CN105039578A - 一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，包括如下步骤：⑴收集摄入混合菌液/菌粉后的受试者的粪便样品；⑵进行粪便中细菌基因组的提取，得粪便细菌基因组；⑶选择特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性；⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线；⑸荧光定量PCR，得到ct值，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量；⑹比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠道的定植能力。本方法基于荧光定量PCR，能够在较短的时间完成粪便样品中六种乳杆菌的快速准确定量，进而比较其肠道定植能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，该方法基于荧光定量PCR、能快速准确测定植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌六种乳杆菌在肠道的定植能力。
背景技术
乳酸菌是一群能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的总称，乳酸菌中比较重要的属有：乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、片球菌属、明串珠菌属等，其中，乳杆菌属细菌因其良好的生长发酵特性及益生功能，被广泛应用于食品发酵、工业乳酸生产及医疗保健等领域，与人类每日生活密切相关。乳杆菌具备了良好的发酵特性及益生功效，不仅能够提高食品的营养价值，改善食品风味，提高其附加值及保藏性，而且能够调节肠道菌群、保持微生态平衡、增强机体免疫作用，但乳酸菌在人体内发挥益生功效的前提条件是能够通过上消化道顺利到达肠道，牢固地粘附在肠壁上，不会随着食物的运动和肠道蠕动被逐步排出体外，且能够适应肠道环境，不断繁殖，使自身保持一定数量，即定植于肠道，因此乳杆菌在肠道定植对其益生功效的形成至关重要，乳杆菌的肠道定植能力在很大程度上决定了其益生功效的高低，所以，乳杆菌菌株肠道定植能力的评价对于工业应用菌株整体功能性的评价及筛选具有重要的意义。
对于菌株肠道定植能力的测定，目前有以下几种方法：
1、传统的平板培养方法
该方法是通过对摄入菌株后的动物或人粪便中菌株进行选择性平板培养计数，计算其中菌量。该方法操作繁琐、耗时较长且对选择性培养基的选择精确度有较大的依赖，只能计算活菌数，不能准确反应菌株在肠道的定植状况。
2、梯度变性凝胶电泳(DGGE-PCR)技术
该方法对摄入益生菌后的实验动物或人体粪便进行如下处理：总基因组的提取→16SrRNA可变区扩增→梯度变性凝胶电泳→染色成像→切胶回收→转化克隆→测序比对，分析数据可得到每个粪便样品中菌系组成及显示条带的菌的相对含量。DGGE-PCR侧重于样品菌群多样性的分析，能够反映粪便菌群构成与多样性，能够准确定性，但其基于灰度计算的半定量分析方法不能够达到准确定量的目的，且电泳结束后的后期处理繁琐，在测序比对这一步会产生大量的费用，不是一种准确快捷的定植能力测定方法。
3、基于16SrRNA特异性探针的荧光原位杂交技术
该技术采用基于菌株的特异性探针进行原位杂交，结合流式细胞仪对灌胃菌株后的实验动物粪便中带荧光菌株相对含量进行测定。该方法在一定程度能够在微观分子水平上准确反映菌株在肠道的定植情况，但该方法前期准备工作复杂，需要良好的分子操作能力，且工作效率较低，而该方法最主要的局限在于只能用于动物实验，无法进行人体实验，无法准确反映菌株在人体肠道定植情况。
4、实时荧光定量PCR法
该方法是一种在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用过程中荧光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR方法步骤如下：
(1)样品基因组DNA提取
(2)目的菌种特异性引物设计及验证
(3)目的菌种标准曲线制作
(4)荧光定量PCR扩增
(5)利用标准曲线换算ct值为拷贝数，得到单位粪便样品中乳杆菌的量
该方法通过应用特异性引物可以仅通过一次荧光定量PCR将模板中的对应种属的菌株绝对定量，该方法耗时短，操作方便，定量准确，是一种能够良好应用于粪便样品中菌株定量测定，进而分析比较菌株定植能力的方法。
通过对比，本发明专利申请与上述检测方法相比存在本质的不同，在乳杆菌肠道定植能力的测定方面具有很大的优势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，克服了传统平板培养法的局限性和耗时长，DGGE-PCR方法的操作繁琐、工作量大、费用高及荧光标记方法对受试对象的局限性等缺陷，提供一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，该方法基于荧光定量PCR，能够在较短的时间完成粪便样品中植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌六种乳杆菌的快速准确定量，进而比较其肠道定植能力。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，包括如下步骤：
⑴收集摄入混合菌液/菌粉的受试者在摄入菌前后的新鲜粪便，得粪便样品；
⑵定量称取粪便样品，进行粪便中细菌基因组的提取，得粪便细菌基因组；
⑶选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性；
⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，采用步骤⑶中六对特异性荧光定量PCR引物进行普通PCR，对得到的产物进行切胶回收，测定回收产物浓度，计算出拷贝数，对产物进行梯度稀释，以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，采用相应的特异性荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR，得到ct值，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线；
