快速测定乳制品中乳酸菌种类的方法。
【发明内容】
为解决上述技术问题，本发明提供了一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速定性检测方法，该方法应用聚合酶链式反应技术和变性梯度凝胶电泳技术，通过对乳酸菌16S rDNA V3可变区域的扩增和对聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的分析来确定乳酸菌菌种的有无，从而完成对发酵乳制品中乳酸菌种类的定性检测。
具体地，本发明提供了一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速检测的方法，该方法包括如下步骤：
(1)宏基因组DNA的提取
提取样品中宏基因组DNA，获得样品DNA模版；
(2)16S rDNA V3区的扩增
用引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对样品DNA模版中的16S rDNAV3区进行扩增，获得PCR产物，其中引物对的核苷酸序列如下：
SEQ ID No.1：
5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’
SEQ ID No.2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’
(3)琼脂糖凝胶电泳
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果；
(4)变性梯度凝胶电泳
将PCR产物进行浓缩，然后进行变性梯度凝胶电泳，将样品的电泳结果与参考菌珠制成的比对标准条带进行对比，确定样品中含有的菌种种类。
具体地，上述发酵乳制品中乳酸菌种类快速检测的方法中，宏基因组DNA的提取是采用液氮冻融-CTAB法，或者是采用本领域其他可以提取样品宏基因组DNA的方法进行提取。
更具体地，液氮冻融-CTAB法的操作步骤是：取1.0mL或1.0g乳样品于5.0mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化，时间约5min，反复冻融3次，加3.0mL DNA提取液混合均匀，加0.3mL 10％ SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后用70％乙醇洗涤沉淀2次，回溶得样品DNA模版，备用。
上述方法中，上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min是为了使沉淀、水相和有机相分层。
上述方法中，DNA提取液的组成为：100mol/L Tris-HCl；100mmol/L EDTA；100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，1％ CTAB，pH＝8.0。
16S rDNA V3区的扩增是采用扩增引物进行PCR反应，一般地，扩增引物采用细菌通用引物，在引物的上下游的5’端添加GC夹子，具体地，所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列分别为正向引物SEQ ID No.1(V3F)和反向引物SEQ ID No.2(V3R)，其核苷酸序列为：
SEQ ID No.1(正向)：
5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’
SEQ ID No.2(反向)：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’
扩增体系为：反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/LMg2+ 1.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物V3F和V3R各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶(Promega)0.5uL，dd H2O补足至50μL。
扩增条件为：95℃变性3min；循环20次：94℃变性40S，65℃退火30S，72℃延伸1min，每个循环退火温度降低0.5度；循环10次：94℃变性40S，55℃退火30S，72℃延伸1min；然后72℃延伸8min，4℃保存。
琼脂糖凝胶电泳是将PCR产物置于1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。
变性梯度凝胶电泳是将上述PCR产物浓缩后，取5微升上样，采用伯乐公司的D-code系统进行DGGE电泳分析，电泳条件为：8％(W/V)的聚丙烯酰胺(37.5∶1，W/W)，以变性剂尿素与甲酰胺线性梯度范围为35％～60％，60C恒温，150V 7h，然后采用银染的方法显色，再通过与参考菌株条带对比得出检测结果。
本发明是将PCR技术与DGGE技术结合起来应用到发酵乳制品乳酸菌种类的定性检测中，该方法可以简化检测乳酸菌的程序、提高检测效率，该检测工作可在两个工作日内完成；并且该方法提高了乳酸菌的检测能力，完善保健食品的质量监管，为发酵乳制品产业的长远发展提供技术保障。
【附图说明】
图1、乳酸菌宏基因组DNA电泳图，1：样品1；2：样品2；M：λ-DNA/HindIII Markers，1-2号为市售两种酸奶样品
图2、16S rDNA v3区的扩增结果电泳图，1：样品1；2：样品2；3：样品3；M：DL600Markers，1-3号为市售三种酸奶样品
图3、发酵乳制品样品的DGGE指纹图谱，L是用参考菌珠制成的比对标准，条带自上而下为：植物乳杆菌，双歧杆菌，短乳杆菌，发酵乳杆菌，德式乳杆菌保加利亚亚种，肠膜明串珠菌，干酪乳杆菌，嗜酸乳杆菌，乳酸乳球菌；1-3号为市售三种酸奶样品
