CN103834745B - 大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 - Google Patents

大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法。本发明要解决的技术问题是为分析大曲中乳酸菌和芽孢杆菌提供一种新选择。本发明的技术方案是大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，包括如下步骤：a、标准曲线的制备；b、提取基因组DNA；c、扩增；d、定量分析。本发明方法可用于分析窖泥中的乳酸菌和芽孢杆菌的变化趋势。

Description

大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法。
背景技术
大曲是一种以小麦为主要原料制成的体积较大并含有多菌酶类的区块，并作为糖化剂与发酵剂应用于白酒酿造过程中。俗语说：“有美酒必备佳曲”，“曲为酒骨”，由此可以知大曲对白酒酿造的重要性。大曲的制作到成曲的贮存，都是一个开放作业的过程，环境中的微生物参与了大曲制作的整个过程，在不同微生物的生长代谢作用下，大曲逐渐成为含有微生物菌系、微生物酶系和复合香味物质的微生态制品。因此，大曲中微生物的种类与数量是影响大曲质量的重要因素。前期研究者采用传统培养、现代分子生物学技术等方法，对大曲中微生物群落结构进行分析和研究，发现乳酸菌（Lactobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）是大曲微生物菌群中的优势功能菌，但对这两类微生物在发酵过程中的动态变化情况不清楚。因此阐明发酵过程中乳酸菌和芽孢杆菌生物量的动态变化，对大曲制作过程中的质量控制、白酒酿造过程中酒醅微生物群落的形成以及白酒风味物质的形成都具有重要的意义。
传统对大曲中微生物定量检测，仍采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法，但是，该方法受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种用于定量检测大曲制作过程中乳酸菌、芽孢杆菌生物量的动态变化的方法。
本发明的技术方案是大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，包括如下步骤：
a、标准曲线的制备：设计针对乳酸菌和芽孢杆菌标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；
b、提取基因组DNA：利用液氮研磨、酶消化结合的方法提取大曲微生物群落的总DNA；
c、扩增：采用乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物，以大曲微生物群落的总DNA为模板，对乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行特异性扩增；
d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌进行定量分析。
具体的，步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
具体的，步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。
乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：
Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG（SEQIDNo.1）；
Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC（SEQIDNo.2）。
芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）：
Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT（SEQIDNo.3）；
Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC（SEQIDNo.4）。
具体的，步骤a的操作如下：从大曲微生物群落中的筛选到乳酸菌、芽孢杆菌标准菌，分别设计特异性引物，通过细菌DNA提取试剂盒提取筛选得到的乳酸菌（Lactobacilluscrustorum）、芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）的DNA，分别利用设计的特异性引物对两种微生物的DNA进行扩增，得到特异性目的片段，再将目的片段与与TA克隆载体连接，获得重组质粒，再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，然将此高浓度质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR获得标准曲线。
具体的，步骤a和c中的荧光定量PCR扩增体系：总体积25μL，体系包括2.5μL10×Buffer（含有Mg2+），2μL25mmol/LdNTP混合物，0.2μL1UTaqDNA聚合酶，1μL10μmol/L引物（正向、反向），DNA模板用量为1μL，用ddH2O补足至25μL。
具体的，步骤a和c中的荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性4min后，进入30个循环，95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。
