CN111254101B - 植物乳杆菌和菌剂及其在生物胺降解、黄酒生产中的应用 - Google Patents

植物乳杆菌和菌剂及其在生物胺降解、黄酒生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了植物乳杆菌和菌剂及其在生物胺降解、黄酒生产中的应用。该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的保藏号为CGMCC No.19543，编号为30302，是一株不产生物胺且具有降解生物胺功能的植物乳杆菌。本发明将所述植物乳杆菌或所述菌剂应用于黄酒酿造的浸米过程中，极大地降低了浸米及整个酿造过程中生物胺的含量，缩短了浸米时间，节约成本，在保持传统黄酒风味的基础上，其饮后感得到了大幅的提高。

Description

植物乳杆菌和菌剂及其在生物胺降解、黄酒生产中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种植物乳杆菌和一种菌剂，以及它们在降解生物胺、制备发酵食品和制备黄酒中的应用，一种降解生物胺的方法，一种黄酒和黄酒的制备方法。
背景技术
黄酒是世界上最古老的酒类之一，源于中国且中国独有的酒种，是世界三大古酒。约在三千年前的商周时代，中国人独创了酒曲复式发酵，开始制作黄酒。北方黄酒以粟米、黍米为原料，南方黄酒以糯米为主。然而随着蒸馏技术的引进开发及其他的历史、经济、市场因素，黄酒逐渐变为小众性、地域性极强的酒种。以江浙沪地区中老年人为主要消费群体，而其他地区的黄酒几乎均为料酒。
通过对文献及生产者和消费者的调研报告阅读，我们发现了黄酒存在的几个尖锐的问题：味道苦涩，饮后易醉，饮用后第二天头痛不适。我们不难看出，黄酒行业最大的问题就是饮后舒适度。大量消费者在尝试了黄酒后出现了易上头、次日醉感残留、口干等情况，严重影响消费者体验，对黄酒市场形成恶性循环。即便是喜饮黄酒的消费者，由于饮后体感导致无法多饮，无法刺激市场消费。因此解决上头问题，是黄酒的当务之急。研究表明高级醇、生物胺、乙醛、酸酯不平衡等是引起上头的主要因素。
生物胺是引起酒后不适的主要物质之一，现有黄酒中含有大量生物胺，含量明显高于啤酒和葡萄酒，究其原因可能主要是因为黄酒中的氨基酸含量明显高于其他酿造酒，这为生物胺的形成提供了大量的前体物质，在浸米过程中被大量转化为生物胺。此外，黄酒发酵前需要对原料米进行浸渍，传统工艺黄酒浸米温度较低（约10-15℃），浸米时间长（10-20d），以浸米为主的黄酒长时间的开放酿造环境使其极易染菌，这也是产生生物胺的重要原因之一。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的黄酒中存在生物胺影响黄酒品质以及黄酒酿造过程中浸米时间长的问题，提供一种植物乳杆菌和一种菌剂，以及它们在降解生物胺、制备发酵食品和制备黄酒中的应用、一种降解生物胺的方法，以及一种黄酒和黄酒的制备方法。该菌株或菌剂能够降解生物胺，缩短黄酒酿造过程中浸米时间，且可有效降低黄酒中的生物胺含量，提高黄酒品质。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），该植物乳杆菌的保藏号为CGMCC No. 19543。
本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
优选地，所述菌剂还包含副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。
优选地，所述副干酪乳杆菌不产氨基酸脱羧酶。
优选地，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No. 19542。
本发明第三方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在降解生物胺中的应用。
本发明第四方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在制备发酵食品中的应用。
本发明第五方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在制备黄酒中的应用。
本发明第六方面提供一种降解生物胺的方法，将如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂与含生物胺的物料接触，以对其中的生物胺进行降解。
本发明第七方面提供一种黄酒的制备方法，该方法包括依次进行的浸米、蒸煮、前酵、后酵和煎酒；其中，在浸米过程中，向浸米水加入如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂。
本发明第八方面提供如上所述的黄酒的制备方法制备的黄酒。
本发明中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏号为CGMCC No.19543，编号为30302，是一株不产生物胺且具有降解生物胺功能的植物乳杆菌。
本发明中优选的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），保藏号为CGMCC No.19542，编号为30226，是一株不产生物胺且具有降解生物胺功能的副干酪乳杆菌。
本发明将所述植物乳杆菌，特别是优选将上述两种菌株复配制成菌剂，应用于黄酒酿造的浸米过程中，极大地降低了浸米及整个酿造过程中生物胺的含量，缩短了浸米时间，节约成本，在保持传统黄酒风味的基础上，其饮后感得到了大幅的提高。
生物保藏
本发明的菌株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2020年4月1日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 19543。
