CN103045725A - 一种同时检测醋醅中四种功能微生物的多重pcr技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测醋醅中四种功能微生物的多重PCR技术，属于生物工程技术领域。该方法简便、经济、高效，在同一PCR反应管内能对多种微生物同时检测，是研究复杂微生物群落有效的技术手段之一。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于检测醋醅微生物群落中功能微生物的多重PCR技术。
背景技术
我国食醋的生产历史悠久，但众多的食醋生产厂家的发酵过程都以传统的经验为主，工艺可控性较差，并且产品品质存在批次差异，尤其是风味差异较大。这主要是由于酿造过程中微生物复杂多样，对醋醅发酵过程中的微生物作用机制不清楚。中国食醋的酿造工艺是多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的代谢作用产生风味饱满、酸味柔和的食醋。食醋的生产中有两个主要的发酵阶段：酒精发酵和醋酸发酵。在酒精发酵阶段，淀粉质原料如糯米、高粱等经过霉菌和酵母菌的一系列代谢，最终生成酒精；而在醋酸发酵阶段是包括醋酸菌、乳酸菌以及芽孢杆菌在内的众多细菌起主要的作用，该阶段是决定食醋风味和品质的关键步骤。前期研究结果表明醋酸菌、乳酸菌以及芽孢杆菌是醋酸发酵过程的功能微生物，并且其丰度之和在整个细菌群落中占到90%以上，但是对于功能微生物在发酵过程中的动态变化情况还不清楚，快速阐明发酵过程中醋酸菌、乳酸菌以及芽孢杆菌等功能微生物的动态变化对于控制食醋发酵过程以及提高产品的风味具有重要的生产意义。有鉴于此，探索和引入新的技术方法和手段以全面地了解传统酿造系统中的微生物种类，进而阐明酿造过程中微生物的作用机制，已成为重新认识和改造传统产业的迫切需求。
多重PCR(multiplex PCR) 又称多重引物PCR或复合PCR，是PCR技术的一种，是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，同时扩增多个目的基因或DNA序列。多重PCR可以扩增一个物种的一个片段也可以同时扩增多个物种的不同片段。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有食醋固态酿造分析技术的不足，提供了一种多重PCR技术用于同时检测食醋酿造过程中多种功能微生物，该方法简便高效，在同一PCR条件下能对多种微生物进行同时检测。
本发明的目的通过以下方案实现：
1、醋醅微生物群落中功能微生物的确定：利用分子生态技术—DGGE解析醋醅中微生物群落的结构，并结合与食醋自身品质相关的理化参数确定食醋酿造过程中的功能微生物为一种醋酸菌，一种芽孢杆菌和两种乳酸菌。
2、醋醅群落中功能微生物的纯培养：采用微生物纯培养技术从醋醅中获得酿醋功能性微生物菌株。
3、多重PCR技术的建立：针对醋醅群落中的4种功能性微生物设计特异性引物，以纯菌基因组DNA为模板，对四重PCR的反应体系和反应程序进行优化，最终实现在同一PCR条件下对醋醅微生物群落中的4种功能微生物同时进行检测。
该方法简便、经济、高效，在同一PCR反应管内能对多种微生物同时检测，是研究复杂微生物群落有效的技术手段之一。
具体实施路线如下：
1、醋醅微生物群落总基因组DNA的提取：称正常发酵过程的醋醅2-5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化等步骤提取总基因组DNA。
2、合成细菌16S rDNA V3区引物P1，P2，并以醋醅群落微生物总DNA为模板进行PCR扩增，得到细菌16S rDNA V3区的扩增片段，所述的引物P1、P2的序列为：P1：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’；P2：5’-[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。
3、利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)对细菌16S rDNA V3区扩增片段进行分析，其电泳条件为：8%聚丙烯酰胺凝胶，30%~50%变性梯度（100%变性剂浓度为7M尿素，40%甲酰胺），上样量为200 ng，缓冲液为1xTAE，60℃，200V电压电泳3.5-4 h，SYBRGreen Ⅰ染色45 min。
4、优势微生物的序列测定：选择DGGE凝胶上10-20个最显著的条带，割胶回收进行序列分析，在NCBI中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属。
5、功能微生物的筛选：以醋醅为筛选对象，采用3种不同的培养基(肉汤，GYC，MRS)对不同功能微生物进行分离，选择生长较快、菌落形态不同、且GYC平板上有透明圈的60-80个菌落，纯化后保存。
所述的培养基组成为：
肉汤培养基（g/100 mL）：葡萄糖2.5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉0.5，氯化钠0.3，琼脂2.0，pH 7.0-7.2用前加入5 mL无水乙醇；
MRS培养基（g/100 mL）：胰蛋白胨 1，牛肉膏1，酵母粉 0.5， 磷酸氢二钾 0.2，乙酸钠 0.5，柠檬酸三铵 0.2，葡萄糖 2，七水硫酸镁 0.058，一水硫酸锰 0.019， 吐温80 0.1mL， pH 6.2-6.5， 固体培养基加入琼脂1.5-2.0，用前加入5 mL无水乙醇；
GYC培养基（g/100 mL）：葡萄糖 1，无水乙醇 3，酵母粉 1，碳酸钙 1.5。
6、功能微生物的确定：对上述获得的纯培养微生物进行酶切酶切分型，将分型结果不同的菌株进行16S rDNA 测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择4株优势微生物用于多重PCR技术。
7、针对上述4株功能微生物菌株设计特异性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢杆菌、一株醋酸菌和两株乳酸菌，所述的功能微生物的特异性引物序列为下表所示。
8、对4株功能微生物的多重PCR条件进行组合优化：包括反应体系的确定，反应条件的优化，最终使得4种微生物在同一PCR条件下同时被检测出来。
