CN107557323A - 一种益生菌的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可以提高益生菌活力的菌种保存方法，属于食品微生物技术领域。该方法包括以下步骤：1.将益生菌菌种接种到合适的液体培养基，在适宜的条件下培养至对数生长期；2.将培养得到的益生菌悬浮液适当浓缩，或通过离心的方法收集菌体；3.将益生菌悬液或收集的菌体与灭菌后的微藻粉末按照一定的比例混合均匀；4.将益生菌与藻粉混合物在适当的条件下预培养2‑4小时；5.分装，密封后，直接置于适当的条件下保存或进行减压干燥，无菌包装后，保存于‑20℃‑40℃。该方法可以较好的保持益生菌细胞活力，显著提高保存物中活细胞的数量，很好地解决益生菌类食品和保健品生产中菌种保存存活率低、活力下降的问题，避免了菌种保存过程中化学保护剂的使用。

Description

一种益生菌的保存方法

技术领域

属于微生物技术领域，涉及一种益生菌的保存方法。

背景技术

益生菌是一种通过改善肠道微生物平衡，从而对宿主施加有益影响的微生物添加物。研究发现，益生菌在调节肠道菌群结构，增强机体免疫力，降低胆固醇，消除致癌因子等方面都有很大的生理功效，同时对糖尿病，高血压，高血脂等一些疾病的防治有重要的意义。而且，如今面对环境问题，生活方式以及食品卫生问题给人们健康带来的隐患，益生菌在维持健康，减少患病危险等方面都有巨大的潜力，这使得益生菌在食品、生物医药制品等多种领域得到了越来越广泛的应用。

目前国内益生菌制品主要以发酵型酸奶、乳制品为主，其他种类的益生菌产品也越来越多，但益生菌产品要保证其良好的功效，首先要保证其活菌数目高，且存活时间长，而这正是许多益生菌产品所需要解决的问题。目前益生菌的保存方法主要有传代保存，冷冻保存，冷冻干燥保存，以及液体石蜡覆盖保存等。到目前为止，涉及到益生菌保存的文献资料主要有申请号为201180039892.0、201610632749.7和201710311930.2的专利及2篇论文“液态条件下乳酸菌保存方法研究进展”和“植物乳杆菌高活力保存方法的研究及其应用”中提到的相关技术和方法。其中专利201610632749.7主要涉及食品制造及保鲜领域提高盐渍食用菌产品口感和保护营养成分的制备工艺；专利201180039892.0公开了一种利用乳杆杆菌Lb2132、lbc-82、LC-10、Lpc-37和Lr-32提高含有嗜酸乳杆菌La-14和NCFM亚种或双歧杆菌HN019和Bl-04的，初始pH值为4.2的酸奶在储藏期间嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的存活率；专利201710311930.2公开了一种利用复杂的梯度降温技术酸奶制品中肠道益生菌的保存方法，这些虽然涉及到益生菌的保存技术，但应用范围局限于酸奶制品及酸奶发酵生产菌种。文献“液态条件下乳酸菌保存方法研究进展”主要介绍了乳酸菌保存中常用的传代法、干燥法、冷冻及冷冻干燥法，并认为冷冻干燥法是较有优势的乳酸菌保种方法，但也存在低温下冰晶产生导致的细胞膜、质损伤等，影响菌种活力。文献“植物乳杆菌高活力保存方法的研究及其应用”研究了4℃低温保存法、36℃烘干常温保存法和阳离子活性载体保存法用于植物乳杆菌保存，其中前两种保存方法菌种活力在15天左右几乎全部丧失，阳离子活性载体添加麸皮则可以保存菌种活力达2个月，该方法有一定的实用价值，但在研究和生产实践中，对于性状优良的菌种或其突变株，往往希望能够更长时间的保存，以维持其优良性状；此外，阳离子活性载体属天然矿物质，将其应用于益生菌保种的安全性和可靠性仍需进一步研究。