本发明的菌株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），于2020年4月1日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 19542。
附图说明
图1是本发明实施例3中实验组3在黄酒浸米过程中乳酸及生物胺含量变化曲线。
图2是本发明实施例6中实验组在黄酒浸米过程中乳酸及生物胺含量变化曲线。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明一方面提供一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），该植物乳杆菌的保藏号为CGMCC No. 19543。
本发明中，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）分离自浙江绍兴黄酒厂的浸米水。将采集的样品进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用无菌移液枪各取0.2ml不同浓度的稀释液，均匀涂布在MRS固态培养基上，37℃恒温厌氧箱中倒置培养1-2天。取上述平板上乳白或灰白，中间凸起的单菌落于碳酸钙乳酸菌选择培养基上进行划线分离，倒置于37℃厌氧培养箱中培养1-2天，挑取其中有溶钙圈的单菌落进行分离纯化，重复多次。最后选取具有类似乳酸菌形态的单菌落进行传代培养。
将上述具有类似乳酸菌形态的单菌落的菌株依次进行产生物胺初筛、产生物胺复筛和代谢生物胺终筛，最终得到本发明的乳酸菌菌株。
其中，所述产生物胺初筛在液体脱羧酶培养基中进行，具体步骤包括：将上述具有类似乳酸菌形态的单菌落的菌株接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃培养24h，然后转接到乳酸菌传代培养基中，传代3次。将传代3次后的菌株接种于液体脱羧酶培养基中，并设置不接种菌株的液体脱羧酶培养基为对照组，于37℃厌氧培养箱中培养4d后，观察颜色变化，黄色为不产生物胺，红色或紫色为产生物胺菌株。
其中，所述产生物胺复筛在生物胺检测平板中进行，具体步骤包括：选取初筛出来的菌株进行复筛，各取0.2mL传代3次后的培养液涂布于相应的生物胺检测平板上，倒置于37℃厌氧培养箱中培养24h，观察平板颜色变化情况，选取呈黄色的菌株。
其中，所述代谢生物胺终筛在含生物胺的MRS液体培养基中进行，具体步骤包括：将复筛的菌株活化后，以2%接种量（v/v）分别接于50mL含生物胺的MRS液体培养基中作为实验组，设置不接种菌株的含生物胺的MRS液体培养基为对照组，置于37℃厌氧培养箱中培养，定时取样检测培养液的吸光度OD600及生物胺含量，分析降解生物胺的能力（生物胺降解率=（对照组-实验组）/对照组×100%）。
通过筛选，得到2株具有明显降低生物胺功能的菌株30302和30226。相比于对照组，添加了30302菌株的MRS培养液总生物胺含量为401.12mg/L，为对照组的63.51%，降低了36.49%，对腐胺，尸胺，组胺，酪胺，色胺，精胺都有较为明显的降低，并且组胺降解率更为突出，为53.21%。添加了30226菌株的MRS培养液总生物胺含量为407.12mg/L，为对照组的64.46%，降低了35.54%，对腐胺、尸胺、色胺、精胺和亚精胺都有较为明显的降低。
对分离得到的菌株进行需氧、氧化酶、明胶、硝酸盐还原、吲哚等生理生化特征的鉴定，鉴定方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》。经鉴定，这两株菌均是微需氧，其他结果均为阴性。
取菌株30302的DNA，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系（25μL）：10XPCR Buffer：2.5μL，2.5mM 氯化镁：2μL，2.5mM dNTP：1μL，10μM引物各0.5μL，模板（基因组）：2.5μL，5U/μL TaqDNA聚合酶：0.2μL，加水至25μL。PCR扩增程序：95℃预变形3min；94℃变形30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸5min，降温至12℃，取出产物。序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由生工生物工程（上海）有限公司完成，16SrDNA序列如SEQ ID NO.1 所示。
按照上述相同的方法对菌株30226进行16SrDNA测序，16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
16SrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株30302与Lactobacillus plantarum有99%的同源性，综合认定为是植物乳杆菌，于2020年4月1日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19543；菌株30226与Lactobacillus paracasei有99%的同源性，综合认定为是副干酪乳杆菌，于2020年4月1日
被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 19542。
本发明中，所述MRS液体培养基的本领域常规使用的MRS液体培养基，优选地，其组成包括：蛋白胨：10g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L；当MRS培养基为固体培养基时还含有琼脂：20g/L。调节pH至 6.2-6.4，115℃灭菌20min。
本发明中，所述碳酸钙乳酸菌选择培养基可以是本领域常规使用的碳酸钙乳酸菌选择培养基，优选地，其组成包括：蛋白胨：10g/L，琼脂：20g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L，碳酸钙：10g/L；调节pH至6.5-6.8，115℃灭菌20min。
