CN103468615B - 一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法 - Google Patents

一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，其特征是将分离自内蒙古民族乳制品酸马奶酒中的乳酸菌和酵母菌进行共生组合筛选，选出一组具有互相促进作用的屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4。在优化的脱脂乳培养基上培养筛选出的屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4时，乳酸菌活菌数达到2.88×109CFU/mL；酵母菌的活菌数达到3.3×108CFU/mL，双菌培养促进乳酸菌生长作用较好。将培养收获的双菌冷冻干燥得到一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂，所述微生物制剂共生作用好、产酸能力强。

Description

一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及的是一种全新的乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，以及通过所述方法所获得的微生物制剂。
背景技术
微生物制剂在食品加工、营养保健等领域具有广泛的应用，如酸奶发酵剂；面包、馒头发酵剂；家畜饲料发酵剂等。但作为乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂还很少，特别是来自内蒙古民族乳制品酸马奶酒中的微生物菌种就更少见报道。酸马奶酒是一种以马奶为原料，乳酸菌和酵母菌共同自然发酵而形成的一种饮品，其以具有营养、保健、医疗功能和风味独特而著称，在蒙医药领域一直是治疗结核病、心血管疾病、高血压、免疫力低下等疾病的辅助药品。至今在东欧、蒙古国以及我国的内蒙古、新疆地区兴盛不衰。其医疗保健作用一直吸引着国内外学者的研究兴趣，尤其是日本、美国、新加坡以及国内的学者对发酵酸马奶的微生物种群投入了大量的研究，取得了可喜的成果，但至今还没有将酸马奶的微生物种群应用到产品开发方面。因此，本发明是具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，以及通过所述方法所获得的微生物制剂。本发明的乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，是按下述步骤完成的：
（1）乳酸菌的活化和酵母菌的活化：将冻干保存的屎肠球菌Enterococcusfaecium HE5菌株接种至MRS液体培养基中，在其最适增殖温度37℃下培养18h，连续增殖三代，备用；将冻干保存的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeJ-4接种于YEPD液体培养基中，30℃、130r/min摇床培养至36h，连续增殖三代，备用；
（2）乳酸菌和酵母菌混合发酵：将活化三代的屎肠球菌HE5与酿酒酵母J-4接入优化的脱脂乳培养基，先经过30℃、130r/min摇床培养至12h，后进入37℃恒温静止培养至36h；
（3）将上述发酵液经6000r/min离心15min，弃上清，用等量的灭菌生理盐水清洗离心菌体2～3次，收集菌体。
（4）将收集的菌体，按照菌体：保护剂=1:10（g/ml）比例将保护剂加入制得的菌体中，振荡混匀，分装入冻存盘，然后将其放在-80℃冰箱中预冻12h，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在-53℃，68×10-3Mb的条件下干燥18h左右，即可收获成品。
（5）包装：铝箔袋真空包装，
其中所述步骤（2）中发酵菌株屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4的接种体积配比为1:1，优化的脱脂乳培养基为脱脂乳粉10g/100mL、大豆蛋白胨1g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL，所述步骤（3）中发酵产物需添加冷冻保护剂：脱脂乳浓度10%、蔗糖浓度10%、谷氨酸钠5%、甘油3%，再冷冻干燥。
本发明另一方面还涉及上述生产方法所获得的微生物制剂，所述微生物制剂包含冷冻干燥的屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4。本发明中所用的屎肠球菌和毕赤氏酵母菌已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其中屎肠球菌菌株的保藏编号为CGMCC NO.7766,酿酒酵母J-4的保藏编号为CGMCCNO.7765。
