CN109401998B - 一株降解生物胺的明登乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有降低生物胺的明登乳杆菌及其应用，属于生物工程领域。本发明的降低生物胺的明登乳杆菌菌株，于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018627。本发明的菌株具有明显降低生物胺的能力。本发明提供的明登乳杆菌菌株降胺能力良好，可明显降低浸米过程中生物胺的含量，减少带入发酵体系的生物胺，改善发酵产品品质，因此具有广泛的应用前景。

Description

一株降解生物胺的明登乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株降解生物胺的明登乳杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

生物胺是一种低分子量的氨基化合物，普遍存在于食品和动植物体内，尤其是在蛋白质和氨基酸含量丰富的发酵食品，如干酪、黄酒、酱油等。黄酒是谷物为主要原料，经浸米、蒸煮、加曲、糖化、发酵、压榨、澄清、过滤、煎酒、贮存和勾兑而成的酿造酒。黄酒中的生物胺主要由微生物分泌的氨基酸脱羧酶作用游离氨基酸脱羧形成，也有一些脂肪族生物胺通过醛的胺化作用形成；黄酒中生物胺主要包括组胺、酪胺、腐胺及尸胺等。由于丰富的氨基酸含量以及开放的酿造环境导致黄酒中生物胺含量较高，普遍含量在100mg/L左右。黄酒中适量的生物胺对人体有一定的生物活性作用，但当生物胺含量超过一定浓度时，会对人体产生副作用，引起机体不适。

黄酒中生物胺的形成主要集中在浸米与发酵阶段，现有的文献报道中针对发酵阶段的生物胺含量与降解的研究已有不少，但关于浸米过程中生物胺含量控制的报道却十分有限。浸米过程是敞口露天的，因此会网罗环境中的大部分微生物，导致米浆水中同时存在有利和有害的微生物，这是传统黄酒品质不稳定的主要原因。一方面，浸米时间越长，米浆水中生物胺含量越高，带入到发酵体系中的生物胺含量也越高。另一方面，大米表面的糊粉层会进入到米浆水中，并随米浆水进入发酵醪中，糊粉层中的蛋白质会在酶系的作用下产生大量的氨基酸，而大量的氨基酸会使黄酒的口感粗糙，也会促进生物胺的生成，从而降低黄酒的饮后舒适度，因此控制浸米阶段的生物胺含量是十分必要的。

但是，控制浸米阶段的生物胺含量可能带来延长浸米时间、增加投入成本、降低安全性、影响口感等诸多问题。因此，提供一种控制黄酒浸米阶段生物胺含量的简便、经济、安全的方法，对黄酒产业发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株降解生物胺的明登乳杆菌ML4(Lactobacillusmindensis)，于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018627。

本发明的第二个目的是提供含有权利要求1所述明登乳杆菌ML4的微生物制剂。

本发明的第三个目的是提供上述明登乳杆菌ML4在降解生物胺中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述的明登乳杆菌ML4在发酵食品制备中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在黄酒酿造领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，将明登乳杆菌ML4活化扩培后将菌液接种于浸米水中。

在本发明的一种实施方式中，其特征在于，按接种量1‰-80％将明登乳杆菌ML4菌液接种于浸米水浸泡中并循环使用。

在本发明的一种实施方式中，其特征在于，将明登乳杆菌ML4接种活化培养24-72h，然后30-37℃，pH5.4-6.4，扩培24-48h，将明登乳杆菌ML4的菌液添加到浸米水中使用。

本发明的第五个目的是提供上述明登乳杆菌ML4的微生物制剂在降解生物胺中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述微生物制剂在黄酒酿造领域中的应用。