专利CN00100322.4公开了一种通过在培养基中添加至少一种或多种有气味的硫化合物、有气味的氮化合物或有气味的碳化合物，从而有效保护乳酸杆菌Lactobacillusclearans降低有气味和有害物质特性的培养方法；并提供了至少一种或多种的含硫氨基酸、卵清蛋白、胆汁粉、海藻糖、棉子糖、死的酵母细胞、小球藻、米糠、糠、大豆奶和胡萝卜汁，以作为保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的保存剂，以提高保存物滴度。除上述保护剂外，在保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans时还需要添加氨基酸类如谷氨酸等、维生素类如维生素C等、矿物质类如锰等、含硫化合物类如硫化钠等以及其他多种有机物质如氨水、甲基吲哚、甲胺、二甲胺、甲酸、乙酸、甲醛、乙醛、酚、丁醇等其中的至少一种或多种；此外，仍需再添加至少一种或多种来自动物的脱脂奶粉、卵清蛋白、乳糖、肝脏抽提粉、血清以及至少一种或多种来自植物的豆浆、海藻糖棉子糖、苜蓿汁等作为保护剂，保存剂中涉及了较多种类外源添加的碳源、氮源及多种有机物等，对于常规研究和生产过程中菌种的保存，无疑增加了操作复杂性和成本，同时也增加了杂菌污染的几率。

传统的低温菌种保藏法虽对大多数菌种普遍适用，但需要添加相应的化学保护剂，如甘油和二甲基亚砜等，菌种活力易受到影响，且步骤繁琐，杂菌污染几率大。

为解决上述益生菌保存中的难题，本发明公开了一种以可食用微藻为单一原料的益生菌种保存方法。微藻是一类分布极广，营养丰富的低等水生植物。微藻细胞中通常含有丰富的蛋白质，多糖，类胡萝卜素等高营养成分，这使得它在医药食品领域具有很大的应用价值。本发明的优势在于保存原料为可食用微藻，安全可靠，成本低廉，操作简单，而且可以显著提高益生菌的存活率和细胞活力。

发明内容

为了克服现有益生菌保种技术中存活率低、细胞活力不高及操作步骤和保存剂复杂等不足，本发明提供一种益生菌的保存方法，该方法以可食用微藻粉作为单一保存剂，具有较高的营养价值，不添加任何有害化学物质，可最大程度保持益生菌的纯净和安全性；同时本发明原料易得，步骤简单，操作方便，避免了程序降温仪等昂贵的保种设备，既适合一般实验室研究开发目的，对于食品行业生产加工中涉及的益生菌种的保存也同样适用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种益生菌的保存方法，包括：

(1)将培养至对数生长期益生菌菌种悬浮液浓缩，或离心、收集菌体；

(2)将益生菌悬液或收集的菌体与灭菌后的微藻粉末混合均匀，预培养；

(3)分装，密封后，置于适当的条件下保存；或分装后经过减压干燥后，保存于-20℃-40℃。

本申请研究发现：采用藻株微藻粉作为单一保存剂，若要获得较优的益生菌保存效果，必须保证菌株与微藻的对应性，使微藻中所含的营养成分能够适宜于特定菌株的活力维持需要。因此，优选的，所述益生菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或几种。优选的，所述微藻粉末为螺旋藻、念珠藻葛仙米、雨生红球藻、裸藻中的一种或几种。

特别地，若将嗜酸乳杆菌保存在葛仙米粉末中，不仅可以获得较高的细菌的存活率和细胞活力，还能提高嗜酸乳杆菌在高温下的耐受性。

优选的，将嗜酸乳杆菌保存在葛仙米粉末中，将保加利亚乳杆菌保存在螺旋藻粉末中。

优选的，所述微藻粉末的灭菌方法为辐照灭菌法，包括紫外线、χ-射线或γ-射线辐照。

优选的，所述益生菌和微藻粉末的混合物中益生菌活菌数量在1.0×10⁴-1.0×10⁷cfu/mg干重。

优选的，所述预培养时间为2-4小时。

优选的，所述干燥温度为0℃-20℃。

优选的，所述的保存的益生菌和微藻粉末的混合物为益生菌悬液与微藻直接混合的液体混合物，或菌体与微藻粉混合后经过干燥制成的干粉。

本发明还提供了任一项上述的方法制备的益生菌的保存物。

本发明还提供了微藻干粉在益生菌保存中的应用。

本发明的有益效果

(1)本发明利用微藻粉末较好的吸湿性，快速、温和地脱去益生菌细胞内部的水分，延缓益生菌细胞内的代谢活动，从而达到长时间保存细胞的目的；同时微藻含有的丰富的蛋白质、多糖、微量元素等营养成分可为益生菌细胞的活力维持提供充足的营养物质，提高保存期内细胞的活力；

(2)该保存方法具有较强的温度适应性，适合多种目的的菌种保存。本发明的保存方法步骤简单，易操作，且较好地解决了益生菌种保存中存活率低、细胞活力低等问题。此外，本发明方法不涉及化学添加剂，尤其适合食品生产行业中益生菌的保种；

