CN106148483A - 检测大肠杆菌细胞dna的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测大肠杆菌细胞基因组DNA的引物对、包含本发明引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测大肠杆菌细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO：1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分CHO细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA，还能用于对食品或保健品作溯源，从而所检测的食品或保健品是天然来源的。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及大肠杆菌(E.Coli)细胞DNA的检测引物及方法。
背景技术
在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。
重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。
在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。
大肠杆菌因以下原因而成为基因工程的常见宿主菌：首先，人们对大肠杆菌的细胞形态及生理生化特性比较了解，对于培养基的配制与运载体的导入等技术也更容易把握；其次，细菌质粒是基因工程常用的运载体，而大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，因为大肠杆菌质粒上有诸如抗青霉素基因等易于检测的标记基因，并且容易使目的基因在宿主细胞中复制和表达；再次，大肠杆菌本身自然是最适合大肠杆菌质粒行使其功能的场所；第四，大肠杆菌是一种典型的兼性厌氧行细菌，其体积小，表面积与体积的比例很大，并且能利用氧气进行彻底生物氧化释放大量能量，因而能够与外界迅速进行物质和能量交换，并在体内迅速转化。如此使得大肠杆菌新陈代谢极其迅速，而其所需的培养条件很温和，容易达到，其在经济上的优势是显而易见的。根据相关监管机构对来自大肠杆菌生产的生物制品，其宿主DNA的限量为10ng/剂(SFDA)。
关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。
Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。
此外，目前的食品或保健品通常是动物来源、合成来源、植物来源或微生物来源的。然而，动物来源或合成来源的食品或保健品在制备过程中易受污染，例如动物组织中的病毒或化学试剂的残留。因此，通常将植物来源或微生物来源的食品视作天然来源，从而得到的产品在市场上具备更高的售价。为对食品或保健品作溯源，可检测食品或保健品中的大肠杆菌DNA。然而，监管机构对食品或保健品本身的大肠杆菌残留量会有严格的限制，这就要求检测食品或保健品中的大肠杆菌残留DNA的方法或物质手段能够具有高灵敏度，从而既能检测食品或保健品中的大肠杆菌残留DNA是否符合规定，又能证明该食品或保健品是天然来源，即，大肠杆菌来源的。
为了实现高灵敏度检测生物制品中可能的宿主细胞残留DNA，一般选择高度重复序列或多拷贝序列作为检测靶标进行设计引物，如针对CHO细胞设计的各种引物对。但是与CHO的基因组相比，大肠杆菌的基因组相对小很多，因此，适用于哺乳动物细胞，例如CHO细胞的检测引物设计思路往往不适合于大肠杆菌。近年来国内外学者深入研究了细菌的16s rDNA和23s rDNA基因，rDNA序列分析已经成为细菌分类和检测、评价种系关系的一个理想工具。由于16S rDNA和23s rDNA存在属内及属间高度的同源性的现象，很多研究人员把rDNA作为大肠杆菌来源的生物制品的宿主细胞DNA检测的靶序列，其能够达到一定的检测灵敏度。但是，在QPCR扩增体系中所用的绝大多数的DNA聚合酶为大肠杆菌重组酶，因此，QPCR体系中不免存在微量大肠杆菌核糖体DNA，这将导致QPCR阴性孔ct值偏高。
综上所述，本领域急需检测生物制品中大肠杆菌细胞DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于生物制品质量控制或溯源分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测生物制品、食品或保健品中残余大肠杆菌细胞DNA的引物对以及包含所述引物对的检测体系和检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供利用本发明的引物对检测生物制品、优选食品或保健品中残余大肠杆菌细胞DNA的方法。
本发明还有一目的是提供用于设计检测生物制品、食品或保健品中残余大肠杆菌细胞DNA的引物对的多核苷酸序列。
在第一方面，本发明提供一种检测大肠杆菌(E.Coli)细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物结合于大肠杆菌细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-120bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-110bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-100bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者
所述正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述反向引物如SEQ ID NO:7所示。
在第二方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-120bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-110bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-100bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述引物对中的反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者，
所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述引物对中的反向引物如SEQ ID NO:7所示。
在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。
在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4或8所示。
在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为1fg/μl。
在具体的实施方式中，所述检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物、SEQ IDNO:3所示反向引物、SEQ ID NO:4所示探针；或者
SEQ ID NO:6所示正向引物、SEQ ID NO:7所示反向引物、SEQ ID NO:8所示探针。
在第三方面，本发明提供一种检测大肠杆菌细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
在优选的实施方式中，所述方法用于确定食品或保健品是大肠杆菌来源生产的。