本发明公开了一种不产生物胺且具有降解生物胺功能的明登乳杆菌ML4，将其制成微生物制剂，应用于黄酒酿造的浸米过程中，当以接种量1％-10％接种明登乳杆菌ML4冻干粉时，浸泡120h时，可以使浸泡大米中总生物胺含量下降82.77％，并使达到合格酸度的浸米时间缩短至36h，利用此米浆水循环浸米10次，可使米浆水中生物胺含量相对于不添加菌种降低了95.33％；当以接种量80％接种活化后的明登乳杆菌ML4培养液时，浸泡24h即可达到合格酸度，并使生物胺含量下降85.58％。当接种为0.1％时，浸米40h即可达到合格酸度，且可以使生物胺含量降低80.46％。添加此明登乳杆菌浸米还可以消除浸米环节的臭味、改善米浆水的品质、提高黄酒的饮用舒适度以及安全性等。

生物材料保藏

一株明登乳杆菌菌株ML4(Lactobacillus mindensis)，于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2018627。

附图说明

图1是明登乳杆菌ML4的部分系统发育树；

图2是明登乳杆菌ML4在糯米糖化液中的生长曲线；

图3是浸米过程中添加明登乳杆菌ML4前4h的含水量变化趋势。

具体实施方式

(一)培养基

液体脱羧酶培养基：MRS中添加5-磷酸吡多醛0.025‰，分别添加组氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、赖氨酸各2‰，pH 5.3-pH 5.6。

改进生物胺检测培养基：固体MRS培养基中添加溴甲酚紫0.05‰，5-磷酸吡多醛0.05‰，分别添加组氨酸，酪氨酸，赖氨酸，鸟氨酸各10‰，pH 5.3-pH 5.6。

MRS培养基：蛋白胨10.0g/L；牛肉膏10.0g/L；酵母膏5.0g/L；柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g/L；葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g/L；吐温80 1.0mL/L；乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g/L；磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g/L；硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.58g/L；硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g/L；琼脂18.0g/L；pH 6.2～6.6。

实施例1：筛选不产氨基酸脱羧酶的乳酸菌

(1)将工厂米浆水以及发酵醪按梯度进行稀释，分别稀释10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷倍，各取200μL于MRS固体培养基进行涂布，倒置于37℃厌氧培养箱中培养1-2d。

(2)取上述平板上生长出的单菌落于MRS固体培养基上进行分离纯化，倒置于37℃厌氧培养箱中培养1-2d，重复3次，观察并记录平板上单菌落的形态特征，最后选取具有类似乳酸菌形态的单菌落进行传代培养。

(3)将分离得到的乳酸菌接种液体脱羧酶培养基中，37℃厌氧培养24h，并传代3次。

(4)将步骤3中活化的乳酸菌接种于改进生物胺检测培养基，同时做3组平行，用空白培养基做对照试验。37℃培养48h后，观察颜色变化。

(5)相对于空白对照，培养基均有菌种生长，表示乳酸菌在培养基中可以正常生长。氨基酸脱羧酶阴性菌由于没有代谢碱性生物胺的能力，培养基中就没有生物胺产生，培养基不发生酸碱度的变化，而最终呈现黄色，而氨基酸脱羧酶阳性菌可以将前体氨基酸脱羧形成生物胺，使培养基的酸碱性发生改变，导致最终呈现紫色或者紫红色。

(6)通过平板筛选共得到21株菌，根据显色实验共筛选出不产生物胺的菌株4株。

实施例2：筛选降解生物胺的乳酸菌

1、接种不产氨基酸脱羧酶的菌种

将筛选出的没有氨基酸脱羧酶的菌株活化后，以2‰的接种量分别接种于30mL，pH5.4的含四种生物胺(腐胺、尸胺、组胺和酪胺，浓度分别为100mg/L)的MRS液体培养基中，分别置于37℃条件下恒温培养48h，以未接种的培养基作空白对照。并且微生物在生物胺含量为400mg/L的培养基中生长较为旺盛，表明有较好的耐胺性。