本发明中，所述乳酸菌传代培养基可以是本领域常规使用的乳酸菌传代培养基，优选地，其组成包括：蛋白胨：10g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L，组氨酸：10g/L，酪氨酸：10g/L，色氨酸：10g/L，精氨酸：10g/L，鸟氨酸：10g/L，赖氨酸：10g/L，调节pH至6.2-6.4，115℃灭菌20min。
本发明中，所述液体脱羧酶培养基可以是本领域常规使用的液体脱羧酶培养基，其组成包括：胰蛋白胨：5g/L，酵母膏：5g/L，牛肉膏：5g/L，氯化钠：2.5g/L，葡萄糖：0.5g/L，硫酸锰：0.5g/L，硫酸镁：0.2g/L，硫酸铁：0.04g/L， 硫胺素（维生素B）： 0.01g/L，磷酸氢二钾：2g/L，碳酸钙： 0.1/L，溴甲酚紫：0.06g/L，5′-磷酸吡哆醛：0.05g/L，吐温80：1mL/L，调节pH至5.3−5.5，115℃灭菌20min。
本发明中，所述生物胺检测培养基可以是本领域常规使用的生物胺检测培养基，优选地，其组成包括：胰蛋白胨：5g/L，酵母膏：5g/L，牛肉膏：5g/L，氯化钠：2.5g/L，葡萄糖：0.5g/L，硫酸锰：0.5g/L，硫酸镁：0.2g/L，硫酸铁：0.04g/L，柠檬酸铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，碳酸钙： 0.1/L，溴甲酚紫：0.06g/L，5′-磷酸吡哆醛：0.05g/L，吐温80：1mL/L，琼脂：20g/L，调节pH至5.3-5.6，115℃灭菌20min。
在本发明中，所述含生物胺的MRS液体培养基中生物胺的种类和含量可以在较宽的范围内选择，优选地，所述含生物胺的MRS液体培养基中生物胺包含酪胺、精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、组胺和色胺。优选地，所述含生物胺的MRS液体培养基中，每种生物胺的浓度分别为50-200mg/L。
在本发明中，所述植物乳杆菌的活化方法可以是本领域常规的乳杆菌活化方法，优选地，该方法包括：将所述植物乳杆菌接种到MRS培养基中，35-37℃培养12-20h，得到活化液。
在本发明中，所述植物乳杆菌的扩培方法可以是本领域常规的乳杆菌扩培方法，优选地，该方法包括：将所述活化液以1-5体积百分比接种到扩培培养基中，35-37℃培养12-48h，得到种子液。
在本发明中，所述扩培培养基的种类可以不受特别的限制，比如可以为本领域常用的MRS液体培养基。在本发明的一种优选的实施方式中，所述扩培培养基为快速扩培培养基；所述快速扩培培养基的组成包含：葡萄糖：15-20g/L，酵母浸粉：25-35g/L，硫酸镁：0.1-0.5 g/L，醋酸钠：2-7 g/L，柠檬酸三铵：1-3 g/L，磷酸二钾：1-3 g/L，硫酸锰：0.01-0.05g/L，吐温80：1-3mL/L，调节其pH至6.5-6.8。在所述快速扩培培养基中进行所述植物乳杆菌的扩培，能够使得菌株迅速扩增，缩短扩培时间。
在本发明中，所述植物乳杆菌的发酵方法可以是常规的发酵方法，优选地，该方法包括：将所述种子液以1-5体积百分比接种到发酵培养基中，35-37℃培养12-48h，得到发酵液。
其中，所述发酵培养基可以为MRS培养基、快速扩培培养基或其他任意本领域常规使用的发酵培养基。
在本发明中，活化、扩培和发酵统称为培养。
本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
在本发明中，优选地，所述菌剂含有所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的发酵液。
在本发明中，优选地，所述菌剂还包含副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。
在本发明中，优选地，所述副干酪乳杆菌不产氨基酸脱羧酶。
在本发明中，优选地，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No. 19542。
发明人发现，将本发明所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）30302和所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）30226复配使用时，能够显著提高生物胺的降解效率。
其中，保藏号为CGMCC No. 19542的所述副干酪乳杆菌为本发明第一方面提到的菌株30226，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.2 所示。具体的内容在第一方面已经进行了详细的阐述，在此不再一一赘述。其活化、扩培和发酵方法参见第一方面关于所述植物乳杆菌的说明，在此不再赘述。
在本发明中，所述菌剂中，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的活菌数的比例可以在较宽的范围内选择，优选地，所述植物乳杆菌和所述副干酪乳杆菌的活菌数比为1：（10-11-1011）。更优选地，所述植物乳杆菌和所述副干酪乳杆菌的活菌数比为1：（10-4-104）。
在本发明中，所述菌剂的形式可以不受特别的限制，比如可以为液体菌剂或固体菌剂，其中，固体菌剂可以是冻干菌剂。
在本发明中，所述菌剂中包含两种或以上的菌株时，其中的菌株可以分别加入得到菌剂，比如在所述菌剂含有植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的情况下，可以将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌分别进行培养，得到的产物混合得到所述菌剂；也可以是共同培养用于制备菌剂，比如，在所述菌剂含有植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的情况下，可以将植物乳杆菌和副干酪乳杆菌混合进行培养，培养得到的产物中同时包含上述两种菌，直接将其用于菌剂的制备。
