CN107699503B - 一种异常威克汉姆酵母bt-1-1及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)BT‑1‑1及其用途。本发明异常威克汉姆酵母BT‑1‑1用于制备高耐受和高吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂，它包括菌种活化、酵母菌扩大培养、离心分离、配制保护剂、添加保护剂与冷冻干燥等步骤。本发明高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂，对重金属铅、镉具备高效的去除能力，并且本发明异常威克汉姆酵母用作生产葡萄酒、饲料等的产香菌株，食用安全可靠。
Description
【技术领域】
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)BT-1-1，还涉及异常威克汉姆酵母BT-1-1的用途。
【背景技术】
尽管重金属污染不是最近才有的现象，但这仍是环境污染危害人类健康中的最主要问题。目前，针对人和动物体铅、镉急性中毒，常服用巯基类化合物如二巯基丙醇(BAL)、二巯基丙磺酸盐(DMPS)等进行解毒，然而缓解铅、镉慢性中毒和蓄积问题仍没有行之有效的方法。酵母菌是食品发酵中应用广泛、安全的微生物，且易培养、繁殖速度快，越来越多的报道发现其对于重金属铅、镉具有良好的耐受性和吸附能力，但对实际应用到人体内作为重金属新型生物吸附剂的研究尚处于起步阶段。因此，本发明具有广泛的应用前景。
异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)作为产香酵母被广泛应用到白酒、葡萄酒、酱油、醋、面包等发酵食品和发酵饲料中，例如CN 103184167 A公开了一种异常威克汉姆酵母及其在白酒生产中应用，CN 103820342 B涉及一种异常威克汉姆酵母及其在制备富硒产品中应用，CN 104109639 B涉及异常威克汉姆酵母在果酒生产中的应用，CN105349444 A公开了异常威克汉姆酵母及其在食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒等传统发酵行业及食品工业中的应用，CN 105861346 A公开了异常威克汉姆酵母及其在生产白酒、葡萄酒等酒中的应用，CN 106635832 A公开了异常威克汉姆酵母及其滇橄榄果酒发酵中的应用。但是，异常威克汉姆酵母在防治重金属方面未见报道。
因此，本发明人针对现有技术状况，在通过大量实验研究与分析总结的基础之上，终于完成了。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)BT-1-1。
本发明的另一个目的是提供所述一种异常威克汉姆酵母BT-1-1的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)BT-1-1，该菌株已于2017年11月22日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.14947。
本发明还涉及所述的异常威克汉姆酵母BT-1-1在制备高耐受和高吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂中的用途。
根据本发明的一种优选方式，所述微生物制剂的制备方法如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的异常威克汉姆酵母BT-1-1接种于麦芽汁培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养24h，得到第一代摇床培养物；
B、酵母菌扩大培养
按照YEPD培养基体积计2％接种量，将步骤A得到的摇床培养物接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养18h，得到第二代摇床培养物；然后
按照YEPD培养基体积计2％接种量，将步骤B得到的第二代摇床培养物接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养12h，得到第三代摇床培养物；
C、离心分离
将步骤B得到的第三代摇床培养物在转速6000r/min下离心4min，弃去上清，得到的沉淀物用等量无菌生理盐水洗涤离心分离3次，得到的沉淀物为异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥；
D、配制保护剂
将脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计10％脱脂乳、10％蔗糖、5％谷氨酸钠与3％甘油的保护剂；
E、添加保护剂
把步骤D制备的保护剂添加到步骤C得到的异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥中，其中以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：10，振荡混匀；
F、冷冻干燥：