2、丹磺酰氯柱前衍生HPLC法测定生物胺含量

将菌液12000r/min离心，吸取上清1mL与1mL饱和NaHCO₃溶液混合，加入2mL丹磺酰氯(5mg/mL丙酮)衍生试剂，涡旋混匀1min，置于黑暗60℃恒温水浴锅中衍生30min，室温静置后加入0.5mL饱和NaCl溶液，混匀后用乙醚作萃取剂，充分涡旋后静置分层，取上层有机相。再萃取两次，合并上层有机相，氮气吹干后，用1mL乙腈溶解，过0.22μm滤膜后可直接进HPLC测定。

3、色谱条件

色谱柱：XBridgeC18(250nm×4.6nm，5mm)；检测波长：紫外检测器，λ＝254nm；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL；流动相：A：超纯水，B：乙腈；洗脱：梯度洗脱，如表1所示。

表1梯度洗脱程序

4、筛选菌株降解生物胺的情况

通过HPLC检测，得到1株具有明显降低生物胺功能的菌株ML4，如表2所示。相比于对照组，添加了ML4菌株的MRS培养液总生物胺含量为250.04mg/L，为对照组的67.46％，降低了32.54％，对腐胺，尸胺，组胺，酪胺都有较为明显的降低，并且多酪胺的降解率更为突出，为42.70％。

表2筛选菌株降解生物胺含量

实施例3：菌株ML4的分子生物学鉴定

将菌株ML4于MRS平板活化，37℃培养24h。此菌株菌落半透明，菌落直径<0.3cm，菌落扁平无光泽，边缘呈波状。随后挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃培养24h。随后收集菌泥，利用CTAB法提取菌株ML4的DNA，将所得DNA产物进行PCR扩增。

PCR反应体系：MasterMix 2.4μL，上游引物r27f 0.8μL，下游引物1492r 0.8μL，无菌水36μL。

PCR引物：上游引物序列r27f如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列1492r如SEQ IDNO.2所示。

PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环。

扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工进行测序分析。

结果表明，菌株ML4的16S rDNA序列共1498bp，序列信息如SEQ IN NO.3所示。将所得序列在NCBI中使用BLAST程序进行同源性比较，发现菌株ML4与Lactobacillusmindensis IMAU:10214同源性最高，相似度达99％。用MEGA 7.0软件法构建系统发育树，如图1所示，菌株ML4与Lactobacillus mindensis IMAU:10214的亲缘关系最近，可以确定该菌株是明登乳杆菌(Lactobacillus mindensis)，将其送往保藏机构保藏，获得保藏编号CCTCC NO:M 2018627，分类命名为明登乳杆菌ML4。

实施例4：明登乳杆菌冻干粉的制备

1、菌液培养与收集

将明登乳杆菌ML4接入150mL MRS液体培养基中，37℃培养箱中培养18-20h，作为一级种子液；一级种子按接种量5％接入400mL MRS液体培养基中，放入37℃培养箱中培养18-20h，作为二级种子液；二级种子按接种量5％接入6000mL MRS液体培养基中，37℃培养18-20h，得到三级发酵液

将三级发酵液倒入500mL灭菌离心杯(带盖)中，5000r/min离心15min，弃去上清液，再倒入50mL无菌生理盐水洗涤两次菌泥，以同样的离心条件离心，弃去上清液得到乳酸菌菌泥。

2、冻干保护剂的制备

称取125g脱脂乳粉溶于900mL水中，105℃灭菌10min；10g海藻糖溶于100mL水中，115℃灭菌20min，使用前将二者混匀。

3、浓缩菌液的冻干

用混匀好的冻干保护剂溶解获得的乳酸菌菌泥，保护剂添加量为原三级发酵液的1/10，充分震荡，让菌泥均匀溶解后倒入无菌培养皿中，液体高度为1cm左右，用保鲜膜密封后放入-80℃冰箱中预冻3h。将预冻好的浓缩液迅速转移到冻干机中进行冻干，冻干温度为-72℃，压力位0.1MPa，冻干48h后将浓缩液取出敲碎并封装待用。