具体的，步骤b中利用液氮研磨、酶消化结合的方法操作如下：称取1g大曲样本，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50mL的离心管中。转入离心管加入1mLCTAB抽提液（2%CTAB、5mol/LNaCl、1mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.5mol/LEDTA）和20μL巯基乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL20mg/mL蛋白酶k，37℃220r/min30min，室温6000×g离心10min，收集上清（1mL）加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇，抽提一次，12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇12000rpm离心10min，取上清，重复两次；上清液加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min，倒掉液体；沉淀用70%乙醇洗涤，12000r/min离心10min；洗涤后的DNA吹干后TE溶解，-20℃冰箱保存备用；其中所述的CTAB抽提液配方为2%CTAB、5mol/LNaCl、1mol/LpH8.0的Tris-HCl、0.5mol/LEDTA；Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇的体积比25︰24︰1；氯仿-异戊醇的体积比24︰1。
本发明建立了渐变、快速、准确的大曲中主要功能微生物的定量方法，以简化大曲中功能微生物的检测程序、提高检测效率，加强对大曲中主要微生物的监控，为大曲风味物质的形成、白酒酿造过程中酒醅微生物群落的形成以及白酒风味物质的形成机理提供了技术支持。本发明运用荧光定量PCR技术对大曲生产过程中的优势微生物—乳酸菌、芽孢杆菌进行定量分析，并得到这两类微生物在大曲发酵和贮存阶段的生物量变化情况。
附图说明
图1大曲样品中乳酸菌拷贝数的动态变化曲线
图2大曲样品中芽孢杆菌拷贝数的动态变化曲线
图1和图2中X轴天数表示大曲生产天数和储存天数
具体实施方式
在本发明中，荧光定量PCR采用Bio-Rad专用定量PCR试剂SsoFastEvaGreen预混液，该预混液使用专利的Sso7d融合蛋白技术，在广泛的定量PCR应用中有卓越的表现。通过新型的热启动工程融合聚合酶结合优化的缓冲液和ROX惰性参照染料，在短时间内可以获得重复性更好，灵敏度更高的定量PCR结果。饱和的荧光染料EvaGreen能有效增强其与双链DNA结合的强度和反应灵敏度，确保了最好的扩增效率，灵敏性和重复性，同时荧光强度相较于SYBRGreen更高。
实施例1标准曲线的制备
1、合成针对于乳酸菌、芽孢杆菌的特异性引物，并对大曲中筛选的乳酸菌、芽孢杆菌进行特异性扩增
乳酸菌特异性引物序列（5′→3′）：
Lacto-F：AGAACACCAGTGGCGAAGG
Lacto-R：CAGGCGGAGTGCTTAATGC
芽孢杆菌特异性引物序列（5′→3′）
Bacil-F：ATGGCTGTCGTCAGCT
Bacil-R：ACGGGCGGTGTGTAC
2、大曲中乳酸菌、芽孢杆菌的筛选及标准菌株的确定：
a.乳酸菌的筛选：
乳酸菌的筛选培养基：葡萄糖2%w/w，蛋白胨1%w/w，牛肉膏1%w/w，酵母提取物0.5%w/w，K2HPO40.2%w/w，柠檬酸三铵0.2%w/w，乙酸钠0.5%w/w，吐温800.1%v/v，MgSO4·7H2O0.05%w/w，MnSO4·4H2O0.025%w/w，pH6.2～6.4，琼脂1.5%w/w，121℃，20min灭菌后，加入灭菌的CaCO3溶液2%v/v。
取1g大曲样品梯度稀释至10-6，稀释涂布，37℃培养48h，挑选产生溶钙圈的菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16SrDNA鉴定，-20℃甘油管保存。
b.芽孢杆菌的筛选：
芽孢杆菌筛选培养基：胰蛋白胨1%w/w，酵母提取物0.5%w/w，氯化钠（NaCl）1%w/w，琼脂1.5%w/w，pH7.2～7.4，121℃，20min灭菌。
取1g大曲样品制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释至10-5，稀释涂布，37℃培养48h，挑选生长菌落，多次分离纯化，镜检得到纯种，16SrDNA鉴定，-20℃甘油管保存。
选取筛选的1株乳酸菌（Lactobacilluscrustorum）、1株芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）作为标准菌株，利用细菌DNA提取试剂盒对2种微生物的DNA进行提取。
3、得到特异性扩增目的片段
分别以2株纯菌的DNA为模板，以Lacto-F/Lacto-R、Bacil-F/Bacil-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系：总体积25μL，体系包括2.5μL10×Buffer（含有Mg2+），2μL25mmol/LdNTP混合物，0.2μL1UTaqDNA聚合酶，1μL10μmol/L引物（正向、反向），DNA模板用量为1μL，用ddH2O补足至25μL。
