CN105002102A - 一种马克思克鲁维酵母及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces？marxianus)及其培养方法和应用。所述马克思克鲁维酵母保藏编号为CGMCC？No.10060。使用本发明马克思克鲁维酵母制备的红茶菌蛋白饮料避免了杂菌污染，保证了不同批次产品的稳定性，有利于工业化生产，不仅具有酸甜相宜、清香爽口的风味，而且含有多种功效成分。

Description

一种马克思克鲁维酵母及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)及其培养方法和应用。

背景技术

红茶菌，俗称“海宝”，起源于中国渤海一带，已有几百年的历史。传统红茶菌饮料又被称为康普茶，经日本传至世界各地，并在欧美和日本兴起了研究的新潮。红茶菌是由三种有益于人体健康的益生菌，即酵母菌、醋酸菌、乳酸菌组成的共生体系，通过自身特殊作用，将茶叶等原料经过生物技术发酵工艺转化为极其丰富的营养物质。共生红茶菌通过代谢产生一系列营养物质，如葡萄糖酸、醋酸、葡萄糖、果糖、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、茶多酚、咖啡因、乙醇和二氧化碳等营养物质。具有抵抗癌症抵抗心血疾病提高消化能力刺激免疫系统减少发炎等功效。

虽然红茶菌在我国有着悠久的历史，但是对它的科学研究起步较晚，目前还主要停留在家庭自产自销。红茶菌发酵饮料，采用混菌天然发酵，不同红茶菌含有的微生物种类和活力不同，产品中产物的成分和含量也不一致，不能从根本上保证饮品的质量和安全，而且还会因为操作不当而导致污染、变质。另外，菌种在天然发酵过程，容易发生变异、衰退和死亡。而且利用天然混菌发酵，发酵周期长。而要进行纯菌混合发酵，目前可供选择的酵母菌种类有限，且效果大多不够理想。

乳糖酶是乳制品领域的一种重要原料，针对乳糖酶缺乏或乳糖不耐受人群的乳制品中通常需要添加乳糖酶。乳糖酶的种属来源各异，其中产乳糖酶的酵母菌主要包括脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)等，而现有的马克思克鲁维酵母的众多菌株都无法生产乳糖酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的制备红茶菌发酵饮料工艺中混菌天然发酵所带来的产品产物的成分和含量不一致、还容易造成操作污染，而纯菌混合发酵中可供选择的酵母菌种类有限的问题，以及现有的众多马克思克鲁维酵母不生产乳糖酶的问题，提供了一种马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)及其培养方法和应用。使用本发明马克思克鲁维酵母菌株制备的红茶菌蛋白饮料，避免了杂菌污染，保证了不同批次产品的稳定性，有利于工业化生产，不仅具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

本发明技术方案之一：一种马克思克鲁维酵母，其保藏编号为CGMCCNo.10060。

本发明中，所述马克思克鲁维酵母已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10060，培养物名称是BD1002，分类命名是马克思克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus。

本发明技术方案之二：一种培养马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060的方法，其包括下述步骤：将马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060接种于培养基中培养。

本发明中，所述培养可以是各种微生物的培养方式，包括液体培养、固体培养、半固体培养等，可以是振荡培养，也可以是发酵罐深层发酵，较佳地为振荡培养。所述振荡培养的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为180转/分钟。

本发明中，所述培养的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为30℃。

本发明中，所述培养的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为18-48小时，更佳地为24-48小时。

本发明中，所述培养基可以为本领域培养酵母的常规的培养基，包括液体培养基和固体培养基，较佳地为选自PDA培养基、酵母培养基、碳源同化基础培养基、氮源同化基础培养基和MRS培养基中的一种，更佳地为酵母培养基。