另一方面，本发明还涉及所述的微生物制剂的用途，本发明的这种微生物制剂可以进一步应用到食品发酵、饲料发酵生产中。
本发明的具体实施包括以下工序：
（1）共生作用好的乳酸菌和酵母菌筛选：在各自培养发酵过程中，加入对方的发酵培养液，均能促进生长和增强产酸能力。选出了一组共生作用好的屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4。
（2）乳酸菌的活化和酵母菌的活化：将冻干保存的屎肠球菌HE5菌株接种至MRS液体培养基中，在其最适增殖温度37℃下培养18h，连续增殖三代，备用；将冻干酿酒酵母J-4接种于YEPD液体培养基中，30℃、130r/min摇床培养至36h，连续增殖三代，备用。
（3）：乳酸菌和酵母菌混合发酵：将活化三代的乳酸菌与酵母菌按照1:1接种比例、总接种量为4%接入优化脱脂乳培养基。优化脱脂乳培养基为：脱脂乳粉10g/100mL、大豆蛋白胨1g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL。先经过30℃、130r/min摇床培养至12h后进入37℃恒温静止培养至36h。
（4）将上述发酵液经6000r/min离心15min，弃上清，用等量的灭菌生理盐水清洗离心菌体2～3次，收集菌体。
（5）添加保护剂：将收集的菌体，按照菌体:保护剂=1:10（g/ml）比例将保护剂加入制得的菌体中，振荡混匀。保护剂配制：脱脂乳浓度10%、蔗糖浓度10%、谷氨酸钠5%、甘油3%。
（6）冷冻干燥：将加入保护剂的发酵液放入-80℃冰箱中预冻12h，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在-53℃，68×10-3Mb的条件下干燥18h左右，即可收获成品。
（7）包装：铝箔袋真空包装。
经上述工艺生产的乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂，共生效果好、产酸能力强。由于本发明使用乳酸菌和酵母菌均来自于自然发酵酸马奶酒，并经过安全性分析，因此食用安全可靠。本发明生产的微生物制剂是在传统酸马奶酒研究的基础上开发的一种生物发酵剂，除菌种的产酸能力强外，还具有一定的抑菌特性，可以用来开发发酵食品、发酵饲料等产品；还可作为生物保鲜添加剂添加到食品中，减少化学防腐剂的使用量，开发绿色食品；可以作为治疗肠道疾病的辅助产品等。
本发明的屎肠球菌Enterococcus faeciumHE5菌株，保藏编号为CGMCC NO.7766，于2013年06月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeJ-4，保藏编号为CGMCC NO.7765，于2013年06月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
实施例1：菌株组合的筛选
共生作用好的乳酸菌和酵母菌筛选：共选择来自内蒙古锡林郭勒盟牧区酸马奶酒中分离鉴定的产酸作用较强的12株乳酸菌和8株酵母菌为供试菌株。其中乳酸杆菌6株，分别是HE1-1麦芽香乳杆菌、HE1-2旧金山乳杆菌、HE1-3干酪乳杆菌、HE1-4干酪乳杆菌、HE1-5干酪乳杆菌、HE1-6旧金山乳杆菌；乳酸球菌6株，分别是HE1屎肠球菌、HE2屎肠球菌、HE3屎肠球菌、HE4坚强肠球菌、HE5屎肠球菌、HE6假鸟肠球菌；酵母菌8株，分别是J-1类酵母、J-2有孢圆酵母、J-3克勒克酵母、J-4酒香酵母、J-5厚壁孢酵母、J-6厚壁孢酵母、J-7类酵母、J-8内孢霉酵母。这些菌株均保藏于内蒙古农业大学食品科学与工程学院微生物实验室，可以购买。
代谢产物的制备：将活化好的乳酸菌分别接种在MRS液体培养基中，37℃恒温培养50h;将活化好的酵母菌分别接种在YPD液体培养基中，30℃恒温培养70h。将培养液以4000g离心20min，取上清液，并用0.45μm的灭菌滤菌膜进行过滤处理，即得到无菌代谢产物，乳酸菌代谢产物pH值调至5.5±0.2备用，酵母菌代谢产物pH值调至6.5±0.2备用。
共生菌株的筛选：将制备好的乳酸菌代谢产物按30%的量加入到YPD液体培养基中，按照同样比例在YPD液体培养基中添加pH=5.5±0.2的生理盐水作为对照，按基础培养基量的2%接入酵母菌，30℃恒温培养30h测其OD值。与对照组比较，OD值高于对照组为有促进作用，低于对照组为有抑制作用。
将制备好的酵母菌代谢产物按30%的量加入到MRS液体培养基中，按照同样比例在MRS液体培养基中添加pH=6.5±0.2的生理盐水作为对照，按基础培养基量的2%接入乳酸菌，37℃恒温培养20h测其OD值。同理判断是否有促进作用。