⑸以步骤⑵中粪便细菌基因组为模板，分别采用步骤⑶中的六对特异性荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，得到不同样品荧光定量PCR的ct值，带入步骤⑷中计算出的相应标准曲线方程中计算出拷贝数，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量；
⑹比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠道的定植能力。
而且，所述步骤⑴中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉；
或者，所述步骤⑴的具体步骤如下：分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中活菌数，制备含有六种乳杆菌的混合菌液/菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉于-20℃保存备用。
而且，所述步骤⑶中选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物的具体步骤如下：
通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌的16SrRNA序列，通过比对这些序列，找到一种乳杆菌与其他乳杆菌有差异的可变区序列，根据这些序列采用premier5.0软件设计特异性引物，使用该引物能特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的。
而且，所述步骤⑴的具体步骤为：
以一定量六种不同乳杆菌混合菌粉或菌液喂食受试者，喂食2-4周之后，停止摄入乳杆菌，收集摄入乳杆菌前及停止摄入乳杆菌后不同阶段的受试者新鲜粪便100-200mg，于-80℃冰箱中保存、备用。
而且，所述步骤⑶中特异性荧光定量PCR引物是分别针对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性PCR引物，这六对引物能特异性扩增出该种乳杆菌16SrRNA中的特异性片段，这六对引物分别为SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9、SEQ10、SEQ11、SEQ12。
而且，所述步骤⑶中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测，步骤如下：
第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方法如下：
①取培养过夜后的六种菌液1-2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
②加入1-2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
③加入200ulSDS裂解液，混匀后在65-80℃恒温保温20-30min；
④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心5-10min，取上清200ul；
⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20℃静止30-50min之后，12000r/min离心5-10min，弃上清；
⑥加入500ul70％冰乙醇重悬沉淀，12000r/min离心1-3min，弃上清，常温干燥；
⑦用50-100ulddH2O溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于-20℃保存、备用；
第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行普通PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测；
其中，PCR体系50μL：10×buffer5μL；DNTPs5μL；上游引物20μmol/L1μL；下游引物20μmol/L1μL；TaqDNApolymerase250U0.5μL；模板DNA1μL；ddH2O36.5μL；
PCR程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③60℃变性30s；④72℃延伸30s；⑤②～④循环30次；⑥72℃延伸2min；对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能够用于后期定量检测。
而且，所述步骤⑵中的粪便中细菌基因组的提取采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取粪便基因组，具体操作方法如下：
①称取100-200mg粪便样品于裂解介质管中，加入978ul磷酸盐缓冲液和122ulMT缓冲液；
②将裂解介质管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2次；
③将裂解介质管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转移至干净的2ml离心管中，加入250ulPPS溶液，于手中振荡10次混匀；
④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心管中；
⑤重悬硅土结合液之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使硅土与DNA结合，静置3min使硅土沉淀；
⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心1min，清空接收管中液体，加入剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀；之后于14000G条件下离心1min，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
⑧将过滤管换到新的接收管中，室温干燥5min；
⑨加入50-100ulDNA洗脱液溶液，14000G离心1min，得到粪便基因组，于-20℃保存，备用。
而且，所述步骤⑷中以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
而且，所述步骤⑸中荧光定量PCR扩增的具体操作步骤如下：
PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
而且，所述步骤⑹的具体判断方法如下：
将停止摄入乳杆菌后2～14天的受试者粪便中各种乳杆菌的量，与摄入乳杆菌之前的水平进行比较，高于之前的菌量即表示定植，由此能够得到每株乳杆菌的肠道定植时间，进一步地能够定量比较每株菌的定植量。
本发明取得的优点和有益效果是：
本发明针对六种应用较为广泛的乳杆菌—植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌的肠道定植能力进行测定，创新性地利用实验对象摄入六种或几种混合菌株，收集摄入前后的实验对象粪便，对粪便进行荧光定量检测就可以批量分析多种菌在肠道的定植情况，大大减少了实验周期，并节约实验动物资源；同时荧光定量检测分析对分子操作技术要求不高，可简单、快捷操作，动物实验结束后从粪便提取到数据分析，只需要4-5h便可完成；该发明方法检测精准度高，能准确定量粪便样品中的乳杆菌的量，可以在分析菌株定植时间的同时准确分析菌株的定植量；是一种可行的能够广泛推广的菌株肠道定植能力测定方法。
附图说明
图1为本发明中六种乳杆菌相应的荧光定量PCR引物特异性检测的琼脂糖电泳图；
其中，图1-1为鼠李糖乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L9模板分别为鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球菌；
图1-2为干酪乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L11模板分别为干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌；
图1-3为保加利亚乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L9模板分别为保加利亚乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌；
图1-4为发酵乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L9模板分别为发酵乳杆菌、发酵乳杆菌、发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌；
图1-5为植物乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L11模板分别为保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、植物乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌；
图1-6为瑞士乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L11模板分别为保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、瑞士乳杆菌、瑞士乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌；
图2为本发明六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线图；其中，图2-1为发酵乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-2为鼠李糖乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-3为保加利亚乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-4为瑞士酵乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-5为植物乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-6为干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；
图3为本发明六种乳杆菌的六对特异性荧光定量PCR引物的荧光定量PCR熔解曲线图；其中，图3-1为保加利亚乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-2为发酵乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-3为瑞士乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-4为干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-5为鼠李糖乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-6为植物乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；
图4为本发明中不同时期粪便样品的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
本发明中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉。
本发明中可以采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取粪便基因组，其方法如下：
①称取100-200mg粪便样品于LysingMatrixE(裂解介质)管中，加入978ulSodiumphosphateBuffer(磷酸盐缓冲液)和122ulMTBuffer(缓冲液)；
②将LysingMatrixE(裂解介质)管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2次；
③将LysingMatrixE(裂解介质)管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转移至干净的2ml离心管中，加入250ulPPS溶液，于手中振荡10次混匀；
④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心管中；