(3)本发明制备方法简单、原料易得、保存效率高、实用性强，易于推广。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

一种益生菌的保存方法，包括以下步骤：

1.将益生菌菌种接种到合适的液体培养基，在适宜的条件下培养至对数生长期；

2.将培养得到的益生菌悬浮液适当浓缩，或通过离心的方法收集菌体；

3.将益生菌悬液或收集的菌体与灭菌后的微藻粉末按照一定的比例混合均匀；

4.将益生菌与藻粉混合物在适当的条件下预培养2-4小时；

5.分装，密封后，直接置于适当的条件下保存或进行减压干燥，无菌包装后，保存于-20℃-40℃。

其中，所述的益生菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌的一种或几种。

其中，所述益生菌的培养温度为20-40℃。

其中，所述益生菌的培养时间为12-72小时。

其中，所述的微藻粉包括螺旋藻、念珠藻葛仙米、雨生红球藻、裸藻中的一种或几种的混合物。

其中，所述的益生菌藻粉混合物的状态包括干燥固态和液态。

其中，所述的益生菌与藻粉混合物预培养时间为2-4小时。

其中，所述的干燥固态保存物制备方法为：将收集得到的菌体加入灭菌好的微藻粉中，洁净条件下减压干燥后保存。干燥的温度为0℃-20℃。

其中，所述的液态保存物的制备方法为：将培养好的菌悬液直接与灭菌的微藻粉按照1:10-1:100(ml:mg)的比例混合均匀即可。

其中，所述的混合物中，益生菌活菌数量为1.0×10⁴-1.0×10⁷cfu/mg干重。

实施例1：嗜酸乳杆菌在葛仙米粉末中的保存

1.1 嗜酸乳杆菌的培养

从斜面保存的嗜酸乳杆菌中挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，置于37℃，静置培养约24小时，得到处于对数生长期的菌悬液，调整菌悬液的细胞密度，使其OD_650nm＝0.8，活菌数量约为1.0×10⁷cfu/ml。

1.2 嗜酸乳杆菌与葛仙米粉末的混合

称取0.05g葛仙米粉末2份，分别铺于直径为9cm的平皿中，置于无菌操作台上，紫外线辐照灭菌20分钟，然后向其中一份粉末中加入准备好的菌悬液0.9ml作为保种测试组，另一份加入无菌生理盐水0.9ml作为空白对照组，同时取0.9ml菌悬液加0.1ml灭菌生理盐水作为对照组。将上述三个实验组混匀，置于37℃生化培养箱中预培养3小时。300μl/管分装后，密封，置于室温、4℃和-20℃保存。

1.3 不同实验组嗜酸乳杆菌活细胞数检测

将上述实验组分别于保存的第15天，30天和90天进行取样，稀释后选择合适的稀释度涂布于琼脂平板培养基上，37℃培养箱中培养48小时，观察并计数，菌落计数结果见表1。结果表明，葛仙米粉末保种的嗜酸乳杆菌活菌数量在室温、4℃和-20℃条件下均高于对照组。

表1 益生菌1在葛仙米粉末中保存结果检测

注：1.“--”表示无菌落生长；

2.表中数据单位为克隆/ml稀释液，即cfu/ml。

实施例2：保加利亚乳杆菌在螺旋藻中的保存

1.1 保加利亚乳杆菌的培养

从保加利亚乳杆菌斜面上挑取单菌落接种到MRS液体培养基中，添加8％番茄汁，10％麦芽汁和2％乳清，调整培养基初始pH值为5.8，40℃厌氧培养15小时，得到处于对数生长期的菌悬液，调整菌悬液中活菌数量约为1.0×10⁷cfu/ml。

1.2 保加利亚乳杆菌与螺旋藻粉末的混合

称取0.05g螺旋藻粉末2份，分别铺于直径为9cm的平皿中，置于无菌操作台上，紫外线辐照灭菌20分钟，然后向其中一份粉末中加入培养好的保加利亚乳杆菌悬液0.9ml作为保种测试组，另一份加入无菌生理盐水0.9ml作为空白对照组，同时取0.9ml菌悬液加0.1ml灭菌生理盐水作为对照组。将上述三个实验组混匀，置于40℃厌氧培养箱中预培养3小时。300μl/管分装后，密封，置于室温、4℃和-20℃保存。