本发明技术方案之三：马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060在制备乳糖酶中的应用。

本发明技术方案之四：马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060在食品中的应用。

本发明中，所述食品较佳地为红茶菌蛋白饮料。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了马克思克鲁维酵母的一个新的菌株。使用本发明马克思克鲁维酵母制备的红茶菌蛋白饮料，避免了杂菌污染，保证了不同批次产品的稳定性，有利于工业化生产，不仅具有酸甜相宜、清香爽口的风味，还能够生产乳糖酶，具有较强的水解乳糖的功能，为乳糖酶的制备提供了新的来源。

生物材料保藏信息

本发明的马克思克鲁维酵母BD1002，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10060，培养物名称是BD1002，分类命名是马克思克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus。

附图说明

图1：马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060产生乳糖酶，与IPTG反应呈绿色。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

本发明所用到的培养基成分如下：

PDA培养基：马铃薯浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15.0g、氯霉素0.1g、蒸馏水1L；

MRS培养基：蛋白胨1g、牛肉浸膏1g、酵母浸膏0.5g、葡萄糖2g、醋酸钠0.5g、吐温80 0.1mL、柠檬酸二胺0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.058g、MnSO₄·4H₂O 0.025g、K₂HPO₄ 0.2g、水100mL，pH6.2-6.6，115℃，杀菌15min。

酵母培养基：鱼胨1g、酵母膏1g、葡萄糖2g、水100mL，115℃，杀菌15min。

本发明中所用到的菌株和主要试剂：

干酪乳杆菌LC2W见中国专利ZL03129450.2，菌株保藏号CGMCCNo.0828；嗜酸乳杆菌NCFM菌株购自杜邦公司；红茶粉购自浙江顶亨生物科技有限公司，产品编号TH-B656；脱盐乳清粉购自Davisco FoodsInternational Inc.。

鉴定用培养基：糖发酵肉汤基础培养基、碳源同化基础培养基与氮源同化基础培养基购买自北京陆桥技术有限责任公司。

酵母菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。KOD plus与KOD plus 10×缓冲液(不含氯化镁)购自东洋纺(Toyobo)公司。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR产物由上海生工生物工程有限公司进行测序。

实施例1 BD1002菌株的分离和制备

从购买的青海藏灵菇中以无菌方式取1mg，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于PDA培养基上，30℃培养24-48小时。选取单菌落多个，分别转接到新的PDA培养基上，得到生长出来的菌落，观察其大小、颜色、边缘、光滑度、透明度等特点，选择在PDA培养基上形成浅黄色、边缘整齐、光滑、表面光泽、半透明的菌落，得菌株BD1002。

实施例2 BD1002菌株的微生物特征

1、菌落特征：

取菌株BD1002的单菌落，转接到PDA培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、光滑度、透明度等特点。结果显示，菌株BD1002在PDA培养基上形成浅黄色、边缘整齐、光滑、表面光泽、半透明的菌落。

2、生化特征：

酵母菌主要以单细胞形式存在，可供考察的形态特征很有限，所以其种级水平上可以以下生理生化特性为依据：是否具有有性生殖过程，能否形成子囊孢子，具有掷孢子或冬孢子，以及孢子的形状、特点、数目以及能否形成真假菌丝分类到纲、目、科，以及根据菌落形态、细胞形状、增殖方式是否形成真假菌丝，结合少数糖类发酵和硝酸盐利用等试验分类归属。

挑取在PDA培养基上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。生化特征如表1所示。

表1菌株BD1002的生化特征

3、生理特征

酵母菌的生理特征中，糖的发酵和同化最为重要，可以利用硝酸盐分类到种。

利用液体培养基试管法测马克思克鲁维酵母BD1002菌株的碳源同化及氮源同化实验。挑取PDA平板培养的的马克斯克鲁维酵母BD1002菌株2-3环接入30ml酵母培养基中，置于30℃下，180r/min振荡培养18h。无菌条件下12000rpm离心10min收集菌体。用生理盐水0.9％(w/v)NaCl洗涤2次。

取180mm×16mm的试管，每试管中加6ml的碳源同化基础培养基或者氮源同化基础培养基，分别加入50mM的浓度碳源或氮源，高压灭菌。往上述试管中接种10μL上述生理盐水重悬的BD1002，25℃培养24h，48h观察菌株的生长状况。结果见表2所示。