⑤重悬BindingMatrixSuspension(硅土结合液)之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使硅土与DNA结合，静置3min使硅土沉淀；
⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心1min，清空接收管中液体，加入剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀；之后于14000G条件下离心1min，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
⑧将SPINFilte(过滤管)换到新的接收管中，室温干燥5min；
⑨加入50-100ulDES溶液(DNA洗脱液)，14000G离心1min，得到粪便基因组，于-20℃保存，备用。
所述以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul：2×SYBRGreenSupermix(染料预混液)10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
本发明中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测可以采用如下方法，步骤如下：
第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方法如下：①取培养过夜后的六种菌液1-2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
②加入1-2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
③加入200ulSDS裂解液，混匀后在65-80℃恒温保温20-30min；
④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心5-10min，取上清200ul；
⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20℃静止30-50min之后，12000r/min离心5-10min，弃上清；
⑥加入500ul70％冰乙醇重悬沉淀，12000r/min离心1-3min，弃上清，常温干燥；
⑦用50-100ulddH2O溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于-20℃保存、备用；
第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行普通PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测；
其中，PCR体系50μL：10×buffer5μL；DNTPs5μL；上游引物(20μmol/L)1μL；下游引物(20μmol/L)1μL；TaqDNApolymerase(250U)0.5μL；模板DNA1μL；ddH2O36.5μL；
PCR程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③60℃变性30s；④72℃延伸30s；⑤②～④循环30次；⑥72℃延伸2min；对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能够用于后期定量检测。
实施例1乳杆菌在小鼠肠道定植能力测定
采用SPF(无特定病原体动物)级小鼠为实验模型，通过灌胃混合菌液及后期收集、检测粪便中这六种菌的量来测定小鼠在肠道的定植能力。
(1)分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中活菌数，制备含有六种乳杆菌的混合菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉于-20℃保存备用。
(2)购买4-6周龄SPF级小鼠，于实验动物中心屏障环境饲养，试验分为两个组，每组8只小鼠，一组为实验组，每只小鼠每天灌胃200ul分别含有108CFU的六种乳杆菌的混合菌液，另外一组为对照组，每只每天灌胃200ul的脱脂乳，试验周期为14天。收集灌胃前及灌胃停止后4、6、8、10、12、14天的小鼠粪便，于-80℃保存，备用。
(3)准确称取100mg步骤(2)中所述小鼠粪便样品，采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取粪便基因组。
(4)通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳杆菌的16SrRNA序列，通过比对这些序列，找到一种乳杆菌与其他乳杆菌有差异的可变区序列，根据这些序列采用premier5.0软件设计特异性引物，使用该引物能特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的，采用常规PCR检测其特异性；
其中，PCR模板分别为六种乳杆菌的细菌基因组，其中PCR体系50μL：10×buffer5μL；DNTP5μL；上游引物(20μmol/L)1μL；下游引物(20μmol/L)1μL；TaqDNApolymerase(250U)0.5μL；模板DNA1μL；ddH2O36.5μL。PCR程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③60℃变性30s；④72℃延伸30s；⑤②～④循环30次；⑥72℃延伸2min；对扩增产物进行琼脂糖电泳，电泳图见附图1，由图1可知，六对引物均具有较好的特异性。
(5)采用上述的六种乳杆菌的基因组为模板，分别采用相应的特异性引物进行普通PCR，对得到的PCR产物进行切胶回收，测定回收产物的浓度，将浓度换算成拷贝数，DNA浓度与拷贝数之间的换算公式如下：
Copies/ul=6.02*1023*[(ng/ul*10-9)/(sizeinbp*660)]，
之后将回收产物梯度稀释，使其拷贝数在102-1010之间。以梯度稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR；
其中，荧光定量PCR体系20ul：2×SYBRGreenSupermix10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s；以拷贝数和得到的稀释样品ct值制作标准曲线，同时观察六种引物的熔解曲线中峰是否为单一峰，是则说明该引物能够特异性扩增出单一的片段，六种乳杆菌的标准曲线和熔解曲线分别见附图2、附图3，由图3可以看到六种引物的荧光定量PCR产物均具有单一的熔解峰，表明六对引物具有良好的扩增特异性，可用于后期的荧光定量实验。