图4、DNA琼脂糖凝胶电泳图，1：样品1；2：样品2；3：样品3；4：样品4；M：λ-DNA/Hind III Markers，1-4号为市售四种乳酸菌饮料样品
图5、16S rDNA v3区的扩增结果电泳图，1：样品1；2：样品2；3：样品3；4：样品4；M：DL600Markers，1-4号为市售四种乳酸菌饮料样品
图6、发酵乳制品样品的DGGE指纹图谱，L是用参考菌珠制成的比对标准，条带自上而下为：植物乳杆菌，短乳杆菌，德式乳杆菌保加利亚亚种，干酪乳杆菌，嗜热链球菌，嗜酸乳杆菌；1-4号为市售四种乳酸菌饮料样品
【具体实施方式】
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1酸牛乳中乳酸菌种类的快速检测
酸牛乳中乳酸菌种类的快速检测包括如下步骤：
1、宏基因组DNA的提取：
采用液氮冻融-CTAB法：取三种样品酸牛乳1.0mL分别置于5.0mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化，反复冻融3次，加3.0mL DNA提取液(100mol/L Tris-HCl；100mmol/L EDTA；100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，1％ CTAB，pH8.0)混合均匀，加0.3mL 10％ SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用；乳酸菌宏基因组DNA电泳图参见图1，其中采集了1号和2号样品的电泳图。
2、16S rDNA V3区的扩增
采用如下核苷酸序列的引物进行扩增：
SEQ ID No.1(正向)：
5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’
SEQ ID No.2(反向)：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’
扩增体系为反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/LMg2+ 1.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物(V3F和V3R)各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶(Promega)0.5uL，dd H2O补足至50μL；
扩增条件为：95℃变性3min；循环20次：94℃变性40S，65℃退火30S，72℃延伸1min，每个循环退火温度降低0.5度；循环10次：94℃变性40S，55℃退火30S，72℃延伸1min；然后72℃延伸8min，4℃保存。
3、琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物于1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果，结果参见图2，通过电泳图可以看到在200-300bp左右有清晰的电泳条带，说明扩增效果很好。
4、变性梯度凝胶电泳
将上述PCR产物浓缩后，取5微升上样，采用伯乐公司的D-code系统进行DGGE电泳分析。电泳条件如下，8％(W/V)的聚丙烯酰胺(37.5∶1，W/W)，以变性剂尿素与甲酰胺线性梯度范围为35％～60％，60℃恒温，150V 7h，然后采用银染的方法，通过与参考菌株条带对比得出结果，参见图3，L是用参考菌珠制成的比对标准，1号产品含有德式乳杆菌保加利亚亚种，2号产品含有植物乳杆菌和双歧杆菌，3号样品含有德式乳杆菌保加利亚亚种和一种未知菌种。
实施例2乳酸菌发酵饮料中乳酸菌种类的快速检测
乳酸菌发酵饮料中乳酸菌种类的快速检测步骤如下：
1、宏基因组DNA的提取：
采用液氮冻融-CTAB法：取四种样品乳酸菌发酵饮料1.0g分别置于5.0mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化，反复冻融3次，加3.0mL DNA提取液(100mol/LTris-HCl；100mmol/L EDTA；100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，1％ CTAB，pH8.0)混合均匀，加0.3mL 10％ SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用，乳酸菌宏基因组DNA电泳图参见图4。
2、16S rDNA V3区的扩增
采用如下核苷酸序列的引物进行扩增：
SEQ ID No.1(正向)：
5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’
SEQ ID No.2(反向)：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’
扩增体系为：反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/LMg2+ 1.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物(V3F和V3R)各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶(Promega)0.5uL，dd H2O补足至50μL。
扩增条件为：95℃变性3min；循环20次：94℃变性40S，65℃退火30S，72℃延伸1min，每个循环退火温度降低0.5度；循环10次：94℃变性40S，55℃退火30S，72℃延伸1min；然后72℃延伸8min，4℃保存。