在各自培养基中交互添加代谢物作为试验组,以各自培养基中添加等量生理盐水作对照，分析比较稳定期的浊度值和活菌数。乳酸菌各自对不同酵母菌有促进作用的有8株次；酵母菌对乳酸菌有促进作用的有18株次。乳酸菌和酵母菌相互均能促进生长和增强产酸能力有两个组合HE5与J-4和LC1和乳酸菌HE4和酵母菌J-3，其中选出了一组共生作用好的屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4。
通过测定屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4在脱脂乳培养基中混合培养和二者在各自培养基中交互添加代谢物培养的发酵特性表明：①酿酒酵母J-4的代谢物可缓冲屎肠球菌HE5发酵液pH值下降速率，减小酸抑制作用，促进菌株的生长，使得滴定酸度增大。②屎肠球菌HE5的代谢物同样促进酿酒酵母J-4的生长，使酿酒酵母J-4发酵液滴定酸度升高，pH值降低，接近酵母菌最适生长pH值条件。
通过测定屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4在脱脂乳培养基中混合培养和单独培养的发酵过程中代谢产物中游离氨基氮、有机酸、挥发性风味物质及维生素的含量表明：①酿酒酵母J-4蛋白水解力较屎肠球菌HE5强，屎肠球菌HE5代谢物可促进酿酒酵母J-4发酵产生游离氨基氮。②酿酒酵母J-4对屎肠球菌HE5发酵脱脂乳过程中产乳酸、丙酸和异戊酸有一定的促进作用，而对屎肠球菌HE5发酵产乙酸、丁酸和戊酸没有明显影响，酿酒酵母J-4使得屎肠球菌HE5发酵过程产的甲酸减少。酿酒酵母J-4提高了屎肠球菌HE5发酵液中苹果酸、酒石酸和柠檬酸的含量。③酿酒酵母J-4对屎肠球菌HE5发酵产乙醛有显著促进作用(P<0.05)，而对产丁二酮没有影响，屎肠球菌HE5使酿酒酵母J-4发酵产酒精量降低。
实施例2制备微生物制剂
本实施例生产工艺主要包括：菌种活化→培养基配制→接种→发酵→离心洗涤→添加冷冻保护剂→预冻→冻干→真空包装。
其中操作要点如下：
（1）乳酸菌的活化和酵母菌的活化：将冻干保存的屎肠球菌HE5菌株接种至MRS液体培养基中，在其最适增殖温度37℃下培养18h，连续增殖三代，备用；将冻干酿酒酵母J-4接种于YEPD液体培养基中，30℃、130r/min摇床培养至36h，连续增殖三代，备用。
（2）培养基配制：脱脂乳粉10g/100mL、大豆蛋白胨0.5g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL。溶解后经过121℃高温灭菌15min。
（3）接种：将活化三代的乳酸菌与酵母菌按照1:1接种比例、总接种量为4%接入优化脱脂乳培养基。
（4）发酵：先经过30℃、130r/min摇床培养至12h后进入37℃恒温静止培养至36h。乳酸菌活菌数达到109CFU/mL以上；酵母菌活菌数达到108CFU/mL。
（5）将上述发酵液经6000r/min离心15min，弃上清，用等量的灭菌生理盐水清洗离心菌体2～3次，收集菌体。
（6）添加冷冻保护剂：将收集的菌体，按照菌体:保护剂=1:10（g/ml）比例将保护剂加入制得的菌体中，振荡混匀。保护剂配制：脱脂乳浓度10%、蔗糖浓度10%、谷氨酸钠5%、甘油3%。
（7）冷冻干燥：将加入保护剂的发酵液放入-80℃冰箱中预冻12h，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在-53℃，68×10-3Mb的条件下干燥18h左右，即可收获成品。
（8）包装：铝箔袋真空包装。
实施例2：
本实施例过程包括：
（1）屎肠球菌HE5菌株的生物学特性：屎肠球菌HE5菌株分离自内蒙古锡林郭勒盟牧区的酸马奶酒中，目前已保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏编号为CGMCC NO.7766。该菌株在MRS液体培养基中，37℃恒温培养，OD值和活菌数变化均为前8h增长迅速，8h后增长趋缓，在20h达到稳定期，活菌数达到1.8×108CFU/ml，pH为4.13；该菌株产酸能力强，发酵上清液对枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌均具有一定的抑菌特性。
（2）酿酒酵母J-4菌株的生物学特性：酿酒酵母J-4菌株分离自内蒙古锡林郭勒盟牧区的酸马奶酒中，目前已保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，该菌株的保藏编号为CGMCC NO.7765。该菌株接种在YPD液体培养基中，30℃恒温培养，OD值和活菌数变化均为前12h增长迅速，12h后增长趋缓，28h活菌数为最大，达3.8×107CFU/ml。
（3）乳酸菌的活化和酵母菌的活化：将冻干保存的屎肠球菌HE5菌株接种至MRS液体培养基中，在其最适增殖温度37℃下培养18h，连续增殖三代，备用；将冻干酿酒酵母J-4接种于YEPD液体培养基中，30℃、130r/min摇床培养至36h，连续增殖三代，备用。
