CN106480214A - 一种瑞士乳杆菌的pcr快速检测特异引物及方法 - Google Patents

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CN106480214A CN201611081408.1A CN201611081408A CN106480214A CN 106480214 A CN106480214 A CN 106480214A CN 201611081408 A CN201611081408 A CN 201611081408A CN 106480214 A CN106480214 A CN 106480214A
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应汉杰
李克文
崔志军
尹郑
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Abstract

本发明涉及一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物及方法，所述引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及瑞士乳杆菌的PCR快速检测方法。本发明采用瑞士乳杆菌基因组非编码序列首次获得瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物，由于非编码序列在基因组进化中的选择压力更小，近缘物种间的保守性差，因而，扩增产物的特异性更好，准确率更高。

Description

一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物及方法
技术领域
本发明涉及一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物及方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)是一种常见的乳酸菌，主要用于干酪、酸乳、饲料添加剂等制品的生产。瑞士乳杆菌同时也是一种重要的益生菌，是近年来国内外迅速崛起的一类微生态制剂菌株，它广泛地应用于医疗、保健、食品、畜牧和水产等行业。因其具有调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平、能够避免服用抗生素带来的耐药性和二重感染等问题的优点，一直受世人瞩目。近年来，关于瑞士乳杆菌在发酵乳制品方面的研究也越来越广泛。另外，瑞士乳杆菌的细胞壁蛋白酶可以水解乳蛋白产生血管紧张素转移酶抑制肽，能有效地降低人体血压。当前，瑞士乳杆菌的检测方法主要是传统的增菌培养——纯分离培养——生化鉴定，该方法的缺点是操作繁琐、检测时间长，而且生化鉴定的项目较多。随着人们生活水平的提高，对食品安全的需求越来越高，同时，瑞士乳杆菌微生态制剂的研制，生产规模的扩大，传统检测方法的低效率已经不能满足当前批量化的检测任务。因而，研究的瑞士乳杆菌快速检测方法很有必要。
PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点，是当前细菌鉴定中一种快速有效的方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物及方法，该方法具有检测速度快、特异性强、成本低的优点。
本发明技术方案如下：
一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物，所述引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述引物如下：
L.helv-F：5’-TTCGAAAGAATCGAAGATGATT-3’ SEQ ID NO.1；
L.helv-R：5’-TAATGGTATGGTCAAGGACGAC-3’ SEQ ID NO.2。
利用上述PCR快速检测特异引物PCR快速检测瑞士乳杆菌的方法，步骤如下：
(1)提取待测样品中的DNA，制得基因组DNA；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述PCR快速检测特异引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，当结果中存在一条分子量为538bp的核酸条带，则检测样品含有瑞士乳杆菌；当结果中不存在分子量为538bp的核酸条带，则检测样品中不含有瑞士乳杆菌。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，体系总体积为25μl：
基因组DNA 2μl；10×PCR Buffer 2.5μl；Mg2+浓度1.5mmol/L；Taq酶1U；dNTP浓度0.1mmol/L；上游引物10pmol；下游引物10pmol；ddH2O补加至25μl；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30s，72℃延伸40sec，35个循环；72℃终延伸5min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，采用质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR上样缓冲液浓度为10×。
上述步骤(1)中提取待测样品中的DNA和步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳均可按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。
有益效果
1、本发明采用瑞士乳杆菌基因组非编码序列首次获得瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物，由于非编码序列在基因组进化中的选择压力更小，近缘物种间的保守性差，因而，扩增产物的特异性更好，准确率更高；
2、本发明所述PCR快速检测特异引物PCR快速检测瑞士乳杆菌的方法，检测速度快，直接利用菌液的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，而分离纯化和生化鉴定一般需要48～72h；
3、本发明所述PCR快速检测特异引物PCR快速检测瑞士乳杆菌的方法成本低，由于省略了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色、分离纯化培养基和生化试剂的费用，降低了检测成本。
附图说明
图1本发明所述瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物分别对发酵乳酸菌及其他18中干扰菌分别进行PCR检测的电泳照片；
图中：M为分子量标准1：瑞士乳杆菌；2：发酵乳酸菌；3：加氏乳杆菌；4：德氏乳杆菌；5：嗜酸乳杆菌；6：鸡乳杆菌；7：嗜热脂肪芽孢杆菌；8：粪肠球菌；9：凝结芽孢杆菌；10：英诺克李斯特菌；11：河生肠杆菌；12：溶血性链球菌；13：绿脓杆菌；14：奇异变形杆菌；15：宋内氏志贺氏菌；16：气味沙雷氏菌；17：单核增生李斯特菌；18：产气荚膜梭菌；19：大肠埃希氏菌；20：普通变形菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