在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-120bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-110bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-100bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4或8所示。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。
在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用本发明第一方面所述的引物对扩增目标产物。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-120bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-110bp；或者
所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-100bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在大肠杆菌DNA。
在优选的实施方式中，所述待测对象包括生物制品、食品或保健品。
在优选的实施方式中，所述引物对与检测体系用于确定所述食品或保健品是大肠杆菌来源生产的。
在第七方面，本发明提供SEQ ID NO:1所示序列在设计检测生物制品、食品或保健品中残余大肠杆菌细胞DNA的引物对中的作用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了对不同大肠杆菌菌株的基因组分析比对。
图2显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图3显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图4显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
图5显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
图6显示了CHO干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图7显示了CHO干扰实验的标准曲线。图中：橙色(■)为E.coli标准曲线；蓝色(●)为加入CHO基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图8显示了人干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图9显示了人干扰实验的标准曲线。图中：橙色(■)为E.coli标准曲线；绿色(●)为加入人基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图10显示了毕赤酵母干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ IDNO:2和3所示。
图11显示了毕赤酵母干扰实验的标准曲线。图中：橙色(■)为E.coli标准曲线；粉色(●)为加入毕赤酵母基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图12显示了CHO干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
图13显示了CHO干扰实验的标准曲线。图中：橙色(■)为E.coli标准曲线；蓝色(●)为加入CHO基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
图14显示了人干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
图15显示了人干扰实验的标准曲线。图中：橙色(■)为E.coli标准曲线；绿色(●)为加入人基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
图16显示了毕赤酵母干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对如SEQ IDNO:6和7所示。
图17显示了毕赤酵母干扰实验的标准曲线。图中：橙色(■)为E.coli标准曲线；粉色(●)为加入毕赤酵母基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:6和7所示。
具体实施方式
经过深入而广泛的研究，本发明人出乎意料地发现针对单拷贝的大肠杆菌基因组DNA的SEQ ID NO:1所示区段设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测大肠杆菌细胞基因组DNA，还能区分CHO细胞、毕赤酵母以及人类等干扰性DNA；本发明的引物对还能检测各种大肠杆菌菌株。本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。在此基础上完成了本发明。
本发明的引物对
本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的大肠杆菌细胞基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对大肠杆菌细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于大肠杆菌细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对SEQID NO:1所示区段可以设计多种引物对。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体得到的引物对。
在具体的实施方式中，本发明的正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第45-83位；反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-120bp；或者，本发明的正向引物结合于SEQ IDNO:1所示序列的第660-699位；反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。
在优选的实施方式中，本发明的正向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第53-72位，反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-110bp；或者，本发明的正向引物结合于SEQ IDNO:1所示序列的第670-689位，反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-100bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在最优选的实施方式中，本发明的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者，本发明的正向引物如SEQ ID NO:6所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示。
本发明的引物对在检测大肠杆菌残留DNA时能够同时具备高灵敏度和高特异性，从而既能准确而灵敏地检测产品，例如食品或保健品中的大肠杆菌残留量，进而准确判断该产品是否符合食品或药品监管机构关于食品或保健品中大肠杆菌残留的要求；同时又可以佐证所检测的食品或保健品是大肠杆菌来源，即微生物来源，而非动物来源，例如动物的血制品中提取的或是合成来源的。换言之，本发明的引物对在准确而灵敏地判断某产品是否符合食品或药品监管机构关于其中大肠杆菌残留的要求的同时可以完成对该食品或保健品的溯源工作。