所述的反应体系为50 uL体系，具体如下。
| 1×Ex PCR buffer(含dNTP) | 10 mL |
| Mg2+（25 mM） | 4 μL |
| Ex Taq酶(5 U/μL) | 0.5 μL |
| 正向引物 | 2 mL |
| 反向引物 | 2 mL |
| Template DNA | 10 ng |
| ddH2O | 至50 mL |
所述的反应条件为下表所示。
9、利用上述确定的多重PCR条件，对发酵过程中醋醅样品中的功能微生物进行快速检测。
附图说明
图1 醋醅微生物群落的DGGE分析图谱。
图2 四株功能微生物特单独PCR与四重PCR的电泳图谱。
图3 食醋酿造过程中醋醅微生物群落中功能微生物的电泳图谱。
具体实施方式
实施例1：醋醅微生物群落总DNA的提取。
1、样品采集：采集食醋发酵过程中不同时间点的醋醅样品，样品采集后如不能及时提取DNA应立即进行冷冻处理。
2、醋醅中微生物总DNA提取方法：称取2 g醋醅，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50 mL离心管。向离心管中加入6 mL DNA抽提缓冲液和100μL溶菌酶（50 mg/mL），于225 rpm摇床上37℃摇动30 min。向离心管中加入1.5 mL 10%SDS，65℃水浴2 h，每隔15-20 min轻轻颠倒几下，室温6000×g离心10min。收集上清；用等体积的氯仿-异戊醇（24:1,V/V）抽提一次，以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀l h，16000×g离心20 min，收集核酸沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μL TE中，加入终浓度为0.5μg/mL RNaseA，并在37℃下水浴消化2 h，以去除RNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10 kb左右出现条带，则DNA提取成功。
实施例2：PCR-DGGE技术解析醋醅微生物群落的结构。
1、PCR扩增
以上述提取的醋醅群落基因组DNA为模板，以细菌 16S rDNA V3区的引物P1、P2进行PCR扩增，目的片段约196 bp，该片段对应了E.coli 16S rDNA 341到534的位点，引物序列为：P1：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’；P2：5’-[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’；PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检验，并用DyNA QuantTM 200浓度仪测定DNA浓度。
2、DGGE分析
DGGE采用Bio-Rad Dcode系统进行电泳分析，其电泳条件为：8%聚丙烯酰胺凝胶，30%～50%变性梯度，DNA上样量为200 ng。电泳缓冲液为1×TAE，温度为60℃，200 V电压电泳3.5-4 h，SYBR GreenⅠ染色45 min （15 min×3次），UVP2GDS8000凝胶成像系统(Ultraviolet Product L.td)成像，胶图如图1所示。
3. 割胶测序
对图1中的各条带进行割胶测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对确定各条带所代表的种属，结果如表1所示。
表1 醋醅微生物群落微生物的鉴定结果
| 编号 | 菌株 |
| A | Lactobacillus sp. |
| B | Lactobacillus helveticus |
| C | Lactobacillus crispatus |
| D | Lactobacillus panis |
| E | Acetobacter pasteurianus |
| F | Lactobacillus pontis |
| G | Lactobacillus homohiochii |
| H | Lactobacillus fructivorans |
实施例3：醋醅微生物群落中功能性微生物的筛选。
1、醋醅中微生物的分离纯化：取5 g醋醅样品装入混有玻璃珠和45 mL无菌水的250 mL三角瓶中，在37℃摇床上以120 rpm振荡30 min，然后取菌悬液1 mL用无菌生理盐水适当稀释后分别在GYC平板、MRS平板和肉汤培养基平板上进行涂布，37℃ 培养48～72 h；根据菌落生长情况，选择不同菌落形态的并且在GYC平板有较大透明圈的菌落，共得到60-80株菌，继续纯化后保藏。
2、纯化菌株的酶切分型：对上述菌株进行16S rDNA扩增，扩增产物用限制性内切酶Hinf Ⅰ和Csp6Ⅰ进行消化酶切，用1.5%的琼脂糖进行电泳分离，比较各个菌株的条带类型，将带型相同的菌株归为一类，然后将每个带型选一个代表进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对确定各条带型所代表的微生物种类。
3、将纯菌酶切分型后的测序结果与DGGE条带的测序结果结合，确定4株功能性微生物定分别为巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）和蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。
上述培养基的组成为：
肉汤培养基（g/100 mL）：葡萄糖2.5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉0.5，氯化钠0.3，琼脂2.0，pH 7.0-7.2，用前加入5 mL无水乙醇；
MRS培养基（g/100 mL）：胰蛋白胨 1，牛肉膏1，酵母粉 0.5， 磷酸氢二钾 0.2，乙酸钠 0.5，柠檬酸三铵 0.2，葡萄糖 2，七水硫酸镁 0.058，一水硫酸锰 0.019， 吐温80 0.1mL， pH 6.2-6.5，琼脂1.5-2.0。用前加入5 mL无水乙醇；
GYC培养基（g/100 mL）：葡萄糖 1，无水乙醇 3，酵母粉 1，碳酸钙 1.5。
