CN105670959A

CN105670959A - 一株益生菌菌株及其应用

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Publication number: CN105670959A
Application number: CN201511034502.7A
Authority: CN
Inventors: 李建树; 李政
Original assignee: TIANJIN TIANLVJIAN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN TIANLVJIAN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-06-15

Abstract

本发明公开了一株益生菌菌株及其应用,本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株新型植物乳杆菌及其应用。本发明的物乳杆菌能够在pH为1.50的条件下存活,在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；该植物乳杆菌降解亚硝酸盐速度快,分解能力达到10.9mg/h/kg,该菌种在生产泡菜时,整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；该植物乳杆菌在发酵60h后，对胆固醇降解率可达64.76％。该植物乳杆菌黏附能力测定的自凝集率为95.71％，菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。

Description

一株益生菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株新型植物乳杆菌及其应用。

背景技术乳酸菌应用在食品中，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌被广泛用于各类轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。泡菜是我国传统特色发酵食品的典型代表之一，历史悠久，文化深厚，因其鲜嫩脆爽，酸甜可口，有开胃健脾的作用，备受青睐，深受广大消费者喜爱。四川泡菜的制作是以乳酸菌菌种发酵为主，兼有酒精发酵、醋酸发酵等微生物的活动等，泡菜的生产是冷加工方法，而这对于蔬菜的营养成分、色泽、气味等的保持均是极其有利。

公开号为CN101720901S的发明专利公开了一种发酵剂发酵泡菜及其制备方法，特别涉及几种纯乳酸菌发酵剂发酵泡菜及其制备方法。该专利所用发酵菌种为植物乳杆菌LP-115、肠膜明串珠菌LM-57和乳酸片球菌P-751，以上菌种对环境的耐受性也比较低，在泡菜保藏销售过程中活菌量很容易降低，不能够很好的突出其活菌的保健功能。

在泡菜的发酵过程中，还存在一难以克服的安全隐患，那就是亚硝酸盐的产生。由于蔬菜在生长过程中很容易积累土壤中的氮元素而形成硝酸盐，蔬菜中的硝酸盐在厌氧发酵的过程中，会因硝酸盐还原作用形成亚硝酸盐。亚硝酸盐对人体有很大的伤害，0.2-0.5g的摄入量会使人中毒，而且其还是强致癌物质亚硝胺的前体，因此，寻求一种降低泡菜中亚硝酸盐含量的方法是很有必要的。

如公开号为CN102899262A的发明专利公开了一种植物乳杆菌及其快速降解发酵过程中亚硝酸盐的方法，利用在黄帝椒发酵过程中接入经扩培的植物乳杆菌种子液进行发酵，发酵结束后加12％的高盐调味；利用此方法发酵黄帝椒亚硝酸盐含量显著降低，也很好的保持了辣椒原有的风味，但是辣椒含盐量过高，长期食用对人体健康有一定的危害。

一种植物乳杆菌及其应用，申请号201310587738.8,发明涉及一种植物乳杆菌及其应用，具体涉及一种新的植物乳杆菌LP45(YMC1005)；还涉及植物乳杆菌LP45在降低胆固醇、提高免疫力，抑制肠道有害菌方面的应用。一种植物乳杆菌LP28的用途，申请号：201410400403.5，发明公开了一种植物乳杆菌LP28的用途，系用以制备饲料添加物，该植物乳杆菌LP28寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其寄存编号为CGMCCNo.3346。本申请之植物乳杆菌LP28系藉由平衡肠道环境之菌相平衡，降低肠道内有害菌过度消耗饲料，可以提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效。

植物乳杆菌在降血脂和辅助减肥方面的应用，申请号：201310518617.8，发明涉及一种植物乳杆菌作为制备具有降血脂或辅助减肥功能的食品、保健食品、保健品或药品的应用，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，保藏编号为CGMCCNo.8198，于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址，中国北京市朝阳区北辰西路1号院，该菌株通过降低血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的水平来达到降低血脂的效果，L.plantarumCGMCCNo.8198及其发酵产品还可以起到控制和减轻体重的目的，具有辅助减肥的功效。本发明提供了一种有效降低血清胆固醇和辅助减肥的生物疗法，并且具有长期食用的安全性，拥有可观的应用前景。一种植物乳杆菌菌株JP-8及其应用，申请号：201310610199.5，发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株JP-8及其发酵海芦笋菜泥制备即食脆片的工艺方法，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCCNo.8289，保藏日期：2013年9月29日。技术方案是：(1)利用MRS培养基制备植物乳杆菌JP-8种子菌液；(2)将海芦笋打浆，接种种子菌液，厌氧发酵；(3)制备海芦笋即食脆片，包括配料、铺盘、热风干燥、微波真空干燥、充氮包装。本发明通过植物乳杆菌发酵使海芦笋即食脆片品质(营养、风味、货架期等)得到改善。本发明先后采用热风干燥和微波真空干燥技术，在改善脆片的口感，最大限度的保留了海芦笋的风味和营养物质的同时，缩短了生产周期，降低了能耗，节约了生产成本。一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用，申请号：201410187369.8，本发明公开了一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明提供的植物乳杆菌于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.8243，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其作为附属发酵剂添加到原料乳中，能够在成熟期内维持较高的活菌数，加速切达干酪蛋白质的降解，提高游离氨基酸含量，最终有利于加速奶酪成熟和风味的形成。