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冻3min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-53℃与68×10-3Mb的条件下干燥18h，铝箔袋真空包装，得到高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。
本发明涉及所述制备方法制备得到的高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。
根据本发明的一种优选方式，所述的高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂在发酵食品或发酵饲料中的用途。
根据本发明的另一种优选方式，所述高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂，异常威克汉姆酵母BT-1-1在9000mg/L Pb2+胁迫下能够生长，对100mg/L Pb2+的去除率达到95.96％以上。
根据本发明的另一种优选方式，所述高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂，异常威克汉姆酵母BT-1-1在1400mg/L Cd2+胁迫下能够生长，对50mg/L Cd2+的去除率达到73.90％以上。
根据本发明的另一种优选方式，所述高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂，其活细胞对0.2mmol的DPPH自由基清除率是71.7％以上，同时对OH·自由基的清除率是42.2％以上。
下面将更详细地描述本发明。
一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)BT-1-1，该菌株已于2017年11月22日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.14947。
高抗重金属铅、镉酵母菌筛选与驯化方法如下：
采用常规方法从内蒙古包头钢铁厂重金属污染区、包头黄河流段污染区和白云鄂博矿区分离出103株酵母菌，利用含重金属铅、镉连续培养的方法对它们进行了高耐受重金属铅、镉的筛选与驯化，其中9株菌株对铅耐受达到6000-10000mg/L、对镉耐受达到800-2000mg/L；这9株菌株分别记为异常威克汉姆酵母BT-1-1、异常威克汉姆酵母QF-1-1、异常威克汉姆酵母QI-1-6、异常威克汉姆酵母QI-1-7、胶红酵母QA-2-1、胶红酵母QD-2-6、胶红酵母QJ-1-2、金佩梅奇酵母QE-1-12、金佩梅奇酵母QK-1-5。这些菌株均保藏于内蒙古农业大学食品科学与工程学院微生物实验室中。
高吸附重金属铅、镉菌株筛选如下：
将筛选的9株高耐受重金属铅、镉菌株接种于麦芽汁培养基中，在温度30℃与转速150r/min下摇床培养24h，得到第一代培养物；第一代培养物按照YEPD培养基体积2％的接种量接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min下摇床培养18h，得到第二代培养物；第二代培养物按照YEPD培养基体积2％的接种量接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min下摇床培养12h，得到第三代培养物。第三代培养物在转速6000r/min下离心4min，弃去上清，使用等量的无菌超纯水洗涤离心分离菌体3次，收集菌泥，使用少量超纯水制成菌悬液。在50mL三角瓶中加入20mL铅储备液(100mg/L，pH6.0)或镉储备液(50mg/L，pH6.0)，按照菌泥湿重为9g/L的比例把上述菌悬液加入三角瓶中，使用恒温摇床培养器在温度30℃与转速150r/min下振荡培养50min，然后以转速14000r/min离心分离4min，移取上清液，采用常规火焰原子吸收光谱法检测分析铅、镉含量。筛选结果表明，其中4株异常威克汉姆酵母(BT-1-1、QF-1-1、QI-1-6、QI-1-7)与2株金佩梅奇酵母(QK-1-5、QE-1-12)对铅、镉去除率分别高达78.94％-95.96％和63.5％-76.8％。
抗逆性菌株筛选如下：
采用常规抗逆性筛选方法(辛羚,郭本恒,吴正钧.3株乳杆菌在模拟消化环境中存活性能的研究[J].中国乳品工业,2005,33(5):15-17.)对上述筛选的6株菌株进行抗逆性筛选，结果表明4株异常威克汉姆酵母(BT-1-1、QF-1-1、QI-1-6、QI-1-7)在温度20～37℃下生长良好，在初始pH3.0～9.0、高渗环境0％-8％NaCl胁迫下仍能够达到一个较高的生长量，因此，它们具备较好的抗逆性。
益生性菌株筛选如下：
采用常规益生性菌株筛选方法(赵芳,李艳琴,李彬春.模拟人体胃肠道环境筛选益生乳杆菌[J].微生物学通报,2016,43(6):1396-1403.)对上述4株菌株进行了益生性筛选，结果发现在浓度为以重量计0％～0.3％的胆盐存在下，BT-1-1生长不受影响，经过人工胃液和人工肠液连续处理后活菌数仍高达105CFU/mL以上，存活率为65.13％；活细胞对0.2mmol/L DPPH·自由基和OH·自由基的清除率分别可达71.7％、56.32％。