(6)以粪便基因组为模板，采用表1中六种引物进行荧光定量PCR反应，每个粪便样品基因组分别采用六种引物进行荧光定量，每个反应做三个平行，检测结果如图4所示，由图可以看出，大部分的样品的ct值在10-25之间，属于有效数据，就可以用于定量分析。
(7)将以不同粪便样品荧光定量得到的ct值带入相应的标准曲线中计算出拷贝数，换算成每克粪便中的量，不同阶段粪便中六种菌的含量见表2，比较同一种菌在灌胃结束后4、6、8、10、12、14天与灌胃之前的量，若前者高于后者表明该菌至少定植至当天，同时可比较不同菌的定植量，分析定植能力。由表2中数据可看出各菌的肠道定植时间，在喂食小鼠的六种菌中，植物乳杆菌的量在停止摄入菌粉14天后依然保持在7.02±0.34(lg拷贝数/g粪便)，相较未摄入菌粉前的6.02±0.79(lg拷贝数/g粪便)来说，提高了一个数量级，表明植物乳杆菌P1菌能够以高出原始菌量一个数量级的水平定植肠道14天，分析其他数据可知干酪乳杆菌C1也有相同的定植趋势，这两株菌在六株菌中具有最好的肠道定植能力；而发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌的量在停止摄入菌粉后的两周内，都在初始量6.16±0.16、7.6±0.22(lg拷贝数/g粪便)左右波动，表明发酵乳杆菌F1和瑞士乳杆菌H1分别以较低的定植量于小鼠肠道中定植12天和8天，具有较弱的肠道定植能力，而保加利亚乳杆菌B1及鼠李糖乳杆菌R1以较低的定植量定植14天。实验结果说明本发明可以方便、快捷的测定多种菌株的肠道定植天数与定植量。
实施例2乳杆菌在人体肠道定植能力测定
采用健康成人为实验对象，通过给予混合菌液及后期收集、检测人体粪便中这六种菌的量来测定菌株在人体肠道的定植能力。
(1)分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中活菌数，混合菌粉制备含有六种乳杆菌的混合菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉于-20℃保存备用。
(2)组织10位年龄在20-40岁的健康成人进行试验，受试人群每天摄入分别含有1010cfu的六种乳杆菌的混合菌液，试验周期为14天。收集摄入菌前及停止摄入后4、6、8、10、12、14天的人体粪便，于-80℃保存，备用。
(3)准确称取100-200mg粪便样品，采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取粪便基因组。
(4)选用实施案例1中所用的六对不同乳杆菌特异性引物进行荧光定量PCR。
(5)采用实施案例1中六种菌的荧光定量标准曲线进行后期的计算。
(6)以粪便基因组为模板，采用表1中六种引物进行荧光定量PCR反应，每个粪便样品基因组分别采用六种引物进行荧光定量，每个反应做三个平行。
(7)将以不同粪便样品荧光定量得到的ct值带入相应的标准曲线中计算出拷贝数，换算成每克粪便中的量，比较同一种菌在灌胃结束后4、6、8、10、12、14天与灌胃之前的量，若前者高于后者表明该菌至少定植至当天，同时可比较不同菌的定植量，分析定植能力。
本实施例的相关检测结果同实施例1。
实施例3
本发明提供六种乳杆菌，包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌的肠道定植能力测定方法，具体包括以下步骤：
(1)收集摄入一定量混合菌液/菌粉的受试者在摄入菌前后的新鲜粪便；
(2)定量称取粪便，进行粪便中细菌基因组的提取；
(3)选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特性；
(4)分别采用六种乳杆菌的细菌基因组为模板，采用步骤(3)中六对相应的引物进行普通PCR，对得到的产物进行切胶回收，测定回收产物浓度，计算出拷贝数，对产物进行梯度稀释之后，以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，得到ct值，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线；
(5)以粪便细菌基因组为模板，分别以步骤(3)中所述的六对序列为引物进行荧光定量PCR扩增，得到不同样品荧光定量PCR的ct值，带入步骤(4)中计算出的相应标准曲线方程中计算出拷贝数，即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量；
(6)比较在摄入菌前后受试者粪便中的菌含量，即可知该菌株在肠道的定植能力；
所述步骤(1)中，采用动物或人体为模型，检测菌株的肠道定植能力的一般方法为：以一定量六种不同乳杆菌混合菌粉或菌液喂食受试者，喂食一定周期之后，停止摄入乳杆菌，收集摄入乳杆菌前及停止摄入乳杆菌后不同阶段的受试者新鲜粪便100-200mg，于-80℃冰箱中保存、备用。
所述步骤(2)中，采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取粪便基因组，具体操作方法如下：
①称取100-200mg粪便样品于LysingMatrixE(裂解介质)管中，加入978ulSodiumphosphateBuffer(磷酸盐缓冲液)和122ulMTBuffer(缓冲液)；
②将LysingMatrixE(裂解介质)管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2次；
③将LysingMatrixE(裂解介质)管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转移至干净的2ml离心管中，加入250ulPPS溶液，于手中振荡10次混匀；
④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心管中；
⑤重悬BindingMatrixSuspension(硅土结合液)之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使硅土与DNA结合，静置3min使硅土沉淀；
⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心1min，清空接收管中液体，加入剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀；之后于14000G条件下离心1min，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
⑧将过滤管换到新的接收管中，室温干燥5min；
⑨加入50-100ulDNA洗脱液溶液，14000G离心1min，得到粪便基因组，于-20℃保存，备用。
所述步骤(3)中所述的引物是分别针对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性PCR引物，这六对引物能特异性扩增出该种乳杆菌16SrRNA中的特异性片段。具体序列见表1。对六对引物的扩增特异性进行检测，首先准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方法如下：
①取培养过夜后的六种菌液1-2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
②加入1-2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
③加入200ulSDS裂解液，混匀后在65-80℃恒温保温20-30min；
④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心5-10min，取上清200ul；
⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20℃静止30-50min之后，12000r/min离心5-10min，弃上清；
⑥加入500ul70％冰乙醇重悬沉淀，12000r/min离心1-3min，弃上清，常温干燥；
⑦用50-100ulddH2O溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于-20℃保存、备用；
以得到的乳杆菌基因组为模板，采用附表1中六对引物进行普通PCR，分别对(1)中六对引物的特异性进行PCR检测，其中PCR体系50μL：10×buffer5μL；DNTPs5μL；上游引物(20μmol/L)1μL；下游引物(20μmol/L)1μL；TaqDNApolymerase(250U)0.5μL；模板DNA1μL；ddH2O36.5μL。PCR程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③60℃变性30s；④72℃延伸30s；⑤②～④循环30次；⑥72℃延伸2min；对扩增产物进行琼脂糖电泳，一种乳杆菌引物只能特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段即表明该引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能够用于后期定量检测。
所述步骤(4)中，以六种梯度稀释后的特异性PCR产物为模板，分别采用相应的六对引物进行荧光定量PCR。其中PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s；
所述步骤(5)中，荧光定量PCR的具体操作步骤见步骤(4)说明。
所述步骤(6)中，比较停止摄入乳杆菌后一段时间的受试者粪便中各种乳杆菌的量，与摄入乳杆菌之前的水平进行比较，高于之前的菌量即表示定植，由此可得到每株乳杆菌的肠道定植时间，进一步的可定量观察比较每株菌的定植量。
本实施例的相关检测结果同实施例1。
表1六种乳杆菌荧光定量PCR特异性引物序列
表2不同阶段粪便中六种菌的含量表
Claims (10)
1.一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
⑴收集摄入混合菌液/菌粉的受试者在摄入菌前后的新鲜粪便，得粪便样品；
⑵定量称取粪便样品，进行粪便中细菌基因组的提取，得粪便细菌基因组；
⑶选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物，并检测其扩増特异性；
⑷分别采用上述六种乳杆菌的细菌基因组为模板，采用步骤⑶中六对特异性荧光定量PCR引物进行普通PCR，对得到的产物进行切胶回收，测定回收产物浓度，计算出拷贝数，对产物进行梯度稀释，以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，采用相应的特异性荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR，得到ct值，分别制作六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线；
⑸以步骤⑵中粪便细菌基因组为模板，分别采用步骤⑶中的六对特异性荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，得到不同样品荧光定量PCR的ct值，带入步骤⑷中计算出的相应标准曲线方程中计算出拷贝数，通过换算即可得到单位粪便样品中各种乳杆菌的量；
⑹比较在摄入混合菌液/菌粉前后的受试者粪便中的乳杆菌含量，即得菌株在肠道的定植能力。
2.根据权利要求1所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑴中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉；
或者，所述步骤⑴的具体步骤如下：分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中活菌数，制备含有六种乳杆菌的混合菌液/菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉于-20℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑶中选择植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的相应的特异性荧光定量PCR引物的具体步骤如下：
通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌的16SrRNA序列，通过比对这些序列，找到一种乳杆菌与其他乳杆菌有差异的可变区序列，根据这些序列采用premier5.0软件设计特异性引物，使用该引物能特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的。