PCR反应程序为：95℃预变性4min后，进入30个循环，95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。
扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，乳酸菌目的片段大小为170bp、芽孢杆菌的目的片段大约为300bp，并将PCR产物割胶回收。
4、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备
挑取JM109平板上单菌落至5mLLB培养基中，37℃、220rpm培养过夜；将过夜培养的种子液以2%的接种量转接入15mLLB培养基中，37℃、220rpm培养1.5h左右至OD600为0.3～0.5之间；分装1mL菌液至1.5mL离心管中，冰浴20min后迅速离心，4℃、5000rpm离心10min；彻底弃去上清，加入400μL0.1mol/L预冷的CaCl2溶液重悬菌体，再冰浴30min；4℃、5000rpm离心10min，弃去上清液，倒置1min；用80μL0.1mol/L预冷的CaCl2溶液重悬菌体，冰上放置30min。
5、重组质粒的构建
将pMD19-TVector和目的片段以1︰3比例连接，16℃连接过夜，然后将连接产物转化JM109感受态大肠杆菌细胞，然后将已转化的感受态大肠杆菌细胞涂布于含有氨卞青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培养12～16h，挑取阳性菌落，于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的液体LB培养基中震荡培养，37℃培养8～10h。用培养的菌液提取质粒，在此利用设计的引物进行质粒扩增验证，如果琼脂糖凝胶在170bp、300bp左右有可见的目的条带，可以确定目的片段已成功插入pMD19-TVector，将其提取的质粒做10倍比稀释，测定OD值，取平均值计算拷贝数，具体计算公式如下：
其中：C标–DNA模板浓度（拷贝/μL)
A–0.05，换算系数，即1OD260nm=0.05μg/(μL双链DNA)
N–稀释倍数
6.02×1023–阿佛加德罗常数。
6、荧光定量PCR反应体系与反应条件如表1和表2所示：
表1荧光定量PCR反应体系
SsoFast EvaGreen预混液 10μL
正向引物 1μL
反向引物 1μL
模板DNA 10ng
ddH2O 至20μL
表2荧光定量PCR的反应条件
95℃ 预变性30s
95℃ 变性5s
55℃ 退火15s
55℃读取荧光信号数据，共循环扩增40次。
熔解曲线绘制，从65℃升温至95℃，每隔0.5℃读一次板，维持0.05s。
乳酸菌Real-timePCR熔解曲线，在84℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。对于乳酸菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在2.44×104～2.44×1011拷贝/μL范围时，乳酸菌Real-timePCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区能够汇于一起，线性范围比较宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3411x+14.07,线性相关系数为0.9978，具有较好的线性关系，根据公式E=10-k-1(k-标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为1.19，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。
芽孢杆菌Real-timePCR熔解曲线，在88℃左右出现单一的熔解峰，无引物二聚体及非特异性产物，曲线平稳，峰尖且窄，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。对于芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，检测拷贝数在2.18×104～2.18×1011拷贝/μL范围时，芽孢杆菌Real-timePCR的扩增曲线为一组典型的倒S曲线，该组扩增曲线基线平整，指数区较明显且陡度大，平台区基本能够汇于一起，线性范围也很宽。质粒标准品的浓度越高，循环阈值CT越低。该标准曲线的线性方程是y=-0.3387x+13.152,线性相关系数为0.9974，具有较好的线性关系，根据公式E=10-k-1(k-标准曲线的斜率)，算得Real-timePCR的扩增效率为1.18，在0.8～1.2之间，扩增效率理想。
实施例2大曲微生物群落中微生物总DNA的提取
1、大曲样品采集
采集大曲样品，样品采集后如不能及时提取DNA应立即放入-80℃冰箱保存。
2、大曲中微生物总DNA提取
称取1g大曲样本，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50mL的离心管中。转入离心管加入1mLCTAB抽提液（2%CTAB、5mol/LNaCl、1mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.5mol/LEDTA）和20μL巯基乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL蛋白酶k（20mg/mL），37℃220r/min30min，室温6000×g离心10min，收集上清（1mL）。