在本发明中，所述液体菌剂的制备方法可以不受特别的限制，比如可以将菌株培养得到的产物直接作为液体菌剂。
在本发明中，所述固体菌剂的制备方法可以不受特别的限制，比如可以通过冻干、烘干、风干或喷雾干燥等方法进行制备。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述固体菌剂为冻干菌剂，所述冻干菌剂中含有冻干保护剂和菌株。
在本发明中，所述冻干保护剂的种类可以不受特别的限制，优选地，所述冻干保护剂选自脱脂奶粉、海藻糖和山梨醇中的至少一种，更优选包含脱脂奶粉、海藻糖和山梨醇。
其中，优选地，所述冻干保护剂中，脱脂奶粉、海藻糖和山梨醇的重量比为（5-20）：（2-12）：（1-5）。
在本发明中，所述冻干菌剂的制备方法可以不受特别的限制，优选地，取以菌泥或者菌液形式存在的菌株与所述冻干保护剂混合，在-80℃下预冻3-5h，然后真空冷冻干燥冻干5-10h，得到冻干菌剂。
应当理解的是，菌泥的制备方法是本领域技术人员熟知的，比如通过离心或者过滤等方式分离培养产物（比如发酵液），得到高密度菌株的菌泥。根据需要，还可以对得到的菌泥进行洗涤，以减少培养基的残留。
应当理解的是，所述菌液可以是培养直接得到的产物，比如发酵液，根据需要还可以使用生理盐水或PBS进行洗涤重悬。
在本发明中，所述冻干保护剂的添加量可以在较宽的范围内选择，优选地，以重量计，所述以菌泥或者菌液形式存在的菌株与所述冻干保护剂的添加量之比为1：（0.08-0.59）。
在本发明中，所述菌剂可以直接使用，也可以活化后使用。其中，活化的方法可以不受特别的限制，只要能够提高菌剂中的菌株的活性即可，比如可以采用第一方面中所述植物乳杆菌30302的活化方法进行活化。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述菌剂的制备包括以下步骤：分别将植物乳杆菌30302与副干酪乳杆菌30226接种至MRS液体培养基中活化12-48h后，在发酵罐中扩培得到相应的菌液。按活菌数为1：（10-4-104）的比例，将植物乳杆菌30302与副干酪乳杆菌30226的菌液混合，然后使用生理盐水或PBS进行洗涤重悬，得到含有植物乳杆菌30302与副干酪乳杆菌30226的菌悬液。将冻干保护剂和菌悬液移入冻干瓶中，充分混匀后，将混合物置于-76至-80℃条件下预冻120-150min；然后转移至真空冻干机，冻干10-20h，得到冻干菌剂。其中，以重量计，所述菌悬液与所述冻干保护剂的添加量之比为1：（0.08-0.59）；所述冻干保护剂中，脱脂奶粉的含量为14-63重量百分比，海藻糖的含量为5-32重量百分比，山梨醇的含量为5-15重量百分比。
本发明第三方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在降解生物胺中的应用。
在本发明中，生物胺是指酪胺、精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、组胺和色胺中的至少一种，可以通过HPLC法进行测定。
本发明第四方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在制备发酵食品中的应用。
其中，所述发酵食品包括但不限于黄酒、葡萄酒、清酒和啤酒。
本发明第五方面提供如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂在制备黄酒中的应用。
本发明第六方面提供一种降解生物胺的方法，将如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂与含生物胺的物料接触，以对其中的生物胺进行降解。
在本发明中，所述含生物胺的物料没有特别的限制，只要是含有生物胺的物料即可。
在本发明中，所述接触的条件可以不受特别的限制，只要能够使得所述植物乳杆菌30302和所述菌剂中的微生物代谢生物胺即可，优选地，所述接触的条件包括：温度为25-40℃，pH为5.0-8.0。
在本发明中，所述接触的时间可以不受特别的限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，优选地，所述接触的时间为2-300h。
在本发明中，所述植物乳杆菌或所述菌剂的用量可以在较宽的范围内选择，优选地，以所述含生物胺的物料的总重量计，所述植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得所述含生物胺的物料中的活菌数为105-1010cfu/g。
在本发明中，所述植物乳杆菌或所述菌剂用于降解生物胺时，可以直接使用，也可以活化后使用。其中，活化的方法可以不受特别的限制，只要能够提高菌株的活性即可，比如可以采用第一方面中所述植物乳杆菌30302的活化方法进行活化。
本发明第七方面提供一种黄酒的制备方法，该方法包括依次进行的浸米、蒸煮、前酵、后酵和煎酒；其中，在浸米过程中，向浸米水加入如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂。
在本发明中，所述植物乳杆菌或所述菌剂用于制备黄酒时，可以直接使用，也可以活化后使用。其中，活化的方法可以不受特别的限制，只要能够提高菌株的活性即可，比如可以采用第一方面中所述植物乳杆菌30302的活化方法进行活化。
优选地，所述米选自粳米、糯米和籼米中的至少一种。
在本发明中，所述浸米过程中，米和水的添加量之比可以在较宽的范围内进行选择，优选地，米和水的重量比为1：（1-2）。
应当理解的是，浸米水是指将米与水混合之后的液体部分。
在本发明中，加入所述植物乳杆菌或者菌剂的时间可以是在浸米过程的任意时间点添加，比如当浸米时间为1-12天时，在浸米的第1-11天的至少任意一天加入，优选在浸米开始时加入。
应当理解的是，将植物乳杆菌或菌剂接种到浸米水中就意味着浸米水和米均与菌株接触。