4.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑴的具体步骤为：
以一定量六种不同乳杆菌混合菌粉或菌液喂食受试者，喂食2-4周之后，停止摄入乳杆菌，收集摄入乳杆菌前及停止摄入乳杆菌后不同阶段的受试者新鲜粪便100-200mg，于-80℃冰箱中保存、备用。
5.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑶中特异性荧光定量PCR引物是分别针对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的特异性PCR引物，这六对引物能特异性扩增出该种乳杆菌16SrRNA中的特异性片段，这六对引物分别为SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8、SEQ9、SEQ10、SEQ11、SEQ12。
6.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑶中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测，步骤如下：
第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方法如下：
①取培养过夜后的六种菌液1-2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
②加入1-2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
③加入200ulSDS裂解液，混匀后在65-80℃恒温保温20-30min；
④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心5-10min，取上清200ul；
⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20℃静止30-50min之后，12000r/min离心5-10min，弃上清；
⑥加入500ul70％冰乙醇重悬沉淀，12000r/min离心1-3min，弃上清，常温干燥；
⑦用50-100ulddH2O溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于-20℃保存、备用；
第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行普通PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测；
其中，PCR体系50μL：10×buffer5μL；DNTPs5μL；上游引物20μmol/L1μL；下游引物20μmol/L1μL；TaqDNApolymerase250U0.5μL；模板DNA1μL；ddH2O36.5μL；
PCR程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③60℃变性30s；④72℃延伸30s；⑤②～④循环30次；⑥72℃延伸2min；对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能够用于后期定量检测。
7.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑵中的粪便中细菌基因组的提取采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取粪便基因组，具体操作方法如下：
①称取100-200mg粪便样品于裂解介质管中，加入978ul磷酸盐缓冲液和122ulMT缓冲液；
②将裂解介质管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2次；
③将裂解介质管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转移至干净的2ml离心管中，加入250ulPPS溶液，于手中振荡10次混匀；
④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心管中；
⑤重悬硅土结合液之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使硅土与DNA结合，静置3min使硅土沉淀；
⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心1min，清空接收管中液体，加入剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀；之后于14000G条件下离心1min，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
⑧将过滤管换到新的接收管中，室温干燥5min；
⑨加入50-100ulDNA洗脱液溶液，14000G离心1min，得到粪便基因组，于-20℃保存，备用。
8.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑷中以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
9.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑸中荧光定量PCR扩增的具体操作步骤如下：
PCR体系20ul：2×SYBR染料预混液10ul；上游引物1ul；下游引物1ul；DNA模板1ul；ddH2O1ul；PCR程序如下：①95℃预变性3min；②95℃变性5s；③60℃变性30s；④72℃延伸10s；⑤步骤②～步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65℃-95℃，0.5℃/2-5s。
10.根据权利要求1或2所述的乳杆菌肠道定植能力的测定方法，其特征在于：所述步骤⑹的具体判断方法如下：
将停止摄入乳杆菌后2～14天的受试者粪便中各种乳杆菌的量，与摄入乳杆菌之前的水平进行比较，高于之前的菌量即表示定植，由此能够得到每株乳杆菌的肠道定植时间，进一步地能够定量比较每株菌的定植量。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151111 |