实施例4：用于检测醋醅群落中功能微生物的多重PCR方法的建立。
1、针对醋醅中4株功能微生物设计特异性引物，引物序列具体如下表。
2、多重PCR条件的优化
采用正交优化的4因素3水平优化方式，具体如下表。
正交优化的具体实验组设计如下表。
3、多重PCR的优化结果
通过上述正交实验，得到最佳反应体系和反应条件。所述的反应体系为50 uL体系，具体如下表。
| 1×Ex PCR buffer(含dNTP) | 10 mL |
| Mg2+（25 mM） | 4 μL |
| Ex Taq酶(5 U/μL) | 0.5 μL |
| 正向引物 | 2 mL |
| 反向引物 | 2 mL |
| Template DNA | 10 ng |
| ddH2O | 至50 mL |
所述的反应条件为下表所示。
实施例5：利用建立的多重PCR方法同时检测食醋发酵过程中醋醅群落中功能微生物。
1、醋醅样品的采集
采集食醋发酵过程中不同时间点的醋醅样品，样品采集后如不能及时提取DNA应立即进行冷冻处理。
2、醋醅微生物群落总基因组DNA的提取
称正常发酵过程的醋醅2-5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化等步骤提取总基因组DNA。
3、多重PCR技术用于检测醋醅群落中的功能微生物
以上述提取的基因组总DNA为模板，以四种功能微生物的特异性引物为扩增引物，在优化的反应体系和反应条件下进行多重PCR扩增，扩增产物用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳图谱如图3所示。
Claims (6)
1.一种用于醋醅中四种功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于多重PCR技术按照以下步骤进行：
（1）醋醅微生物群落总基因组DNA的提取：称正常发酵过程的醋醅2-5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化步骤等提取总基因组DNA；
（2）合成细菌16S rDNA V3区引物P1，P2，并以醋醅群落微生物总DNA为模板进行PCR扩增，得到细菌16S rDNA V3区的扩增片段；
（3）利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)对细菌16S rDNA V3区扩增片段进行分析，其电泳条件为：8%聚丙烯酰胺凝胶，100%变性剂浓度为7M尿素、40%甲酰胺，采用30%~50%变性梯度，上样量为200 ng，缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳3.5-4 h，SYBRGreen Ⅰ染色，每15 min 染色一次，共染3次；
（4）优势微生物的序列测定：选择DGGE凝胶上10-20个最显著的条带，割胶回收进行序列分析，在NCBI中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属；
（5）功能微生物的筛选：以正常发酵的醋醅为筛选对象，采用肉汤、GYC、MRS 3种不同的培养基对不同功能微生物进行分离，选择生长较快、菌落形态不同、且GYC平板上有透明圈的60-80个菌落，纯化后保存；
（6）功能微生物的确定：对上述获得的纯培养微生物进行酶切分型，将分型结果不同的菌株进行16S rDNA 测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择4株优势微生物用于多重PCR技术；
（7）针对上述4株功能微生物菌株设计特异性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢杆菌、一株醋酸菌和两株乳酸菌；
（8）对4株功能微生物的多重PCR条件进行组合优化：包括反应体系的确定，反应条件的优化，最终使得4种微生物在同一PCR条件下同时被检测出来；
（9）利用上述确定的多重PCR条件，对发酵过程中醋醅样品中的功能微生物进行快速检测。
2.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，所述步骤（2）中的引物序列如下所示：
P1：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’
P2：5’-[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。
3.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，所述步骤（5）中培养基如下所述：
肉汤培养基（g/100 mL）：
葡萄糖2.5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉0.5，氯化钠0.3，琼脂2.0，pH 7.0-7.2，用前加入5 mL无水乙醇；
MRS培养基（g/100 mL）：
胰蛋白胨 1，牛肉膏1，酵母粉 0.5， 磷酸氢二钾 0.2，乙酸钠 0.5，柠檬酸三铵 0.2，葡萄糖 2，七水硫酸镁 0.058，一水硫酸锰 0.019，吐温80 0.1mL，琼脂1.5-2.0，pH 6.2-6.5，用前加入5 mL无水乙醇；
GYC培养基（g/100 mL）：
葡萄糖 1，无水乙醇 3，酵母粉 1，碳酸钙 1.5，琼脂1.5-2.0。
4.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤（7）中所述的特异性引物，其序列是如下表所示。
5.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤（8）中所述的多重PCR的最优反应体系采用50μL体系，具体如下：1×Ex PCR buffer(含dNTP) 10 μL；Mg2+（25 mM）4 μL；Ex Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL；正向引物2 μL；反向引物2 μL；Template DNA10 ng；ddH2O至50 μL。