下面将详细描述异常威克汉姆酵母BT-1-1。
I、异常威克汉姆酵母菌株BT-1-1的鉴定如下：
根据《The Yeast，a Taxonomic Study》第五版和NCBI数据库进行了下述试验。
异常威克汉姆酵母BT-1-1菌株形态观察结果参见表1、图1与图2。
表1：异常威克汉姆酵母BT-1-1形态观察结果
生理生化特征观察结果参见下表2、3与4。
表2：异常威克汉姆酵母BT-1-1的糖发酵试验结果
注：+阳性；w弱阳性；-阴性s缓慢的阳性
表3：异常威克汉姆酵母BT-1-1的碳氮源同化结果
注：+阳性；w弱阳性；-阴性；
表中：
1-葡萄糖；2-麦芽糖；3-蔗糖；4-半乳糖；5-乳糖；6-海藻糖；7-柠檬酸；8-乳酸；9-甲醇；10-乙醇；11-甘油；12-山梨醇；
I-硫酸铵；II-硝酸钾；III-亚硝酸钠；IV-盐酸乙胺；V-二盐酸乙胺；VI-赖氨酸。
表4：异常威克汉姆酵母BT-1-1的生理特性试验
注：+阳性；w弱阳性；-阴性
26SrRNA分析结果参见表5，基因片段分析鉴定BT-1-1为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。
表5：BT-1-1的26SrRNA基因片段鉴定结果
II、异常威克汉姆酵母BT-1-1对铅、镉的耐受性和吸附性试验结果
试验方法：
通过含重金属铅、镉固体划线培养观察的方法对BT-1-1进行耐受性评价；吸附性的详细方法是在50mL三角瓶中加入20mL铅储备液(100mg/L，pH6.0)或镉储备液(50mg/L，pH6.0)，按照菌泥湿重为9g/L的比例把BT-1-1菌悬液(先用少量超纯水将菌体制成悬浮液)加入三角瓶中，使用恒温摇床培养器在温度30℃与转速150r/min下振荡培养50min，然后以转速14000r/min离心分离4min，移取上清液，采用常规火焰原子吸收光谱法检测分析铅、镉含量。
试验结果：
异常威克汉姆酵母BT-1-1经过驯化后，分别在9000mg/L Pb2+和1400mg/L Cd2+胁迫下能够生长，对100mg/LPb2+和50mg/L Cd2+的去除率分别高达95.96％、73.90％。
III、异常威克汉姆酵母BT-1-1的抗逆性研究
试验方法：
利用无菌生理盐水将第三代菌株BT-1-1离心洗涤(6000r/min，4min)3次制成供试菌液(约为1×107CFU/mL)后，以2％的比例分别接入pH1～9、0％～8％NaCl和0％～0.3％胆盐的YEPD液体培养基置于30℃培养24h后，利用酶标仪以相应空白培养基为对照，测量其OD630nm的值。以pH6.0的标准YEPD培养组为对照组，分析不同逆境对菌株生长的影响。
试验结果：
异常威克汉姆酵母BT-1-1对酸碱、高渗、胆盐等均具有较好的耐受性，具体表现如下：异常威克汉姆酵母BT-1-1在pH值3～9范围内均能良好生长，其中最适生长pH值为pH5～6，因此它对酸碱均具有一定的耐受能力；
NaCl的高渗环境对异常威克汉姆酵母BT-1-1菌株有不同程度的抑制作用，但在浓度0％～8％范围内均能生长，其中在浓度0％～2％范围内生长不受影响，而在浓度3％开始受到抑制，差异显著(p<0.05)，在浓度达到8％时，菌株维持较低的生长量，差异极显著(p<0.01)；该菌株在胆盐浓度0％～0.3％范围内的生长不受其影响(p>0.05)。
IV、异常威克汉姆酵母BT-1-1的益生特性研究
该菌株如要在人和动物体内发挥其胞内累积重金属作用，则其经过胃肠液处理就必须要保持一定的活性。异常威克汉姆酵母菌株BT-1-1经胃液和胰液单独处理时与原液活菌数相比差异不显著(P>0.05)，为107CFU/mL；经胆液处理后活菌数下降至106CFU/mL；经胃液处理后继续经肠液(胰液和胆液2：1混合)处理，菌株的活菌数出现了显著下降(P<0.05)，但仍维持在一个较高的水平，可达105CFU/mL。这些试验进一步证实，异常威克汉姆酵母BT-1-1具备良好的抗逆性；对菌株抗氧化性进行研究，发现其活细胞对0.2mmol的DPPH自由基清除率在71.7％，同时对OH·自由基的清除率可达42.24％，具备一定的研究和应用潜质。
本发明还涉及所述的异常威克汉姆酵母BT-1-1在制备高耐受和高吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂中的用途。
所述微生物制剂的制备方法如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的异常威克汉姆酵母BT-1-1接种于麦芽汁培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养24h，得到第一代摇床培养物；
所述的麦芽汁培养基的制备方法参见CN 106676006A公开的制备方法。例如由广东环凯微生物科技有限公司以商品名麦芽汁培养基(Malt Extract Medium)的产品。
这个步骤以及后续步骤使用的摇床都是目前市场上销售的产品，例如上海一恒科学仪器有限公司以商品名THZ-103B销售的摇床；
采用国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数分析方法检测，第一代摇床培养物含有4～5×106CFU/mL异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。