表2碳源同化实验及氮源同化实验

“+”表示有生长，“-”表示无生长

根据《酵母菌的特征与鉴定手册》(巴尼特J A.酵母菌的特征与鉴定手册[M].胡瑞卿，译.青岛：青岛海洋大学出版社，1991：7-197.)，比对碳源与氮源的利用情况，BD1002菌株属于马克思克鲁维酵母。

4、代谢特征

挑取PDA平板培养的的马克斯克鲁维酵母BD1002菌株2-3环接入30ml酵母培养基中，置于30℃下，180r/min振荡培养18h。无菌条件下12000rpm离心10min收集菌体。用生理盐水0.9％(w/v)NaCl洗涤2次，重悬于1ml碳源同化基础培养基或者氮源同化基础培养基。

取180mm×16mm的试管，每试管中加糖发酵肉汤基础培养基，高压灭菌，分别加入0.22μm的膜过滤的糖，使其终浓度为50mM。往上述试管中接种10μL的BD1002，25℃培养24h，48h观察菌株的生长状况。结果见表3。

表3菌株糖发酵鉴定结果

“+”表示利用糖产酸，“-”表示不产酸。

实施例3本发明菌株的18S系统发育学特征

酵母中的核糖体小亚基18S rRNA全长约为1800nt，由基因RDN18编码，位于5′端外转录间隔区ETS与内转录间隔区ITS1之间(按5′→3′方向)。在长期的进化过程中，分子功能几乎保持恒定，而且含有保守序列、中等变异序列以及高变异速率区段，因此可用来区分亲缘关系不同的类群。

利用生理学特征指标和18S rRNA基因两种分类依据相互佐证，建立起的分类体系可信度较高。

挑取PDA平板培养的马克斯克鲁维酵母BD1002菌株2-3环接入30ml酵母培养基中，180r/min振荡培养18h后取菌液5ml，12000rpm离心10min，弃除上清液，收集的菌体按酵母菌基因组提取试剂盒说明书上的方法提取基因组DNA，于-20℃保存，以防降解。

将上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用25微升反应体系，对18S rRNA区段进行扩增。反应体系：KOD plus10×缓冲液(不含氯化镁)2.5μL、MgSO₄ 1.5μL，KOD plus 0.5μL，2mM dNTP 2.5μL、ddH₂O 16μL、10μM引物ITS1 1μL、10μM引物ITS4 1μL、模板DNA 1μL。反应条件94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，68℃30s)，68℃10min。所述的引物对序列为ITS1：5’tccgtaggtgaacctgcgg 3’，ITS4：5’tcctccgcttattgatatgc 3’。

将PCR产物送测序，测序的结果如SEQ ID No.1所示。测序结果与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，发现马克斯克鲁维酵母PMM08-3491-AL与本发明BD1002菌株序列最接近，两者序列相似性为99％。

本发明的马克思克鲁维酵母BD1002，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10060，培养物名称是BD1002，分类命名是马克思克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus。

实施例4本发明BD1002菌株水解乳糖的特性

在PDA培养基里加入5mM的IPTG，倒平板，然后接种菌株。能产乳糖酶的菌落呈绿色。

同时接入5株菌：1、2、6、7与BD1002菌株(3个平行)，其中1与2为马克思克鲁维酵母BD1588，6与7为酿酒酵母BD0390。结果如图1所示。由结果可知，BD1002菌株产乳糖酶，能够水解IPTG显绿色。菌株1、2、6、7不产乳糖酶，无法水解IPTG显绿色。