加入等体积Tris-饱和酚（500μL）与氯仿-异戊醇（体积比24︰1）（500μL），抽提一次，12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇（24︰1）12000rpm离心10min，取上清，重复两次。上清液加入0.6体积预冷的异丙醇-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min，小心倒掉液体。沉淀用70%乙醇洗涤数次，12000r/min10min。洗涤后的DNA用吹风吹干后TE溶解，用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10kb左右出现条带，则DNA提取成功，将成功提取的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。
实施例3大曲微生物群落中乳酸菌、芽孢杆菌的定量分析
大曲样品中乳酸菌的定量：使用实施例2中获得的大曲总DNA，使用实施例1中乳酸菌、芽孢杆菌的特异性引物。按照实施例1中的荧光定量PCR反应体系和PCR程序进行大曲荧光定量PCR分析。
根据由乳酸菌标准样品荧光定量PCR，得到的线性方程y=-0.3411x+14.07(R2=0.9978)计算不同时间点大曲样品中乳酸菌的拷贝数，从而能够得到大曲中乳酸菌生物量的变化趋势(如图1所示注：图1所示X轴天数表示大曲生产和储存天数)。
大曲样品中芽孢杆菌的定量：根据由芽孢杆菌标准样品荧光定量PCR得到的线性方程y=-0.3387x+13.152(R2=0.9974)计算不同时间点大曲样品中芽孢杆菌的拷贝数，从而能够得到大曲中芽孢杆菌生物量的变化趋势(如图2所示)。

Claims (3)

1.大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、标准曲线的制备：设计针对乳酸菌和芽孢杆菌标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建标准曲线；
b、提取基因组DNA：利用液氮研磨、酶消化结合的方法提取大曲微生物群落的总DNA；所述利用液氮研磨、酶消化结合的方法提取大曲微生物群落的总DNA的具体步骤如下：称取1g大曲样本，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50mL的离心管中；转入离心管加入1mLCTAB抽提液和20μL巯基乙醇至离心管中，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入5μL20mg/mL蛋白酶k，37℃220r/min30min，室温6000×g离心10min，收集1mL上清加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇，抽提一次，12000rpm离心10min，取上清加入等体积氯仿-异戊醇12000rpm离心10min，取上清，重复两次；上清液加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min，倒掉液体；沉淀用70%乙醇洗涤，12000r/min离心10min；洗涤后的DNA吹干后TE溶解，-20℃冰箱保存备用；其中所述CTAB抽提液的配方为2%CTAB、5mol/LNaCl、1mol/LpH8.0的Tris-HCl、0.5mol/LEDTA；Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇的体积比25∶24∶1；氯仿-异戊醇的体积比24∶1；
c、扩增：采用乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物，以大曲微生物群落的总DNA为模板，对乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行特异性扩增；
d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌进行定量分析；
步骤a和c中所述扩增乳酸菌的特异性引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；
步骤a和c中所述扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。
2.如权利要求1所述的大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于：步骤a的操作如下：从大曲微生物群落中筛选到乳酸菌、芽孢杆菌标准菌，分别设计特异性引物，通过细菌DNA提取试剂盒提取筛选得到的乳酸菌、芽孢杆菌的DNA，分别利用设计的特异性引物对两种微生物的DNA进行扩增，得到特异性目的片段，再将目的片段与TA克隆载体连接，获得重组质粒，再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，然后将此高浓度质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR获得标准曲线。
3.如权利要求1或2所述的大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于：步骤a和c中的荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性4min后，进入30个循环，95℃1min；55℃1min；72℃1min，最后72℃延伸10min。
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