B、酵母菌扩大培养
按照YEPD培养基体积计2％接种量，将步骤A得到的摇床培养物接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养18h，得到第二代摇床培养物；然后
按照YEPD培养基体积计2％接种量，将步骤B得到的第二代摇床培养物接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养12h，得到第三代摇床培养物；
在本发明中，第二代摇床培养的基本目的是增强细胞的活力和增殖速度；第三代摇床培养的基本目的是获得大量处于对数末期的较强活力菌体细胞。
所述的YEPD培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)，称之酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，是本技术领域里通常使用的培养基。本发明使用的YEPD培养基是目前市场上销售的产品，例如由青岛海博生物技术有限公司以商品名YEPD液体培养基的培养基。
采用国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数分析方法检测，第二代摇床培养物含有6～7×106CFU/mL异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。第三代摇床培养物含有8～9×107CFU/mL异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。
C、离心分离
将步骤B得到的第三代摇床培养物在转速6000r/min下离心4min，弃去上清，得到的沉淀物用等量无菌生理盐水洗涤离心分离3次，得到的沉淀物为异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥；
本发明使用的离心机是目前市场上销售的产品，例如由德国艾本德股份公司以商品名Centrifuge 5810R离心机的产品。
D、配制保护剂
将脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计10％脱脂乳、10％蔗糖、5％谷氨酸钠与3％甘油的保护剂；
本发明使用保护剂主要目的在于降低真空冷冻干燥过程中菌体细胞因急剧的温度下降和脱水作用带来的死亡和为后期的应用提供细胞生长的必需营养物质。其中脱脂乳在保护剂中的基本作用是与细胞壁表面基团结合，降低真空冷冻干燥过程中温度的急剧下降造成的细胞膜冻伤现象，同时为后期的应用提供细胞生长所必需的氮源和其它微量营养物质；蔗糖在保护剂中的基本作用是降低真空冷冻干燥过程中细胞的冻伤死亡现象，并为后期的应用提供细胞生长所必需的碳源；谷氨酸钠在保护剂中的基本作用是降低真空冷冻干燥过程中细胞的冻伤死亡现象；甘油在保护剂中的基本作用是进入细胞，降低真空冷冻干燥强烈的脱水作用，保护细胞。
在本发明中，脱脂乳蔗糖、谷氨酸钠与甘油浓度可以高些或低些，这些浓度变化范围通常不应该超过5％，否则会出现菌粉活细胞数下降等问题。本发明使用的脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油都是目前市场上销售的产品。例如由英国碧迪公司以商品名Skim Milk的脱脂乳，由国药集团化学试剂有限公司以商品名蔗糖的蔗糖，由国药集团化学试剂有限公司以商品名L-谷氨酸钠的谷氨酸钠，由国药集团化学试剂有限公司以商品名丙三醇的甘油。
E、添加保护剂
把步骤D制备的保护剂添加到步骤C得到的异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥中，其中以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：10，振荡混匀；
在本发明中，菌泥与保护剂的比可以适当高些或低些，但这个比变化范围通常不应该超过5％，否则会造成单位质量活细胞数下降而不利。
F、冷冻干燥
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冻3min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-53℃与68×10-3Mb的条件下干燥18h，铝箔袋真空包装，得到高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。
本发明使用的真空冷冻干燥机是目前市场上销售的产品，例如由美国LABCONCO公司以商品名
的产品。
本发明还涉及由所述制备方法制备得到的高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。
采用国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数和干湿比计算等分析方法确定，这种微生物制剂含有以重量计20％～25％脱脂乳、20％～25％蔗糖、10％～12.5％谷氨酸钠、5％～7.5％甘油、20％～25％干菌粉；异常威克汉姆酵母BT-1-1含量为1×109CPU/g以上。