3、琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物于1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果，电泳后，通过图5可以看到在200-300bp左右有清晰的电泳条带，说明扩增效果很好。
4、变性梯度凝胶电泳
将上述PCR产物浓缩后，取5微升上样，采用伯乐公司的D-code系统进行DGGE电泳分析。电泳条件如下，8％(W/V)的聚丙烯酰胺(37.5∶1，W/W)，以变性剂尿素与甲酰胺线性梯度范围为35％～60％，60℃恒温，150V 7h，然后采用银染的方法，通过与参考菌株条带对比得出结果，参见图6，其中L是用参考菌珠制成的比对标准，1号产品和2号产品都含有嗜酸乳杆菌，3号产品含有嗜热链球菌和德式乳杆菌保加利亚亚种，4号样品不含有任何乳酸菌。
通过实施例1验证了酸牛乳样品1-3含有的乳酸菌种类，而实施例2则验证了乳酸菌发酵饮料样品1-3含有的乳酸菌的种类，乳酸菌发酵饮料样品4中不含有乳酸菌，所以说本发明的快速检测发酵乳制品中乳酸菌种类的方法能够快速而准确检测到乳制品中含有的细菌的种类。
序列表
<110>内蒙古农业大学
<120>一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速检测的方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggc ctacgggagg cagcag 56
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
attaccgcgg ctgctgg 17
Claims (7)
1.一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速检测的方法，其特征在于所述法包括如下步骤：
(1)宏基因组DNA的提取
提取样品中宏基因组DNA，获得样品DNA模版；
(2)16S rDNA V3区的扩增
用引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对样品DNA模版中的16S rDNA V3区进行扩增，获得PCR产物，其中引物对的核苷酸序列如下：
SEQ ID No.1：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’
SEQ ID No.2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’
(3)琼脂糖凝胶电泳
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果；
(4)变性梯度凝胶电泳
将PCR产物进行浓缩，然后进行变性梯度凝胶电泳，将样品的电泳结果与参考菌珠制成的比对标准条带进行对比，确定样品中含有的菌种种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述宏基因组DNA的提取是采用液氮冻融-CTAB法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述液氮冻融-CTAB法的操作步骤是：取1.0mL或1.0g乳样品于5.0mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化，时间约5min，反复冻融3次，加3.0mL DNA提取液混合均匀，加0.3mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下10303g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于10303g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后用70％乙醇洗涤沉淀2次，回溶得样品DNA模版。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA提取液的组成为：100mol/L Tris-HCl；100mmol/L EDTA；100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH＝8.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于16S rDNA V3区的扩增体系为反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L Mg2+1.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物V3F和V3R各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶0.5uL，dd H2O补足至50μL；
扩增条件为：95℃变性3min；循环20次：94℃变性40S，65℃退火30S，72℃延伸1min，每个循环退火温度降低0.5度；循环10次：94℃变性40S，55℃退火30S，72℃延伸1min；然后72℃延伸8min，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述琼脂糖凝胶电泳是将PCR产物置于1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于变性梯度凝胶电泳是将上述PCR产物浓缩后，取5微升上样，采用伯乐公司的D-code系统进行DGGE电泳分析，电泳条件为：8％(W/V)的聚丙烯酰胺，以变性剂尿素与甲酰胺线性梯度范围为35％～60％，60℃恒温，150V 7h，然后采用银染的方法显色，再通过与参考菌株条带对比得出检测结果。
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