在本发明中，优选地，以所述浸米水和米的总体积计，所述植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得所述浸米水中的活菌数为105-1010cfu/mL。
在本发明中，优选地，所述植物乳杆菌或所述菌剂经过培养后添加到浸米过程中，比如可以将所述植物乳杆菌或所述菌剂进行活化、扩培和发酵中的至少一种，得到培养得到的菌液，然后将该培养得到的菌液接种到浸米水中。
其中，所述培养得到的菌液的添加量可以在较宽的范围内选择，只要能够使得所述浸米水中的活菌数为105-1010cfu/mL即可，优选地，以所述浸米水和米的总体积计，所述培养得到的菌液的添加量为1-10体积百分比。
在本发明的一种优选的实施方式中，该方法包括：（1）浸米：将米和水混合并浸泡1-12天，在浸泡的第1-11天的至少任意一天加入如上所述的植物乳杆菌或如上所述的菌剂，其中，以所述浸米水和米的总重量计，所述植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得所述浸米水中的活菌数为105-1010 cfu/mL；（2）蒸煮：将浸泡后的米蒸煮后，降温至30℃以下，得到熟饭；（3）前酵：将活化后的酒曲与熟饭混合后，在25-35℃条件下发酵3-5天；（4）后酵：将前酵的产物在15-25℃下发酵5-20天，得到发酵液；（5）煎酒：将发酵液在75-90℃下保持15-30min进行煎酒。
在本发明中，所述酒曲可以是本领域常规使用的酒曲，可以通过商购获得或者自制得到。其中，所述酒曲可以为绍兴酒厂的酒曲。
本发明第八方面提供一种根据如上所述的黄酒的制备方法制备的黄酒。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，还原糖的测定方法参见GB/T 13662-2018。
以下实施例中，乳酸、有机酸的测定方法参见GB 5009.157-2016。
以下实施例中，乙醇的测定方法参见GB/T 13662-2018。
以下实施例中，氨基酸的测定方法参见GB 5009124—2016。
以下实施例中，醛类、高级醇的测定方法参照DBS52/ 021—2016。
以下实施例中，生物胺的测定方法参见GB 5009.208-2016。
以下实施例中使用的米为粳米。
MRS固态培养基：蛋白胨：10g/L，琼脂：20g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L，pH 6.2-6.4，115℃灭菌20min。
碳酸钙乳酸菌选择培养基：蛋白胨：10g/L，琼脂：20g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L，碳酸钙：10g/L，pH 6.5-6.8，115℃灭菌20min。
快速扩培培养基：葡萄糖：15g/L，酵母浸粉：35g/L，硫酸镁：0.35g/L，醋酸钠：4.5g/L，柠檬酸三铵：2g/L，磷酸二钾：1g/L，硫酸锰：0.02g/L，吐温80：1mL/L，115℃灭菌20min。
乳酸菌传代培养基 ：蛋白胨：10g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L，组氨酸：10g/L，酪氨酸：10g/L，色氨酸：10g/L，精氨酸：10g/L，鸟氨酸：10g/L，赖氨酸：10g/L，pH 6.2-6.4，115℃灭菌20min。
液体脱羧酶培养基： 胰蛋白胨：5g/L， 酵母膏：5g/L，牛肉膏：5g/L，氯化钠：2.5g/L，葡萄糖：0.5g/L，硫酸锰：0.5g/L，硫酸镁：0.2g/L，硫酸铁：0.04g/L， 硫胺素（维生素B）：0.01g/L， 磷酸氢二钾：2g/L，碳酸钙： 0.1/L，溴甲酚紫：0.06g/L，5′-磷酸吡哆醛：0.05g/L， 吐温80：1mL/L，pH 5.3−5.5，115℃灭菌20min。
生物胺检测培养基： 胰蛋白胨：5g/L， 酵母膏：5g/L，牛肉膏：5g/L，氯化钠：2.5g/L，葡萄糖：0.5g/L，硫酸锰：0.5g/L，硫酸镁：0.2g/L，硫酸铁：0.04g/L，柠檬酸铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，碳酸钙： 0.1/L，溴甲酚紫：0.06g/L，5′-磷酸吡哆醛：0.05g/L，吐温80：1mL/L，琼脂：20g/L，pH 5.5，115℃灭菌20min。
含生物胺的MRS培养基：蛋白胨：10g/L，牛肉膏：10g/L，酵母膏：5g/L，柠檬酸二铵：2g/L，磷酸氢二钾：2g/L，七水硫酸镁：0.1g/L，二水硫酸镁：0.05g/L，葡萄糖：20g/L，无水乙酸钠：5g/L，吐温80：1mL/L，酪胺：100mg/L，精胺：100mg/L，亚精胺：100mg/L，腐胺：100mg/L，尸胺：100mg/L，组胺：100mg/L，色胺：100mg/L，115℃灭菌20min。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的植物乳杆菌30302和副干酪乳杆菌30226的筛选方法
（1）具有生物胺降解能力的菌株筛选
采集浙江绍兴黄酒厂的浸泡过程浆液作为待筛选的样品。将采集的样品进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用无菌移液枪各取0.2ml不同浓度的稀释液，均匀涂布在MRS培养基上，37℃恒温厌氧箱中倒置培养1天。取上述平板上乳白或灰白，中间凸起的单菌落于碳酸钙乳酸菌选择培养基上进行划线分离，倒置于37℃厌氧培养箱中培养1天，挑取其中有溶钙圈的单菌落进行分离纯化，重复多次。最后选取具有类似乳酸菌形态的单菌落进行传代培养。