4、乳酸菌冻干粉活力检测

称取1g冻干粉溶于10mL MRS培养基中复活，37℃培养24h后进行稀释涂布，稀释10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰倍数四个梯度，每个梯度三个平行，涂布后倒置于37℃厌氧培养箱中培养24h进行活菌数计数，结果如表3所示。

表3乳酸菌冻干粉活力检测

实施例5：浸米过程中添加明登乳杆菌ML4的应用1

1、菌株的活化

糯米糖化液：米饭(糯米)、麦芽粉、水按1:0.2:4(m/m/v)混合，加入液化酶2‰，糖化酶2‰，麦曲10％，60℃保温糖化4h，每个1h搅拌一次，糖化结束后，115℃灭菌15min。

取10g明登乳杆菌ML4冻干粉在MRS固体培养基中活化，37℃培养24h。后以4‰的接种量接种到糯米糖化液中37℃，培养24h，期间每隔2h取1次样，连续取到24h，用分光光度计分别测量不同时间段所取菌液的OD600值，糯米糖化液作为空白对照。明登乳杆菌生长曲线图如图2所示。

2、在浸米过程中添加明登乳杆菌ML4

取粳糯米于烧杯中，料液比1∶1.5加入水，取在糯米扩培液中培养18h的明登乳杆菌ML4以体积分数为1％-10％的接种量加入至浸米水中，浸泡120h，以不接种明登乳杆菌浸泡大米为对照组，常温25℃浸泡。因对照组大米1h即吸水饱和，故测定添加明登乳杆菌的浸泡大米前4h的含水量，如图3所示。测量其浸泡120h米浆水与浸泡大米中总酸的含量，结果如表4、5所示。HPLC检测浸泡120h米浆水与浸泡大米中生物胺含量，结果如表6、7所示。

相对于对照组，添加明登乳杆菌ML4的浸米浆水36h即可达到对照组五天的技术效果。。且添加明登乳杆菌ML4的米浆水中生物胺含量为12.39mg/L，相比于对照组降低了80.41％，浸泡大米中总胺含量为5.61mg/kg，降低了82.77％。由此可知，将明登乳杆菌ML4应用于浸米过程可使浸米时间缩短至36h，并且具有明显降低生物胺含量的效果。

表4添加明登乳杆菌后米浆水总酸

表5添加明登乳杆菌后浸泡大米总酸含量

表6添加明登乳杆菌后米浆水中生物胺含量

表7添加明登乳杆菌后浸泡大米生物胺含量

3、明登乳杆菌ML4在循环浸米过程中的应用

将添加明登乳杆菌浸米的米浆水澄清，随后添加适量的清水进行浸米，保证初始循环米浆水酸度不小于6g/L，以此循环10次，检测体系中的生物胺含量，以工厂循环10次的浸米水为对照组，对比生物胺含量如表8所示。根据检测结果显示，传统循环浸米米浆水中生物胺含量较高，而添加了明登乳杆菌的浸米水，在循环利用过程中生物胺积累较少。这是由于乳酸菌不产生生物胺，且具有降解功能，并且在浸米过程中一直为优势菌种，故米浆水中生物胺含量较低，下降了95.33％。

表8循环浸米米浆水生物胺含量

实施例6：浸米过程中添加明登乳杆菌ML4的应用2

将明登乳杆菌于MRS平板划线活化，37℃培养24h，后转接入MRS液体培养基中，37℃，培养24h，随后以4‰的接种量接种到糯米糖化液中，37℃培养48h。

取粳糯米于烧杯中，料液比1:1.5加入水，取活化好的明登乳杆菌ML4以体积分数为1‰的接种量加入至浸米水中，常温25℃浸泡，浸泡168h，测量其浸泡168h米浆水与浸泡大米中总酸的含量以及HPLC检测浸泡米浆水与浸泡大米中生物胺含量。