（4）培养基配制：脱脂乳粉10g/100mL、大豆蛋白胨1g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL。溶解后经过121℃高温灭菌15min。
（5）接种：将活化三代的乳酸菌与酵母菌按照1:1接种比例、总接种量为5%接入优化脱脂乳培养基。
（6）发酵：先经过30℃、130r/min摇床培养至12h后进入37℃恒温静止培养至36h。乳酸菌活菌数达到109CFU/mL以上；酵母菌活菌数达到108CFU/mL。
（7）将上述发酵液经6000r/min离心15min，弃上清，用等量的灭菌生理盐水清洗离心菌体2～3次，收集菌体。
（8）添加冷冻保护剂：将收集的菌体，按照菌体:保护剂=1:10（g/ml）比例将保护剂加入制得的菌体中，振荡混匀。保护剂配制：脱脂乳浓度10%、蔗糖浓度10%、谷氨酸钠5%、甘油3%。
（9）冷冻干燥：将加入保护剂的发酵液放入-80℃冰箱中预冻12h，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在-53℃，68×10-3Mb的条件下干燥18h左右，即可收获成品。
（9）包装：铝箔袋真空包装。
经上述工艺生产的乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂，共生效果好、产酸能力强，由于本发明使用乳酸菌和酵母菌均来自于自然发酵酸马奶酒，并经过安全性分析，因此食用安全可靠。本发明生产的微生物制剂是在传统酸马奶酒研究的基础上开发的一种生物发酵剂，除菌种的产酸能力强外，还具有一定的抑菌特性，可以用来开发发酵食品、发酵饲料等产品；还可作为生物保鲜添加剂添加到食品中，减少化学防腐剂的使用量，开发绿色食品；可以作为治疗肠道疾病的辅助产品等。

Claims (6)

1.一种乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，其特征在于按下述步骤完成：
(1)乳酸菌的活化和酵母菌的活化：将冻干保存的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)HE5菌株接种至MRS液体培养基中，在其最适增殖温度37℃下培养18h，连续增殖三代，备用；将冻干保存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)J-4接种于YEPD液体培养基中，30℃、130r/min摇床培养至36h，连续增殖三代，备用；其中屎肠球菌HE5菌株的保藏编号为CGMCC No.7766，酿酒酵母J-4的保藏编号为CGMCC No.7765，均于2013年06月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
(2)乳酸菌和酵母菌混合发酵：将活化三代的屎肠球菌HE5与酿酒酵母J-4接入脱脂乳培养基，先经过30℃、130r/min摇床培养至12h，后进入37℃恒温静止培养至36h；所述脱脂乳培养基为脱脂乳粉10g/100mL、大豆蛋白胨1g/100mL、蔗糖0.5g/100mL、酵母浸粉0.5g/100mL；
(3)将上述发酵液经6000r/min离心15min，弃上清，用等量的灭菌生理盐水清洗离心菌体2～3次，收集菌体；
(4)添加冷冻保护剂：将收集的菌体，按照菌体：保护剂＝1:10(g/ml)比例将保护剂加入制得的菌体中，振荡混匀；
(5)冷冻干燥：将加入保护剂的发酵液放入-80℃冰箱中预冻12h，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在-53℃，68×10-3Mb的条件下干燥18h左右，即可收获成品；
(6)包装：铝箔袋真空包装。
2.按照权利要求1所述的乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵菌株屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4的接种体积配比为1:1。
3.按照权利要求1所述的乳酸菌和酵母菌共生发酵的微生物制剂的生产方法，其特征在于：所述步骤(4)中发酵产物需添加冷冻保护剂：脱脂乳浓度10％、蔗糖浓度10％、谷氨酸钠5％、甘油3％，按照菌体:保护剂＝1:10(g/ml)比例将保护剂加入制得的菌体中，振荡混匀，再冷冻干燥。
4.按照权利要求1-3中任一项权利要求所述生产方法所获得的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包含冷冻干燥的屎肠球菌HE5和酿酒酵母J-4。
5.按照权利要求4所述的微生物制剂用于制备发酵食品或发酵饲料的用途。
6.按照权利要求5所述的微生物制剂的用途，其特征在于所述微生物制剂被用作发酵剂。
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