本发明还涉及所述的高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂在发酵食品或发酵饲料中的用途。
在所述高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂中，异常威克汉姆酵母BT-1-1在9000mg/L Pb2+胁迫下能够生长，对100mg/L Pb2+的去除率达到95.96％以上。
在所述高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂中，异常威克汉姆酵母BT-1-1在1400mg/L Cd2+胁迫下能够生长，对50mg/L Cd2+的去除率达到73.90％以上。
在所述高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂中，其活细胞对0.2mmol的DPPH自由基清除率是71.7％以上，同时对OH·自由基的清除率是42.2％以上。
在本发明中，所述的发酵食品例如是面包、馒头、果酒、乳饮料、马奶酒、酱油等；通常按照发酵食品总重量计0.3％～0.6％，在这些发酵食品的常规生产过程中添加本发明高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。
所述的发酵饲料例如是鱼饲料、鸡饲料、猪饲料、羊饲料、奶牛饲料等；通常按照发酵饲料总重量计0.5％～0.8％，在这些发酵饲料的常规生产过程中添加本发明高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。
[有益效果]
本发明的有益效果是：
本发明高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂，对重金属铅、镉具备高效的去除能力，并且本发明异常威克汉姆酵母用作生产葡萄酒、饲料等的产香菌株，食用安全可靠。本发明生产的微生物制剂不仅可以清除人和动物体内的重金属铅、镉，还对自由基具备较好的清除能力，在一定程度上可以缓解长期暴露在重金属污染环境中带来的氧化应激现象。因此本发明微生物制剂可以直接作为人和动物的重金属生物吸附剂服用，也可进一步应用到食品发酵、饲料发酵生产中等。
【附图说明】
图1是异常威克汉姆酵母BT-1-1单菌落形态(×2倍)；
图2是异常威克汉姆酵母BT-1-1单细胞水浸片(×600倍)；
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明微生物制剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的异常威克汉姆酵母BT-1-1接种于由广东环凯微生物科技有限公司以商品名麦芽汁培养基(Malt Extract Medium)销售的麦芽汁培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下在由上海一恒科学仪器有限公司以商品名THZ-103B销售的摇床中摇床培养24h，得到第一代摇床培养物；采用国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数分析方法检测，第一代摇床培养物含有4～5×106CFU/mL异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。
B、酵母菌扩大培养
按照YEPD培养基体积计2％接种量，将步骤A得到的摇床培养物接种于由青岛海博生物技术有限公司以商品名YEPD液体培养基销售的YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下在上海一恒科学仪器有限公司以商品名THZ-103B销售的摇床中摇床培养18h，得到第二代摇床培养物；采用国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数分析方法检测，第二代摇床培养物含有6～7×106CFU/mL异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。然后
按照YEPD培养基体积计2％接种量，将步骤B得到的第二代摇床培养物接种于由青岛海博生物技术有限公司以商品名YEPD液体培养基销售的YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下在由上海一恒科学仪器有限公司以商品名THZ-103B销售的摇床中摇床培养12h，得到第三代摇床培养物；采用国家标准GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数分析方法检测，第三代摇床培养物含有8～9×107CFU/mL异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。
C、离心分离
将步骤B得到的第三代摇床培养物在由德国艾本德股份公司以商品名Centrifuge5810R销售的离心机中在转速6000r/min下离心4min，弃去上清，得到的沉淀物用等量无菌生理盐水离心分离3次，洗涤得到的沉淀物为异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥；