探针
本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。
在具体的实施方式中，本发明的探针如SEQ ID NO:4或8所示。
本发明的检测试剂
本发明还提供一种检测大肠杆菌细胞基因组DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。
在具体的实施方式中，本发明的检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物、SEQ ID NO:3所示反向引物、SEQ ID NO:4所示探针；或者，SEQ ID NO:6所示正向引物、SEQ ID NO:7所示反向引物、SEQ ID NO:8所示探针。
在具体的实施方式中，本发明检测试剂的检测灵敏度达到1fg/μL。
在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测大肠杆菌细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明的引物对或检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在具体的实施方式中，所述方法用于确定食品或保健品是大肠杆菌来源生产的。
在本发明的引物对的基础上，本发明还提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本发明引物对。
在具体的实施方式中，本发明的PCR试剂盒还装有用于实施PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。
在本发明的引物对的基础上，本发明提供利用本发明的引物对扩增目标产物的PCR方法。
用途
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员知晓本发明的引物对或检测试剂可以用于检测待测对象中是否存在大肠杆菌DNA。在具体的实施方式中，所述待测对象包括生物制品、食品或保健品。
本发明的引物对或检测试剂能够高灵敏度地检测食品或保健品中的大肠杆菌残留DNA，从而既能证明所检测的食品或保健品符合监管机构的规定，又能证明该食品或保健品是天然来源，即，大肠杆菌来源的。因此，在优选的实施方式中，本发明的引物对与检测体系用于确定所述食品或保健品是大肠杆菌来源生产的。
本发明的优点包括:
1.本发明的引物对或检测试剂能够高度灵敏地检测大肠杆菌细胞基因组DNA；
2.本发明的引物对或检测试剂能够区分CHO细胞、毕赤酵母以及人类等干扰性DNA；
3.本发明的引物对或检测试剂能够检测各种大肠杆菌菌株；
4.本发明的检测方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。
5.本发明的引物对或检测试剂以及检测方法能够在检测食品护保健品是否符合食品或药品监管机构关于大肠杆菌残留的要求的同时对食品或保健品进行溯源，以便验证食品或保健品是否天然来源的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料与方法
1.样本处理试剂：(柱纯化回收)包括蛋白酶K 20mg/ml，预处理缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，结合柱，收集管，1.5ml离心管。
2.DNA检测体系：
2x Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本发明引物及探针等成分。
掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液
3.检测仪器：ABI 7500。
4.实验操作及过程
4.1基因组DNA提取纯化(根据试剂盒说明书操作步骤进行)
1)在1.5ml离心管中加入20μl Proteinase K(具体体积根据样本大小可调整)。
2)加入样本，加入200μl缓冲液GB，抽打混匀或振荡混匀。
3)将离心管置于56℃，直至组织完全消化。
4)每孔加入200μl无水乙醇，抽打混匀或振荡混匀，室温放置5分钟。
5)每孔加入15μl磁珠悬浮液B，抽打混匀或振荡混匀。
6)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
7)将离心管从磁力架上取下，加入500μl缓冲液GD，抽打混匀或振荡混匀。
8)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
9)将离心管从磁力架上取下，加入600μl漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀。
10)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
11)重复操作步骤9、10，液体尽量去除干净。
12)离心管于磁力架上，室温晾干10-15分钟。
13)将离心管从磁力架上取下，加入50-100μl洗脱液TB，抽打混匀振荡混匀，置于56℃，孵育10分钟。
14)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。
4.2检测
4.2.1准备工作：
购买自中国食品药品检定研究院的E.coli细胞基因组DNA(96.2ng/μL，批号270027-201101)为标准品，用超纯水梯度稀释成以下5个浓度梯度，分别为100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL。NTC为无样本阴性质控(DNA稀释液)。
检测体系：30ul
20μL Taqman mix+10μL样品＝30μL
实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中大肠杆菌细胞DNA的量。
实施例1.
发明人根据SEQ ID NO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：
29B-103F：GAAAGTAACACCAGCGTGCG(SEQ ID NO:2)；
29B-103R：CCAATGCATTAACGCTGGCA(SEQ ID NO:3)；
探针，T29B-103：CGGTGCTGCGACGGCGGAGT(SEQ ID NO:4)；
扩增产物：GAAAGTAACACCAGCGTGCGCATCAGCAGTGACAACGACTTAAACGGTGCTGCGACGGCGGAGTAGAGTACGCAGCTAATTGCTGCCAGCGTTAATGCATTGG(SEQ ID NO:5)。
发明人通过QPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，
QPCR体系为：18.2μL mix+0.6μL正向引物(29B103F)+0.6μL反向引物(29B103R)+0.6μL探针T29B103+10μL DNA；
QPCR标准曲线为：大肠杆菌DNA标准品浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。
实验结果如图2和图3所示。其中图2是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图3是参考品标准曲线。由图3可知，当参考品浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.52，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为92.35％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到1fg/μl。
实施例2.