分别使用液体脱羧酶培养基、生物胺检测平板和含生物胺的MRS液体培养基对上述筛选得到的菌株依次经过产生物胺初筛、产生物胺复筛和代谢生物胺终筛。具体的，将上述筛选出的菌株接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃培养24h，然后转接到乳酸菌传代培养基中，传代3次。将传代3次后的菌株接种于液体脱羧酶培养基中，并设置不接种菌株的液体脱羧酶培养基为对照组，于37℃厌氧培养箱中培养4d后，观察颜色变化，黄色为不产生物胺，红色或紫色为产生物胺菌株。选取初筛出来的菌株进行复筛，各取0.2mL传代3次后的培养液涂布于生物胺检测平板上，倒置于37℃厌氧培养箱中培养24h，观察平板颜色变化情况，选取呈黄色的菌株。将复筛的菌株活化后，以2%接种量（v/v）分别接于50mL含有生物胺的MRS培养基中作为实验组，并设置不接种菌株的含生物胺的MRS液体培养基为对照组，置于37℃厌氧培养箱中培养，定时取样检测培养液的吸光度OD600及生物胺含量，分析降解生物胺的能力，通过检测得到2株具有明显降低生物胺功能的菌株30302和30226，这两株菌株的结果见表1。另外还有两株同时筛选得到的菌株，编号分别为QAL22和HL20，其对生物胺降解的结果见表1。
表1
Figure 392468DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，对于生物胺的降解效果来看，降解效果从大到小依次为30302＞30226＞QAL22＞HL20＞对照组。相比于对照组，添加了30302菌株的MRS培养液总生物胺含量为401.12mg/L，为对照组的63.51%，降低了36.49%，对腐胺、尸胺、组胺、酪胺、色胺和精胺都有较为明显的降低，并且组胺降解率更为突出，为53.21%。添加了30226菌株的MRS培养液总生物胺含量为407.12mg/L，为对照组的64.46%，降低了35.54%，对腐胺、尸胺、色胺、精胺和亚精胺都有较为明显的降低。
实施例2
本实施例用于说明对菌株鉴定的方法
（1）生理生化鉴定
对分离得到的菌株30302和30226分别进行需氧、氧化酶、糖醇类发酵、明胶、硝酸盐还原、吲哚等生理生化特征的鉴定，鉴定方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》。经鉴定，这两株菌均是微需氧，其他结果均为阴性。
（2）16S rDNA鉴定
分别取两菌株总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系（25μL）：10XPCR Buffer：2.5μL，2.5mM 氯化镁：2μL，2.5mM dNTP：1μL，10μM引物各0.5μL，模板（基因组）：2.5μL，5U/μL TaqDNA聚合酶：0.2μL，加水至25μL。
PCR扩增程序：95℃预变形3min；94℃变形30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸5min，降温至12℃，取出产物。
序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由生工生物工程（上海）有限公司完成，菌株30302的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1 所示，菌株30226的16SrDNA序列如SEQID NO.2 所示。
（3）鉴定结果
16SrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株30302与Lactobacillus plantarum有99%的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定为植物乳杆菌；菌株30226与Lactobacillus paracasei有99%的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定为副干酪乳杆菌。
实施例3
本实施例用于说明本发明的在浸米过程中加入菌剂降解生物胺的方法
在MRS液体培养基中，将植物乳杆菌30302在37℃，pH 6.0的条件下活化培养24小时，得到活化液，其活菌数达十亿。
在MRS液体培养基中，将副干酪乳杆菌30226在37℃，pH 6.0的条件下活化培养24小时，得到活化液，其活菌数达十亿。
将水和米按照重量比1：1的比例进行混合，其上层为浸米水，下层为米。以浸米水和米的总体积为基准，分别将植物乳杆菌活化液、副干酪乳杆菌活化液以及植物乳杆菌活化液和副干酪乳杆菌活化液的混合液（体积比为1：2）按照3%的添加量加入浸米水中，25℃浸泡96h，分别记为实验组1、实验组2和实验组3，并以不添加菌剂为对照组。
检测浸泡12h、24h、48h、72h和96h后浸米水与浸泡大米中乳酸的含量，具体结果见表2；检测浸泡12h、24h、48h、72h和96h后浸米水与浸泡大米中生物胺含量，具体结果见表3。
其中，在浸米过程中，实验组3的乳酸和生物胺曲线见图1。
表2
Figure 637504DEST_PATH_IMAGE002
表3
Figure 948400DEST_PATH_IMAGE003
从上述数据可以看出，相对于对照组和单独的菌剂，添加复合液体菌剂（含植物乳杆菌30302和副干酪乳杆菌30226）的浸米水效果最优，24h即可达到对照组96h的技术效果。当浸泡时间达到96h时，实验组3的浸米水中乳酸含量达到7.25g/L，生物胺总量为15.65mg/L，相比于对照组下降了82.16%，浸泡大米中的乳酸含量达到4.56g/kg，生物胺总量为12.65mg/L，相比于对照组下降了85.85%。
实施例4
本实施例用于说明冻干菌剂的制备
植物乳杆菌30302发酵液的制备：将菌株30302接入150mL MRS液体培养基中，37℃培养箱中培养24h，作为活化液；将活化液按接种量5%接入400mLMRS液体培养基中，放入37℃培养箱中培养 24h，作为种子液；种子液按接种量5%接入6L MRS液体培养基中，37℃培养24h，得到30302发酵液。
副干酪乳杆菌30226发酵液的制备：按照植物乳杆菌30302发酵液的制备方法制备菌株30226的发酵液。
取30302发酵液200mL和30226发酵液100mL，混合并在4300g离心10min，取沉淀，用生理盐水将菌泥洗涤两遍（重悬后再离心取沉淀），加无菌水定容得到50mL菌悬液。
