CN103857297B - 水果饮料中的益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生益生菌水果饮料的方法，所述益生菌水果饮料包含高活计数的酸适应性益生菌，例如类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)的菌株，并且涉及可通过此方法获得的益生菌水果饮料。

Description

水果饮料中的益生菌
技术领域
本发明涉及制备包含高计数的活益生菌的水果饮料的方法。本发明另外涉及可通过此方法获得的益生菌水果饮料和酸适应性益生菌用于制备益生菌水果饮料的用途。
背景技术
已知一些细菌具有益生菌性质，也就是说，当摄入足够活量时，它们对宿主具有有益的保健效果。具体来说，属于乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的菌株已经成为许多研究的主题，在许多领域中显示预防性临床效果以及对某些生理功能显示预防性临床效果。这些益生菌通常安全并且特别能够促进肠内微生物区系的适当运转。对于满足益生菌定义的细菌来说，除了要有明显的证据表明其对消费者的健康具有正面效果外，它还必须能够在肠内存活并定殖并且能够在严酷的食物生产和储存过程中存活。临床证据表明，益生菌的日剂量应当为至少109CFU，以确保益生菌效能。
益生菌产品的市场持续增长。益生菌已经尤其被应用于乳制品，其中乳酸菌相对较好地适应所述培养基。现在，橙汁以及其它类型的水果汁和含有水果酱和水果汁的饮料已经被鉴定为益生菌培养物的重要载体，具有水果和益生菌的益处。
另外，不含有乳组分的水果饮料是给予诸如干酪乳杆菌 (Chr.Hansen，Hoersholm，Denmark)等低变应原性益生菌的极佳方式。
然而，当将大量参考益生菌添加到例如橙汁中时，水果汁相当酸性的环境会导致初始细胞计数大大减小。为了在水果饮料中成功地应用益生菌培养物，必须在贮存期间确保益生菌细胞的合适浓度。因此，认为增加益生菌培养物在橙汁和其它水果饮料中的存活非常关键。
产生含有有效量活乳杆菌的水果饮料的方法为现有技术，例如欧洲专利EP0113055已知，所述专利涉及包含以下步骤的方法：使水果汁与固体试剂接触以去除抑菌性组分并且随后使乳杆菌在4.0或更低pH下的水果汁中增殖。
然而，在所述水果饮料中，可能观察到诱导产生使它们不适于消费的气体和异味的细菌生长和/或活动。
美国专利申请US2010/0086646涉及基于新鲜植物汁和/或乳的食品，其包含活益生菌和pH介于3与4之间的膳食性质子化弱一元酸，后者防止益生菌在食品中产生不正的味道和/或气体。
PCT专利申请WO2010/132017涉及包含益生菌的至少一种菌株和至少一种气体形成减少剂的益生菌水果汁饮品，所述气体形成减少剂选自西印度樱桃(acerola)、石榴、蔓越莓、不老莓(arqnia)、黑醋栗、鼠李或接骨木果。
添加一元酸可影响食品的感官性质并且还发现其负面地影响益生菌的存活率。添加酸形成减少剂也似乎负面地影响益生菌的存活率。此外，在食品中添加用于去除抑菌性化合物和/或用于减少不正的味道和/或气体的试剂可被证明成本很高。
因此，在所属技术领域内仍然需要提供用于产生具有高益生菌值的益生菌水果饮料的替代方法，其中所述益生菌水果饮料展现良好的味道，并且没有异味和气体产生，且其中所述益生菌水果饮料具有长贮存寿命。尤其需要不涉及添加可影响水果饮料感官品质的固体试剂、一元酸或其它化合物的方法。
本发明提出产生水果饮料的替代方法，所述水果饮料包含在接种到所述水果饮料中之前已经具有酸适应性的益生菌。
发明内容
本发明的一个目标是提供含有能够在水果饮料的酸性环境存活的稳健益生菌的益生菌水果饮料。本发明的另一目标是提供具有良好的味道的益生菌水果饮料。本发明的又一目标是提供所述具有长贮存期的益生菌水果饮料。
为了在不添加过量益生菌的情况下在水果饮料中获得高CFU/ml的益生菌，本发明的发明人一直在致力于对益生菌的酸耐受性进行改进，从而使所述益生菌对低pH具有稳健抗性。
本发明基于以下发现：在可不进行pH稳定的情况下，通过增殖一段时间使益生菌适应酸，而不会显著影响所得发酵产率。