发明人根据SEQ ID NO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：
29B-94F：AATCACCCCCTCATGTGCTG(SEQ ID NO:6)；
29B-94R：GAAAAACATGCACGCCCGAT(SEQ ID NO:7)；
探针T29B-94：CACGAATGGCATCGTTTGTTTCAGGCTG(SEQ ID NO:8)；
扩增产物：AATCACCCCCTCATGTGCTGCACGAATGGCATCGTTTGTTTCAGGCTGCCAGAGTAAACTGGCATGTTCCAGTAATCGGGCGTGCATGTTTTTC(SEQ IDNO:9)。
发明人通过QPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，
QPCR体系(30μL)为：18.2μL mix+0.6μL正向引物(29B94F)+0.6μL反向引物(29B94R)+0.6μL探针T29B94+10μL DNA；
QPCR标准曲线：大肠杆菌DNA标准品浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。
实验结果如图4和图5所示。其中图4是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图5是参考品标准曲线。由图5可知，当参考品浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.36，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为98.44％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到1fg/μl。
实施例3.
干扰实验：
步骤：
用DNA稀释液将大肠杆菌DNA梯度稀释成浓度为200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL五个浓度梯度。将CHO/人/毕赤酵母三种干扰DNA稀释成浓度为2ng/μL。(CHO DNA来源中国食品药品检定研究院；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院,用takara基因提取试剂盒提取；毕赤酵母细胞来源中国食品药品检定研究院,用takara基因提取试剂盒提取)
QPCR体系：
18.2μL mix+0.6μL正向引物-29B103F+0.6μL反向引物-29B103R+0.6μL探针T29B103+5μL大肠杆菌DNA+5μL H2O/CHO/人/毕赤酵母DNA
实验结果如下表所示：
| DNA | R2 | slope | E |
| 大肠杆菌+H2O | 0.999 | -3.306 | 100.7％ |
| 大肠杆菌+CHO | 0.998 | -3.295 | 101.1％ |
| 大肠杆菌+人 | 0.998 | -3.095 | 110.4％ |
| 大肠杆菌+毕赤酵母 | 0.999 | -3.202 | 105.3％ |
实验结果如图6～图11所示。从产生的曲线可以看出，CHO/人/毕赤酵母DNA污染对SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的检测结果明显没有造成影响。该引物对具备优异的特异性。
实施例4.
干扰实验：
步骤：
用DNA稀释液将大肠杆菌DNA梯度稀释成浓度为200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL五个浓度梯度。将CHO/人/毕赤酵母三种干扰DNA稀释成浓度为2ng/μL。
QPCR体系：
18.2μL mix+0.6μL正向引物-29B94F+0.6μL反向引物-29B94R+0.6μL探针T29B94+5μL大肠杆菌DNA+5μL H2O/CHO/人/毕赤酵母DNA
实验结果如下表所示：
| DNA | R2 | slope | E |
| 大肠杆菌+H2O | 0.998 | -3.174 | 106.5％ |
| 大肠杆菌+CHO | 0.999 | -3.205 | 105.1％ |
| 大肠杆菌+人 | 0.999 | -3.334 | 99.5％ |
| 大肠杆菌+毕赤酵母 | 0.997 | -3.077 | 111.3％ |
实验结果如图12～图17所示。从产生的曲线可以看出，CHO/人/毕赤酵母DNA污染对SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示引物对的检测结果明显没有造成影响。该引物对具备优异的特异性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种检测大肠杆菌(E.Coli)细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物结合于大肠杆菌细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者
所述正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述反向引物如SEQ ID NO:7所示。
3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。
4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述引物对中的反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者，
所述引物对中的正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述引物对中的反向引物如SEQ ID NO:7所示。
5.如权利要求3或4所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含探针。
6.如权利要求5所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含SEQ ID NO:2所示正向引物、SEQ ID NO:3所示反向引物、SEQ ID NO:4所示探针；或者
SEQ ID NO:6所示正向引物、SEQ ID NO:7所示反向引物、SEQ ID NO:8所示探针。
7.一种检测大肠杆菌细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-6中任一项所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
8.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1或2所述的引物对。
9.一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对扩增目标产物。
10.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-6中任一项所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在大肠杆菌DNA。
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| CN111334596A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-06-26 | 天津欧德莱生物医药科技有限公司 | 一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒 |
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