结果表明，明登乳杆菌CCTCC NO:M 2018627接种量为1‰时，当浸泡时间到达40h时，米浆水的酸度达到7.52g/L，浸泡大米中的酸度达到3.47g/kg。米浆水中生物胺总量为13.23mg/L，降低了79.08％，浸泡大米中生物胺总量为6.25mg/kg，生物胺含量下降了80.46％。

实施例7：浸米过程中添加明登乳杆菌ML4的应用3

将明登乳杆菌于MRS平板划线活化，37℃培养24h，后转接入糯米糖化液中，37℃，培养24h，随后以2‰的接种量接种到糯米糖化液中二次活化，37℃培养48h。

取粳糯米于烧杯中，料液比1:1.5加入水，取活化好的明登乳杆菌ML4以体积分数为80％的接种量加入至浸米水中，常温25℃浸泡，浸泡24h，测量其浸泡24h米浆水与浸泡大米中总酸的含量以及HPLC检测浸泡24h米浆水与浸泡大米中生物胺含量。

结果表明，明登乳杆菌ML4接种量为80％时，当浸泡时间到达24h时，米浆水的酸度达到7.92g/L，浸泡大米中的酸度达到4.03g/kg。米浆水中生物胺总量为10.75mg/L，相比于对照组降低了83.00％，浸泡大米中生物胺总量为5.25mg/kg，下降了85.58％。

虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用于限定本发明，熟悉此技术的人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株降解生物胺的明登乳杆菌及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

accttgttac gactt 15

<210> 3

<211> 1498

<212> DNA

<213> Lactobacillus mindensis

<400> 3

gggaagaacg ccttggcggc atgcctaata catgcaagtc gaacgaacca tcctgaagat 60

tgaagcttgc ttcatgattc agatcttggt gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120

aacctgccct aaagtggggg ataacatctg gaaacaggtg ctaataccgc ataacaacag 180

tcttcacatg atcactgttt aaaagatggc tctgctatcg cttttggatg gacccgcggc 240

gtattagcta gttggtgagg taaaggctca ccaaggcgat gatacgtagc cgacctgaga 300

gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag 360

ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat ggagcaatgc cgcgtgagtg aagaaggttt 420

tcggatcgta aaactctgtt gttgaagaag aacatgcgtg agagtaactg ttcacgtact 480

gacggtattc aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagagaat gtaggcggtt tattaagttt 600

gaagtgaaag ccctcggctc aaccgaggaa gtgcttcgaa aactggtaaa cttgagtgca 660

gaagaggaaa gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc 720

agtggcgaaa ggcggctttc tggtctgtaa ctgacgctga gattcgaaag catgggtagc 780

aaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg 840

gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgatcg 900

caagattgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960

attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata ccatgaaaag ctaagagatt 1020

agtctttccc ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080

gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattcag 1140

ttgggcactc tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcaaat 1200

catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac aacgtgctgc 1260

gaactcgcga gggcaagcaa atcacttaaa accgatctca gttcggattg taggctgcaa 1320

ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380

ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagtcgg 1440

tggggtaacc cttcggggaa ctagccgcct aaggtgggac aaaatgattt attggggg 1498

Claims (9)

1.一株降解生物胺的明登乳杆菌(Lactobacillus mindensis)ML4，于2018年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018627。

2.含有权利要求1所述明登乳杆菌ML4的微生物制剂。

3.权利要求1所述的明登乳杆菌ML4在非疾病的诊断和治疗的降解生物胺中的应用。

4.权利要求1所述的明登乳杆菌ML4在制备发酵食品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是在黄酒酿造领域的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将明登乳杆菌活化扩培后将菌液接种于浸米水中。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将明登乳杆菌ML4接种活化培养24-72h，然后30-37℃，pH5.4-6.4下扩培24-48h，将明登乳杆菌ML4的菌液添加到浸米水中使用。

8.权利要求2所述的微生物制剂在非疾病的诊断和治疗的降解生物胺中的应用。

9.权利要求2所述的微生物制剂在黄酒酿造领域中的应用。

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