酸适应性益生菌可极其有用地作为益生菌组分用于添加到具有低pH(低于4.2)的水果饮料。其组合了益生菌的所有有益能力与水果的高营养值。
本发明方法不涉及向水果饮料中添加可能影响益生菌水果饮料的感官品质的化学化合物。
因此，在第一个方面，本发明涉及产生益生菌水果饮料的方法，所述方法包括：
(a)使益生菌的至少一种菌株在增殖期间具有酸适应性；
(b)向水果饮料接种步骤(a)的酸适应性益生菌的至少一种菌株；和
(c)任选地包装所述益生菌水果饮料。
根据本发明的一个实施方案，步骤(a)中的益生菌的酸适应是通过以下步骤来实施：
(i)在不进行pH稳定的情况下，使所述益生菌的至少一种菌株在25℃到43℃且优选地25℃到40℃范围内的温度下在初始pH介于约6.0与约7.0之间的适宜培养基中增殖，所述培养基具有允许培养基达到介于约5.0到约4.0之间的pH的组分；
(ii)收获酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；
(iii)任选地浓缩酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；
和
(iv)任选地冷冻或冷冻干燥酸适应性益生菌的所述至少一种菌株。
在优选实施例中，步骤(i)中的所述培养基具有在增殖至少8小时后允许所述培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH的组分。
在又一优选实施方案中，在步骤(iii)中，也就是说在收获酸适应性细菌后，浓缩酸适应性益生菌菌株。
本发明的第二个方面涉及可通过根据第一个方面的方法获得的益生菌水果饮料。本发明还涉及包含菌株类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei)CRL431(干酪乳杆菌)的益生菌水果饮料。
本发明的第三个方面涉及获得酸适应性益生菌菌株的培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在不进行pH稳定的情况下，使益生菌在25℃到43℃且优选地25℃到40℃范围内的温度下在初始pH介于约6.0到约7.0之间的适宜培养基中增殖，所述培养基具有允许所述培养基达到介于约5.0到约4.0之间的pH的组分；
(b)收获所述酸适应性益生菌菌株；
(c)任选地浓缩所述酸适应性益生菌菌株；和
(d)任选地冷冻或冷冻干燥所述酸适应性益生菌菌株。
在优选实施例中，步骤(a)中的所述培养基具有在增殖至少8小时后允许所述培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH的组分。
在特别优选的实施方案中，在步骤(c)中，也就是说在收获酸适应性益生菌后，浓缩酸适应性益生菌菌株。
第四个方面涉及可通过根据本发明第三个方面的方法获得的酸适应性益生菌菌株的培养物。
第五个方面涉及根据本发明第四个方面的酸适应性益生菌菌株的培养物用于产生益生菌水果饮料的用途。
附图说明
图1图解说明干酪乳杆菌对MRS培养基(Difco)的酸化。在pH5.0、pH4.5和pH4.0下通过离心收获酸适应性细胞。
图2绘示干酪乳杆菌在大规模产生期间的细胞计数。
图3图解说明在产生期间非适应性(菱形)或者适应pH4.0(三角形)或pH5.0(正方形)并且随后以低(5×107CFU/ml，实心符号)或高(1×108CFU/ml，空心符号)浓度添加的干酪乳杆菌在添加到草莓/香蕉汁时的细胞计数。
图4绘示在产生期间非适应性(菱形)或者适应pH4.0(三角形)或pH5.0(正方形)并且随后以低(5×107CFU/ml，实心符号)或高(1×108CFU/ml，空心符号)浓度添加的干酪乳杆菌在添加到热带果汁时的细胞计数。
图5显示在产生期间非适应性(菱形)或者适应pH4.0(三角形)或pH5.0(正方形)并且随后以低(5×107CFU/ml，实心符号)或高(1×108CFU/ml，空心符号)浓度添加的干酪乳杆菌在添加到红色果汁时的细胞计数。
图6图解说明在产生期间非适应性(对照)、适应pH4.0、4.5或5.0并且随后以1.5×108CFU/ml的浓度添加的干酪乳杆菌在添加到100％橙汁时的细胞计数。