向该菌悬液中加入冻干保护剂（其中，无菌脱脂奶粉5.4g，海藻糖1.8g，山梨醇0.3g）。用封口膜封口，在表面用牙签扎若干小孔，放入-80℃预冻5h。取出放入真空冷冻干燥机中冻干10h左右，得到含有菌株30302和菌株30226的冻干菌剂。
实施例5
本实施例用于说明冻干菌剂的快速扩培方法
取10g实施例4中制备得到的含菌株30302和菌株30226的冻干菌剂，该冻干菌剂在MRS液体培养基中活化，37℃培养20h，得到活化液。
经响应面分析设计，按照接种量1.5%，将活化液接种至快速扩培培养基扩培24h，得到种子液。
按照接种量3%将种子液接种至快速扩培培养基中进行发酵，发酵过程中控制pH为6.5左右，发酵20h后得到的发酵液中两菌株的活菌数均可达到百亿。
实施例6
本实施例用于说明本发明的在浸米过程中加入菌剂降解生物胺的方法
以浸米水和米的总体积为基准，以体积分数为3%的接种量，在浸米开始时，将实施例5得到的发酵液加入至浸米水中，浸泡96h，以不接该菌剂浸泡大米为对照组，25℃浸泡。
检测浸泡16h、20h、48h、72h和96h后浸米水与浸泡大米中乳酸的含量，具体结果见表4；检测浸泡16h、20h、24h、48h、72h和96h浸米水与浸泡大米中生物胺含量，具体结果见表5。
其中，在浸米过程中，实验组的乳酸和生物胺曲线见图2。
表4
Figure 999401DEST_PATH_IMAGE004
表5
Figure 610511DEST_PATH_IMAGE005
相对于对照组，添加该菌剂的浸米水20h即可达到对照组96h的技术效果。且添加该菌剂的浸米水中乳酸含量为9.58g/L，生物胺含量为11.39mg/L，相比于对照组降低了85.41%，浸泡大米中乳酸含量为5.31g/kg，生物胺含量为10.61mg/kg，降低了87.36%。由此可知，将该菌剂应用于浸米过程可使浸米时间缩短至20h，并且具有明显降低生物胺含量的效果。
实施例7
本实施例用于说明黄酒的制备方法
取20kg粳米和20kg水，以米和水的总体积为基准，以体积分数为3%的添加量添加实施例6得到的发酵液，25℃浸泡20h；以不添加发酵液为对照组，并控制在25℃浸泡96h。
浸米后分别蒸煮，鼓风冷却，然后与4kg绍兴酒厂麦曲和1kg绍兴酒厂酒母进行落缸进行10℃，3d前酵（每12小时翻钯1次，保证发酵温度控制在26-28℃）。3天后分装至4个10L的陶罐内，简单封口（微厌氧环境）后进行60d的后酵验证。并分别在后酵的1、7、14、30和60天取5ml发酵醪糟样品（60天形成压榨前的原酒），对生物胺、还原糖、pH、乙醇、氨基酸、总高级醇、总醛进行检测。具体结果见表6。
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE007
从表6中的数据可以看出，相比于对照组，实验组中还原糖、pH、乙醇、总酯、总高级醇和总醛含量基本处于同一水平，氨基酸较对照组稍有提高，生物胺含量下降了52.47%。此外，添加此菌剂消除了浸米环节的臭味、改善浸米水的品质，提高黄酒饮用舒适度。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中粮营养健康研究院有限公司
中粮绍兴酒有限公司
<120> 植物乳杆菌和菌剂及其在生物胺降解、黄酒生产中的应用
<130> I62775COF
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1021
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
ttgggggggg tgcctatact tgcaagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat 60
catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga 120
agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt 180
ccgagcttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag 240
atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc 300
cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360
caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa 420
aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta 480
accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540
tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600
cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660
tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720
cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780
ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840
cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggaacat gtggtttaat tcgaagctac 960
gcgaagaacc ttaccaggtc ttgactacta tgcaatctaa gagataaacg ttcccttcgg 1020
g 1021
<210> 2
<211> 1070
<212> DNA