D、配制保护剂
将由英国碧迪公司以商品名Skim Milk销售的脱脂乳、由国药集团化学试剂有限公司以商品名L-谷氨酸钠、蔗糖、丙三醇销售的谷氨酸钠、蔗糖、甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计10％脱脂乳、10％蔗糖、5％谷氨酸钠与3％甘油的保护剂；
E、添加保护剂
把步骤D制备的保护剂添加到步骤C得到的异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥中，其中以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：10，使用由德国IKA公司以商品名Vortex3销售的振荡器进行振荡混匀；
F、冷冻干燥：
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冻3min，再将其迅速放入由美国LABCONCO公司以商品名
销售的真空冷冻干燥机中，在温度-53℃与68×10-3Mb的条件下干燥18h，铝箔袋真空包装，得到高耐受和高吸附重金属铅、镉酵母菌微生物制剂。国家标准GB4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数分析方法检测，该微生物制剂中含有1×109CFU/mL以上的异常威克汉姆酵母BT-1-1活细胞。
实施例2：本发明微生物制剂用于生产马奶酒发酵食品中的应用
该实施例的实施方式如下：
根据CN 101260358 B公开的马奶酒生产流程，在第一步发酵步骤按照0.4％量添加本发明微生物制剂，得到所述的马奶酒发酵食品。
根据GB14923-2001试验动物国家标准进行试验，试验结果表明，大鼠饲用所述的马奶酒发酵食品能够降低其血液中铅与镉含量分别达到未干预组的37.7％与46.7％。
实施例3：本发明微生物制剂用于生产发酵猪饲料中的应用
该实施例的实施方式如下：
根据CN 102228129 B公开的发酵饲料生产流程，在半固态发酵步骤按照0.5％量添加本发明微生物制剂，得到所述的猪发酵饲料，
根据GB14923-2001试验动物国家标准进行试验，试验结果表明，喂用所述的发酵猪饲料能够降低其血液中铅与镉含量分别达到未干预组的43.3％与56.7％。
Claims (5)
1.一株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)BT-1-1，该菌株已于2017年11月22日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.14947。
2.根据权利要求1所述的异常威克汉姆酵母BT-1-1在制备耐受和吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述微生物制剂的制备方法如下：
A、菌种活化
挑取一环甘油保存的异常威克汉姆酵母BT-1-1接种于麦芽汁培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养24h，得到第一代摇床培养物；
B、酵母菌扩大培养
按照YEPD培养基体积计2%接种量，将步骤A得到的摇床培养物接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养18h，得到第二代摇床培养物；然后
按照YEPD培养基体积计2%接种量，将步骤B得到的第二代摇床培养物接种于YEPD培养基中，在温度30℃与转速150r/min的条件下摇床培养12h，得到第三代摇床培养物；
C、离心分离
将步骤B得到的第三代摇床培养物在转速6000r/min下离心4min，弃去上清，得到的沉淀物用等量无菌生理盐水洗涤离心分离3次，得到的沉淀物为异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥；
D、配制保护剂
将脱脂乳、蔗糖、谷氨酸钠与甘油溶于蒸馏水中，得到含有以重量计10%脱脂乳、10%蔗糖、5%谷氨酸钠与3%甘油的保护剂；
E、添加保护剂
把步骤D制备的保护剂添加到步骤C得到的异常威克汉姆酵母BT-1-1菌泥中，其中以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：10，振荡混匀；
F、冷冻干燥：
将步骤E得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冻3min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-53℃与68×10-3 Mb的条件下干燥18h，铝箔袋真空包装，得到耐受和吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂。
4.根据权利要求3中所述的制备方法制备得到的耐受和吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂。
5.根据权利要求4所述的耐受和吸附重金属铅与镉酵母菌微生物制剂在发酵食品或发酵饲料中的用途。
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