图7显示在产生期间非适应性(对照)和适应pH4.0、4.5或5.0并且随后作为冷冻颗粒储存在-50℃下并且通过倾倒平铺(pour plating)对解冻培养物的活力进行定期测试的干酪乳杆菌的细胞计数。
图8图解说明在产生期间非适应性(对照)或适应pH4.0、作为冷冻颗粒在-50℃下储存6个月并且随后添加到在8℃下储存x轴上所示时段的橙汁的干酪乳杆菌的细胞计数。
图9绘示在产生期间非适应性的细胞(正方形)或者适应pH4.0(三角形)的细胞并且随后储存在8℃下的干酪乳杆菌在添加到橙汁时的细胞计数。
具体实施方式
定义
在本上下文中，术语“水果汁”是指在不存在热和溶剂时通过机械挤压或浸渍新鲜水果制备的天然含于水果中的液体。“水果汁”可由一种类型的水果或多于一种类型的水果的混合物的汁组成。
术语“水果饮品”在本上下文中是指水果汁含量介于0到29％之间的饮料。
术语“花蜜(nectar)”在本上下文中是指水果汁含量介于30％到99％水果汁之间的饮料。
在本上下文中，术语“果酱”是指在不存在热和溶剂时通过研磨、压榨和/或过滤成粘稠液体或软质膏糊的稠度制备的水果。“果酱”是由100％水果制成，而不是仅仅由水果汁制成。
在本上下文中，术语“水果饮料”是指包含水果汁、水果浓缩物和/或水果酱的饮料。术语“水果饮料”涵盖“水果汁”、“水果饮品”和“花蜜”，如本文所定义。“水果饮料”可含有果肉或已经通过诸如离心等操作去除果肉。水果饮料可进一步含有例如燕麦、大豆、扁桃仁、乳清和/或非发酵乳，例如呈乳粉形式。在特别优选的实施例中，本发明的水果饮料不含有乳品组分，例如乳。
在本上下文中，术语“酸适应”(细菌)是指通过在培育期间逐渐暴露于下降中的pH水平使得耐受低pH的活细菌。因此，使益生菌菌株具有酸适应性的过程通常包括在逐渐降低的pH水平(例如直到达到介于4.0与5.0之间的pH)存在下培养这些菌株。优选地，经受酸适应的益生菌本身在其增殖期间会产生酸，所述酸在培养基中积累。更优选地，产酸益生菌属于乳酸菌的组。或者，如果经受酸适应的益生菌不会自然地产生酸，那么也可以通过从外部添加酸来降低pH。
酸适应的过程，优选地在不进行pH稳定的情况下，通过使益生菌在培养基中增殖来实施。表达“不进行pH稳定”意指不采取措施来抵消逐渐降低的pH。例如，在一个实施例中，接种益生菌的培养基通常不含有可在形成或添加酸后保持pH稳定的缓冲剂。或者，如果起始培养基含有某一浓度的缓冲剂，那么培养可持续到缓冲剂的能力耗尽，并且在培养期间不添加其它缓冲剂。具体来说，在培养期间不添加碱性化合物来中和降低的pH。
“异味”意指食品的异常味道。异味令消费者不悦，因此不是所寻求的。还可以在产品中检测到所谓的“正面”气味，例如水果类型的气味。由于这些味道不会令消费者不悦，因此它们不会包含在根据本发明所定义的“异味”中。
在本上下文中，术语“包装”益生菌水果饮料涉及对益生菌水果饮料进行最终包装以获得可由例如一人或一群人摄入的产品。因此，适宜包装可为瓶或纸箱或类似物，并且适宜量可为例如10ml到5000ml，但目前优选地，包装中的量为50ml到1000ml，例如200ml到1000ml。
术语“益生菌”是指以足够量给予消费者用于在所述消费者中达成促进健康的效果的目的的活细菌。益生菌可作为离散剂型(例如作为胶囊、悬浮物等等)给予。或者，益生菌以食物或膳食性补充物形式给予。益生菌能够在摄入后在胃肠道条件下存活并且定殖于消费者的肠。已经在所属领域内使用不同类型的细菌作为益生菌，包括属乳杆菌属的细菌，例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)；双歧杆菌属，例如动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)等等。也已经从诸如大肠杆菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属(Bacillus)等其它属描述了益生菌菌株。