实施例5本发明菌株在制备红茶菌蛋白饮料中的应用

1、菌粉制作

挑取如实施例1所述在PDA培养基上培养24-48h后的马克斯克鲁维酵母BD1002菌株2-3环接入酵母培养基中，置于30℃下，180r/min振荡培养18h后按1％(v/v)的接种量转接入400ml酵母培养基中，180r/min振荡培养48h。挑取活化后的嗜酸乳杆菌NCFM和干酪乳杆菌LC2W 2-3环分别接入MRS培养基，37℃下厌氧静置培养18h后按1％(v/v)的接种量转接入400ml MRS培养基中，37℃下，厌氧静置培养48h。

将培养得到的发酵液无菌条件下12000rpm离心10min收集菌体。用生理盐水0.9％(w/v)NaCl洗涤2次，重悬于10％(w/v)20ml 115℃杀菌15min脱脂乳中，-80℃冰箱预冻，冷冻干燥后获得菌粉。

2、红茶菌的发酵

红茶菌蛋白发酵基料：果葡糖浆10g、红茶粉0.2g、脱脂牛乳2g，并补足水至100mL，115℃，杀菌15min。

用生理盐水0.9％(w/v)NaCl重溶菌粉，测定各自的吸光度值OD₅₈₀(生理盐水为参比)。根据三种菌的浓度(10⁸cfu/mL)与OD₅₈₀的线性关系及三种菌的实际OD₅₈₀，计算接种量。

500mL瓶中装入200mL红茶菌蛋白发酵基料，根据马克斯克鲁维酵母BD1002菌株∶嗜酸乳杆菌NCFW∶干酪乳杆菌LC2W＝1∶1∶1(活菌数)接入，三种菌的浓度均为10⁸cfu/mL，置于30℃静止培养20h。发酵液经过85℃，1min杀菌即得到红茶菌蛋白饮料。

该饮料pH值为4.3，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

效果实施例1

对实施例5的红茶菌蛋白饮料进行品尝，采用不记名打分制，分别从产品的稳定性、风味、总体口感、总体口感、回味来评价产品并打分，每项满分10分，分数高则效果好，并对是否喜欢产品程度进行总体评价。评分标准见表4，实验结果记录见表5所示。

表4评分标准

表5红茶菌蛋白饮料感官评定结果

效果实施例2

将实施例5中的脱脂牛乳，选择不同批次生产的3批脱脂牛乳，其他同实施例5。

批次1饮料pH值为4.3，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

批次2饮料pH值为4.31，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

批次3饮料pH值为4.29，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

批次1-3生产得到的红茶菌蛋白饮料的感官评定结果如表6所示。

表6用不同批次脱脂牛乳生产的红茶菌蛋白饮料感官评定结果

根据表6所示的结果，用不同批次的脱脂牛乳所制得的红茶菌蛋白饮料在稳定性、风味、口感和回味几个指标上都变化不大，非常稳定。

效果实施例3

选择不同批次活化的3批发酵菌种：马克思克鲁维BD1002菌株、嗜酸乳杆菌NCFM菌株和干酪乳杆菌LC2W菌株，其他同实施例5。

批次1饮料pH值为4.3，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

批次2饮料pH值为4.32，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

批次3饮料pH值为4.31，具有酸甜相宜、清香爽口的风味。

批次1-3生产得到的红茶菌蛋白饮料的感官评定结果如表7所示。

表7用不同批次发酵菌种生产的红茶菌蛋白饮料感官评定结果

根据表7所示的结果，用不同批次的发酵菌种马克思克鲁维BD1002菌株、嗜酸乳杆菌NCFM菌株和干酪乳杆菌LC2W菌株所制得的红茶菌蛋白饮料在稳定性、风味、口感和回味几个指标上都变化不大，非常稳定。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.10060。

2.一种培养如权利要求1所述马克思克鲁维酵母的方法，其特征在于，其包括下述步骤：将马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060接种于培养基中培养。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养的温度为30℃。

4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养为振荡培养。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述振荡培养的转速为180转/分钟。

6.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养的时间为18-48小时。

7.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述培养基为酵母培养基。

8.马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060在制备乳糖酶中的应用。

9.马克思克鲁维酵母CGMCC No.10060在食品中的应用。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述食品为红茶菌蛋白饮料。