分离自茶树叶的新型植物乳杆菌，申请号：201280038929.2，发明公开了新型植物乳杆菌菌株以及含有该新型植物乳杆菌菌株或其培养基的组合物。植物乳杆菌及其用途，申请号：201310655809.3，发明公开了植物乳杆菌及其用途，具体公开了植物乳杆菌及其在制备药物或食品中的用途、药物及食品，其中，该植物乳杆菌于2013年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位的地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2013391，保藏名称为植物乳杆菌Y-9LactobacillusplantarumY-9。本发明的植物乳杆菌具有优异的益生作用，耐酸和耐胆盐能力，能够长期保存，并能够有效用于降低血中胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。一株植物乳杆菌，申请号：201510274934.9，发明提供一株植物乳杆菌，该菌株为植物乳杆菌HLX37(LactobacillusplantarumHLX37)，于2015年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:10632。本发明的优点在于：植物乳杆菌HLX37有很强的黏附及降胆固醇能力，有很好的耐酸及耐胆盐能力，能发酵鲜牛奶(或复原奶)产生口感黏稠的具体明显清香味的凝固型酸奶，为酸奶产品的生产及功能酸奶的开发提供新的发酵菌源。

一株植物乳杆菌P-8的用途，申请号：201510036860.5，发明涉及一株益生菌植物乳杆菌P-8在能够提高鸡营养物质消化率的鸡饲料中的用途。所述的鸡饲料含有(1-4)×10⁶cfu/mL植物乳杆菌P-8菌液。本发明益生菌试验组的肉仔鸡粗脂肪与总钙代谢率比对照组分别提高3.48～3.84％和3.82～4.18％；本发明益生菌试验组的总能、粗蛋白与总磷代谢率比对照组分别提高2.26～2.62％、3.37～3.73％和2.27～2.63％；本发明益生菌试验组的肉仔鸡干物质与粗纤维代谢率比对照组也有增加。一种植物乳杆菌菌株及其应用，申请号：201510089823.0，发明涉及一种植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum)及其应用以及利用该菌株生产的泡菜。本发明的植物乳杆菌来源于中国传统发酵食品，是公认为安全的菌种，在泡菜中产生苯乳酸，能更好的发挥其益生功能。本发明提供的泡菜，同时富含乳酸菌和苯乳酸，乳酸菌活菌数为10⁸cfu/g，苯乳酸的含量可以达到217mg/kg。是一种具有较高营养价值和益生功能的中式泡菜。一种植物乳杆菌TH103及其用途，申请号：201510385613.6，发明公开了一种植物乳杆菌TH103及其用途，植物乳杆菌TH103具有较高的耐酸、耐胆盐、耐NaCl的能力，在体外对鼠伤寒沙门氏菌生长具有较强的抑制作用，在食品体系中对鼠伤寒沙门氏菌的生长具有抑制作用，对鼠伤寒沙门氏菌感染肠上皮细胞株HT-29细胞具有保护作用。所述植物乳杆菌TH103可以用于发酵蔬菜、制备生产青贮饲料、发酵香肠等食品。

因此，寻求一种优良的发酵菌剂，对泡菜的发酵工艺具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一株益生菌菌株；

本发明所述益生菌为植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

植物乳杆菌益生特性如下：

本发明所提供的植物乳杆菌CGMCCNO.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCCNO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCCNO.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCCNO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。

CGMCCNO.11763对胆固醇降解能力研究和测定：

取1mlCGMCCNO.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入1mL无菌水的MRS胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCCNO.11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76％。

表1对胆固醇的降解情况。

降解时间(h)	0	20h	40h	60h
					胆固醇含量(mg/ml)	0.2273±0.0058	0.1356±0.0018	0.1011±0.0094	0.801±0.0231
胆固醇降解率％		40.34％	55.52％	64.76％

菌CGMCCNO.11763菌株的耐胆盐试验：

取CGMCCNO.11763菌液1mL接种菌种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％)的10mLMRS液体培养基(PH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.59±0.92×10⁷(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。

表2耐胆盐能力检测[(±s)×10⁷cfu/ml]

菌CGMCCNO.11763菌株的耐酸试验

取HLX37母液按1ml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mLMRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力。

表3耐酸能力检测[(±s)×10⁷cfu/ml]

菌CGMCCNO.11763的黏附能力测定

培养CGMCCNO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCCNO.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。；他凝集率(％)：将CGMCCNO.11763和大肠杆菌DH5α的悬菌液调节成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A24，他凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCNO.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。

表4黏附能力表

菌株生理特性

所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。

理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。经过生理生化鉴定为为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH。

菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。

本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到，采集时间2015年6月2日。

有益效果：本发明植物乳杆菌CGMCCNO.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCCNO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCCNO.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCCNO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％，菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

实施例15L发酵罐试验

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCCNO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

(2)将对数期的菌种接入装有3LMRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCCNO.11763的乳酸产量达到110g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。

(4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCNO.11763对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。

(5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。

Claims

1.一株益生菌菌株，其特征在于：所述益生菌菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH，保藏号为CGMCCNO.11763。

2.根据权利要求1所述益生菌菌株，其特征在于：所述植物乳杆菌CGMCCNO.11763在pH为1.50的条件下存活，CGMCCNO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。

3.根据权利要求1所述益生菌菌株，其特征在于：所述植物乳杆菌CGMCCNO.11763在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态。

4.根据权利要求1所述益生菌菌株，其特征在于：所述植物乳杆菌CGMCCNO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg。

5.根据权利要求1所述益生菌菌株，其特征在于：所述植物乳杆菌CGMCCNO.11763发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。

6.根据权利要求1--5任一所述益生菌菌株在发酵生产泡菜方面的应用。