1.3 不同实验组保加利亚乳杆菌活细胞数检测

将上述实验组分别于保存的第15天，30天和90天进行取样，稀释后选择合适的稀释度涂布于琼脂平板培养基上，40℃厌氧箱中培养24小时，观察并计数，菌落计数结果见表2。结果显示，螺旋藻粉末保种组的存活率在室温、4℃和-20℃均高于对照组，且螺旋藻粉保种的保加利亚乳杆菌在实验期间活菌数量变化不大。

表2 益生菌1在螺旋藻粉末中保存结果检测

注：1.“--”表示无菌落生长；

2.表中数据单位为克隆/ml稀释液，即cfu/ml。

实施例3：干燥条件下嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌在葛仙米粉末中的保存

1.1 益生菌的培养

按照实施例1和2的方法分别培养得到处于对数生长期的两种益生菌悬液，调整菌悬液中活菌数量约为1.0×10⁷cfu/ml。

1.2 益生菌与葛仙米粉末的混合和干燥

称取每份0.05g葛仙米粉末4份分别铺于直径为9cm的平皿中，置于无菌操作台上，紫外线辐照灭菌20分钟，然后向其中2份藻粉中分别加入培养好的嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌各0.4ml作为保种测试组，向另外两份藻粉中各加入无菌生理盐水0.4ml作为空白对照组，同时取嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌悬液各0.4ml分别加入0.1ml灭菌生理盐水作为对照组。将上述各实验组混匀后，于减压条件下进行干燥直至形成干粉，然后置于4℃冰箱保存。

1.3 不同实验组活细胞数检测

保存1月后，分别用无菌生理盐水将上述各实验组保存物悬浮，37℃摇床恒温厌氧预培养2小时，使益生菌细胞充分悬浮，取上清液进行稀释100倍后涂布于MRS琼脂平板培养基上，37℃生化培养箱中培养48小时，观察并计数长出的菌落，结果见表3，该结果显示干燥条件下葛仙米粉末保种的两种益生菌的活菌数均高出对照组2个数量级以上。

表3 干燥状态下嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌在葛仙米粉末中保存1月的结果

注：1.“--”表示无菌落生长。

实施例4：干燥条件下嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌在螺旋藻粉末中的保存

4.1 益生菌的培养

按照实施例1和2的方法分别培养得到处于对数生长期的两种益生菌悬液，调整菌悬液中活菌数量约为1.0×10⁷cfu/ml。

4.2 益生菌与螺旋藻粉末的混合和干燥

称取每份0.05g螺旋藻粉末4份分别铺于直径为9cm的平皿中，置于无菌操作台上，紫外线辐照灭菌20分钟，然后向其中2份粉末中分别加入培养好的嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌各0.4ml作为保种测试组，向另外两份藻粉中各加入无菌生理盐水0.4ml作为空白对照组，同时取嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌悬液各0.4ml分别加入0.1ml灭菌生理盐水作为对照组。将上述各实验组混匀后，于减压条件下进行干燥直至形成干粉，然后置于4℃冰箱保存。

4.3 不同实验组活细胞数检测

保存1月后，分别用无菌生理盐水将上述各实验组保存物悬浮，37℃摇床恒温厌氧预培养2小时，使益生菌细胞充分悬浮，取上清液进行稀释100倍后涂布于MRS琼脂平板培养基上，37℃生化培养箱中培养48小时，观察并计数长出的菌落，结果见表4，该结果显示干燥条件下螺旋藻粉末保种的两种益生菌的活菌数量均高出对照组2个数量级以上。

表4 干燥状态下嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌在螺旋藻粉末中保存1月的结果

注：1.“--”表示无菌落生长。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种益生菌的保存方法，其特征在于，包括：

(1)将培养至对数生长期益生菌菌种悬浮液浓缩，或离心、收集菌体；

(2)将益生菌悬液或收集的菌体与灭菌后的微藻粉末混合均匀，预培养；

(3)分装，密封后，置于适当的条件下保存；或分装后经过减压干燥后，保存于-20℃-40℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述益生菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻粉末为螺旋藻、葛仙米、雨生红球藻、裸藻中一种或几种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻粉末的灭菌方法为辐照灭菌法，包括紫外线、χ-射线或γ-射线辐照。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述益生菌和微藻粉末的混合物中益生菌活菌数在1.0×10⁴-1.0×10⁷cfu/mg干重。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预培养时间为2-4小时。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥温度为0℃-20℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的保存的益生菌和微藻粉末的混合物为益生菌悬液与微藻直接混合的液体混合物，或菌体与微藻粉混合后经过干燥制成的干粉。

9.权利要求1-8任一项所述的方法制备的益生菌的保存物。

10.微藻干粉在益生菌保存中的应用。