在本上下文中，术语“突变体”应当理解为借助例如遗传改造、辐射和/或化学处理得到的菌株，或可由本发明菌株(或母本菌株)借助例如遗传改造、辐射和/或化学处理得到的菌株。突变体也可以为自发地发生的突变体。优选地，突变体为功能上等效的突变体，例如与母本菌株具有基本上相同或改进的性质(例如关于味道、后酸化、酸化速度和/或酸适应能力)的突变体。此类突变体是本发明的一部分。尤其地，术语“突变体”是指通过使本发明菌株经受任何常用的诱变处理(包括用诸如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(NTG)等化学诱变剂、UV光处理)获得的菌株或自发地发生的突变体。突变体可能已经受若干诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤、之后筛选/选择步骤)，但目前优选地，实施不超过20次或不超过10次或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在目前优选的突变体中，与母本菌株相比，细菌基因组中的小于5％或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸已经转变为另一核苷酸，或缺失。
在本上下文中，术语“变体”应当理解为功能等效于本发明菌株，例如具有基本上相同或改进的性质(例如关于味道、后酸化、酸化速度和/或酸适应能力)的菌株。所述变体，可使用合适的筛选技术鉴别，是本发明的一部分。
除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)所用术语“一(a和an)”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另外说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(也就是说，意指“包括但不限于”)。
除非本文另外指明，否则本文列举的数值范围仅仅打算作为个别地表示此范围内的各单独值的简略方法，并且各单独值个别地并入本说明书中如同其在本文中被个别列举一样。除非本文另外指明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可以任何适宜的顺序实施。除非另外要求，否则，使用本文所提供的任何和所有实施例或实例性用语(例如，“诸如”)仅仅打算用于更好地阐明本发明，而并不对本发明范围构成限制。本说明书中的任何用语都不应当理解为表明是实施本发明必不可少的任何非要求保护要素。
本发明的实施方案和方面
益生菌菌株(例如属乳杆菌属和双歧杆菌属的那些)可用于饮料。然而，它们对酸性环境敏感并且在接种到pH4.2或更低的培养基中时活细胞计数快速减小。
本发明的发明人惊讶地观察到，通过使益生菌菌株具有酸适应性，可显著增加其在水果饮料中的存活，所述水果饮料通常由于果酸而具有在3-4范围内的低pH。在水果饮料中，在最长达10周的冷储存期间，酸适应性益生菌的活力基本上不会受到低pH的影响，并且在所述细菌的冷冻储存期间维持酸性环境中的高活力。
另外，当将酸适应性益生菌添加到水果饮料(例如红色水果、热带水果和草莓/香蕉)的水果饮料时，未检测到异味。
因此，本发明在第一个方面涉及通过向水果饮料接种酸适应性益生菌的至少一种菌株来产生益生菌水果饮料的方法。
适用于本发明的水果饮料的实例是具有低pH值的那些，特别是包含柑橘类水果汁(例如橙汁、葡萄柚汁、酸橙汁和柑橘汁以及其混合物)的那些。水果饮料的其它实例包括包含苹果汁的水果饮料。
适用于本发明中的水果饮料可例如为水果汁、来自浓缩物的水果汁、水果饮品和任选地包含水果酱和/或水的花蜜。
水果汁和/或水果酱在水果饮料中的总含量通常介于约20重量％到约99.99重量％之间，优选地介于约30重量％到95重量％之间，更优选地介于约40重量％到90重量％之间，仍更优选地介于约50重量％到80重量％之间且最优选地60重量％到70重量％之间。
在一个实施方案中，本发明的水果饮料基本上不含有乳组分，但可包含蔬菜汁、蔬菜浓缩物和/或蔬菜酱。
在一个实施方案中，这些水果饮料的pH在介于3.2与4.2之间、优选地介于3.5与3.9之间的范围内。
在一个优选实施方案中，整个或部分水果饮料是由选自由以下组成的组的水果制成：草莓、香蕉、葡萄、橙子、苹果、芒果、桃、蓝莓、菠萝、酸橙、覆盆子和黑醋栗以及其混合物。