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 2
ctatggctgc ctatactgca agtcgaacga gttctcgttg atgatcggtg cttgcaccga 60
gattcaacat ggaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccttaagt 120
gggggataac atttggaaac agatgctaat accgcataga tccaagaacc gcatggttct 180
tggctgaaag atggcgtaag ctatcgcttt tggatggacc cgcggcgtat tagctagttg 240
gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgatgata cgtagccgaa ctgagaggtt gatcggccac 300
attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360
tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga aggctttcgg gtcgtaaaac 420
tctgttgttg gagaagaatg gtcggcagag taactgttgt cggcgtgacg gtatccaacc 480
agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat 540
ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagccct 600
cggcttaacc gaggaagcgc atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg 660
aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720
ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccatgccgta aacgatgaat gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840
tgccgcagct aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900
aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcttttga tccctgagag atcaggttcc ccttcggggc 1020
aaatgacagg tgtgcatggt tgcctcacct cgggcctgaa atttgggtta 1070

Claims (14)

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其特征在于，该植物乳杆菌的保藏号为CGMCC No.19543。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其中，所述菌剂还包含副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）；
其中，所述副干酪乳杆菌不产氨基酸脱羧酶。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其中，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No.19542。
5.根据权利要求3或4所述的菌剂，其中，所述植物乳杆菌和所述副干酪乳杆菌的活菌数比为1：（10-11-1011）。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2-5中任意一项所述的菌剂在降解生物胺中的应用。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2-5中任意一项所述的菌剂在制备发酵食品中的应用。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2-5中任意一项所述的菌剂在制备黄酒中的应用。
9.一种降解生物胺的方法，其特征在于，将权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2-5中任意一项所述的菌剂与含生物胺的物料接触，以对其中的生物胺进行降解。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述接触的条件包括：温度为25-40℃，pH为5.0-8.0。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，以所述含生物胺的物料的总重量计，所述植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得所述含生物胺的物料中的活菌数为105-1010cfu/g。
12.一种黄酒的制备方法，其特征在于，该方法包括依次进行的浸米、蒸煮、前酵、后酵和煎酒；
其中，在浸米过程中，向浸米水中加入权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2-5中任意一项所述的菌剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，以所述浸米水和米的总体积计，所述植物乳杆菌或所述菌剂的添加量使得所述浸米水中的活菌数为105-1010cfu/mL。
14.权利要求12或13所述的黄酒的制备方法制备的黄酒。
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