6.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤（8）中所述的多重PCR的最优反应条件如下：预变性94℃5 min；变性94℃30s，退火64-51℃45s，延伸72℃1min，共26个循环，其中退火温度每个循环降低0.5℃；变性94℃30s，退火51℃45s，延伸72℃1min，共15个循环；终延伸72℃10min。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103045725A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468802A (zh) * | 2013-09-02 | 2013-12-25 | 四川大学 | 一种筛选细菌新菌种的方法 |
| CN103834745A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-06-04 | 泸州品创科技有限公司 | 大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN108998398A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-14 | 陕西师范大学 | 一种采用微瀑布式梯形密闭培养装置快速培养醋酸菌的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102653796A (zh) * | 2012-05-25 | 2012-09-05 | 江南大学 | 一种分析啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法 |
| CN102719541A (zh) * | 2012-06-13 | 2012-10-10 | 江南大学 | 一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法 |
-
2012
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102653796A (zh) * | 2012-05-25 | 2012-09-05 | 江南大学 | 一种分析啤酒大麦或大麦麦芽微生物群落的方法 |
| CN102719541A (zh) * | 2012-06-13 | 2012-10-10 | 江南大学 | 一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 《Food Microbiology》 20101231 M.J. Torija et al Identification and quantification of acetic acid bacteria in wine and vinegar by TaqMan-MGB probes 第259页table2 4 第27卷, * |
| LIDIA H. MARKIEWICZ ET AL: "IDENTIFICATION OF LACTOBACILLUS STRAINS PRESENT IN FERMENTED DAIRY PRODUCTS AND THEIR DIFFERENTIATION USING MOLECULAR METHODS", 《POL. J. FOOD NUTR. SCI》 * |
| M.J. TORIJA ET AL: "Identification and quantification of acetic acid bacteria in wine and vinegar by TaqMan–MGB probes", 《FOOD MICROBIOLOGY》 * |
| M.J. TORIJA ET AL: "Identification and quantification of acetic acid bacteria in wine and vinegar by TaqMan–MGB probes", 《FOOD MICROBIOLOGY》, vol. 27, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 259 - 2 * |
| VICKY JESPERS ET AL: "Quantification of bacterial species of the vaginal microbiome in different groups of women, using nucleic acid amplification tests", 《BMC MICROBIOLOGY》 * |
| 曹凤明等: "多重PCR 技术检测微生物肥料中巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌的研究与应用", 《微生物学通报》 * |
| 许伟: "镇江香醋醋酸发酵过程微生物群落及其功能", 《江南大学博士学位论文》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468802A (zh) * | 2013-09-02 | 2013-12-25 | 四川大学 | 一种筛选细菌新菌种的方法 |
| CN103834745A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-06-04 | 泸州品创科技有限公司 | 大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN103834745B (zh) * | 2014-03-27 | 2016-02-24 | 泸州品创科技有限公司 | 大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN108998398A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-14 | 陕西师范大学 | 一种采用微瀑布式梯形密闭培养装置快速培养醋酸菌的方法 |
| CN108998398B (zh) * | 2018-09-06 | 2021-12-21 | 陕西师范大学 | 一种采用微瀑布式梯形密闭培养装置培养醋酸菌的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130417 |