首先无菌操作取1g待测酸奶样品，加入盛有9ml MRS肉汤的灭菌容器内，36℃±1℃，厌氧条件下培养48h。取培养的菌液加入离心管中，以12000rpm离心lmin，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Taq酶1u；dNTP 0.1mmol/L；瑞士乳杆菌特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；设置PCR仪的程序参数为：95℃变性5min；95℃30sec，53℃30s，72℃40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。其中瑞士乳杆菌特异性引物为：
L.helv-F：5’-TTCGAAAGAATCGAAGATGATT-3’；
L.helv-R：5’-TAATGGTATGGTCAAGGACGAC-3’
最后进行电泳检测，取9μl PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合，在加入万分之一的Gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测，如果在紫外灯下存在538bp的核酸片段，则说明有瑞士乳杆菌。
实施例2
首先无菌操作取1g待测番茄酱样品(含有瑞士乳杆菌)，加入盛有9ml MRS肉汤培养基的灭菌容器内，36℃±1℃，厌氧条件下培养48h。取培养的菌液加入离心管中，以12000rpm离心lmin，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。
然后进行PCR反应，每个PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA，2μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+浓度1.5mmol/L；Taq酶1U；dNTP 0.1mmol/L；瑞士乳杆菌特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；
设置PCR仪的程序参数为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30s，72℃延伸40sec，35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。
其中瑞士乳杆菌特异性引物为：
L.helv-F：5’-TTCGAAAGAATCGAAGATGATT-3’；
L.helv-R：5’-TAATGGTATGGTCAAGGACGAC-3’
最后进行电泳检测，取9μl PCR产物与10×PCR上样缓冲液混合，在加入万分之一的Gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测，如果在紫外灯下存在538bp的核酸片段，则说明有瑞士乳杆菌。
同时采用发酵乳酸菌(购自CGMCC，菌种编号1.1880)、加氏乳杆菌(购自CGMCC，菌种编号1.2743)、德氏乳杆菌(购自CGMCC，菌种编号1.2624)、嗜酸乳杆菌(购自CGMCC，菌种编号1.1854)、动物乳杆菌(购自CGMCC，菌种编号1.2623)、嗜热脂肪芽孢杆菌(购自CGMCC，菌种编号1.1923)、粪肠球菌(购自ATCC，菌种编号29212)、凝结芽孢杆菌(购自CGMCC，菌种编号1.2009)、英诺克李斯特菌(购自ATCC，菌种编号33090)、河生肠杆菌(购自ATCC，菌种编号51816)、溶血性链球菌(购自ATCC，菌种编号32210)、绿脓杆菌(购自ATCC，菌种编号27853)、奇异变形杆菌(购自ATCC，菌种编号12453)、宋内氏志贺氏菌(购自ATCC，菌种编号9290)、气味沙雷氏菌(购自ATCC，菌种编号33077)、单核增生李斯特菌(购自ATCC，菌种编号BAA-751)、产气荚膜梭菌(购自ATCC，菌种编号64609)、大肠埃希氏菌(购自ATCC，菌种编号25922)和普通变形杆菌(购自ATCC，菌种编号49132)按上述同样方法进行检测，结果如图1所示。
从图1可知，只有瑞士乳杆菌有扩增产物，扩增长度为538bp，干扰菌没有扩增产物，说明引物具有很好的特异性。
对比例
为了验证本发明PCR扩增引物(乳杆菌基因组非编码区设计的序列)的准确性，同时在乳杆菌基因组编码区序列设计了PCR扩增引物5对，分别命名为引物A，引物B，引物C，引物D，引物E。选用番茄酱样品，分别添加瑞士乳杆菌、发酵乳酸菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鸡乳杆菌进行检测。结果显示，虽然这5对在编码区设计的引物在瑞士乳杆菌中都能扩增，但在其他5种近缘物种间都有不同程度的扩增，说明在检测相同样品时，准确性都低于本发明所述的瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物。
表1
瑞士乳杆菌 发酵乳酸菌 加氏乳杆菌 德氏乳杆菌 嗜酸乳杆菌 鸡乳杆菌
本发明引物 + - - - - -
引物A + - + - - -
引物B + - - + - -
引物C + - - + - -
引物D + - + - + -
引物E + + - - - -
SEQUENCE LISTING
<110> 保龄宝生物股份有限公司
<120> 一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物及方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcgaaagaa tcgaagatga tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taatggtatg gtcaaggacg ac 22

Claims (5)

1.一种瑞士乳杆菌的PCR快速检测特异引物，所述引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.利用权利要求1所述PCR快速检测特异引物PCR快速检测瑞士乳杆菌的方法，步骤如下：
(1)提取待测样品中的DNA，制得基因组DNA；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述PCR快速检测特异引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)制得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，当结果中存在一条分子量为538bp的核酸条带，则检测样品含有瑞士乳杆菌；当结果中不存在分子量为538bp的核酸条带，则检测样品中不含有瑞士乳杆菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，体系总体积为25μl：
基因组DNA2μl；10×PCR Buffer 2.5μl；Mg2+浓度1.5mmol/L；Taq酶1U；dNTP浓度0.1mmol/L；上游引物10pmol；下游引物10pmol；ddH2O补加至25μl。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30s，72℃延伸40sec，35个循环；72℃终延伸5min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR上样缓冲液浓度为10×。
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