根据本发明一优选实施方案，水果饮料包含草莓酱、香蕉酱、葡萄汁、橙汁、芒果酱、桃酱和蓝莓酱。
根据本发明另一优选实施方案，水果饮料包含菠萝汁、橙汁、香蕉酱、芒果酱和酸橙汁。
根据本发明再一优选实施方案，水果饮料包含覆盆子酱、黑醋栗汁、蓝莓酱、葡萄汁、草莓酱和香蕉酱。
在不进行pH稳定的情况下通过增殖使至少一种益生菌在适宜培养基中具有酸适应性。在一个实施方案中，在不进行pH稳定的情况下使至少一种益生菌在25℃到43℃范围内、优选地在25℃到40℃范围内的温度下在初始pH介于约6.0与约7.0之间的培养基中增殖，所述培养基具有优选地在增殖至少8小时后允许所述培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH的组分，从而产生酸适应性益生菌的至少一种菌株；收获酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；优选地浓缩酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；并且任选地冷冻或冷冻干燥酸适应性益生菌的所述至少一种菌株。
用于使益生菌具有酸适应性的培养基优选地具有在益生菌增殖期间允许所述培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH的组分。此意指，培养基的pH由于益生菌产生酸而降低，或者通过连续或逐渐添加酸到培养物而降低。因此，培养基不含有在介于约5.0与约4.0之间的pH下会分解或以其它方式变得无效或甚至有毒的任何基本组分。培养基的基本组分是益生菌增殖所需的化合物，例如营养素、碳源和氮源、维生素等等。
在优选实施方案中，用于增殖的培养基包含至少0.4％酵母提取物和至少2％糖。
可用于益生菌、尤其乳酸菌增殖的适宜培养基为所属领域内所熟知。例如，如果所欲使用的益生菌是乳酸菌，那么可使用用于乳酸菌的任何商购培养基，例如乳杆菌MRS(deMan、Rogosa和Sharpe)培养基。可用于益生菌增殖的实例性MRS培养基含有1.0％蛋白胨、0.8％肉膏、0.4％酵母提取物、2.0％葡萄糖、0.5％三水乙酸钠、0.1％聚山梨醇酯80(也称为Tween80)、0.2％磷酸氢二钾、0.2％柠檬酸三铵、0.02％七水硫酸镁和0.005％四水硫酸锰，在25℃下pH为6.0-7.0。当使用此培养基使益生菌具有酸适应性时，特别优选地，省去磷酸氢二钾组分，以使得尽管在细菌产生酸后或在从外部添加酸后，但所述培养基仍不能提供稳定pH。在甚至更优选的实施方案中，从上述MRS培养基省去磷酸氢二钾组分与三水乙酸钠组分二者。然而，如本文其它地方所概述，也可以在用于使益生菌具有酸适应性的培养基中维持缓冲组分。在此情况下，在缓冲能力已经耗尽后将发生pH下降。益生菌的培养将不包括碱的任何外部添加。
通常，所属领域的技术人员会了解用于益生菌增殖的适宜培养基。含有或不含有缓冲组分的上述培养基适于起子培养物(例如体积为约100mL、约500mL、约1000mL、约2000mL、约4000mL或更大的起子培养物)以及大规模细菌培养物(例如体积超过50L、超过100L、超过200L或超过400L的培养物)增殖。所述大规模培养物通常会在发酵器中实施。适宜培养基的使用在下文实施例1中进行例示。
培养基的初始pH是培养基在添加益生菌之前的pH。在优选实施方案中，培养基的初始pH介于约6.0与7.0之间、优选地介于约6.2与约6.6之间。
在本发明的一个实施方案中，优选地在益生菌增殖至少6小时、至少8小时、至少10小时后且更优选地在益生菌增殖至少12小时后，培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH。在特别优选的实施方案中，在至少8小时后，培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH。
益生菌可由于发酵期间乳酸的产生而引起增殖期间的pH下降。在优选实施方案中，用于本发明方法中的培养基允许此pH下降，因为尽管在增殖期间形成乳酸，但所述培养基不含有或基本不含有保持pH稳定的任何缓冲剂。
优选地，在25℃到43℃范围内、优选地在25℃到40℃范围、更优选地在30℃到40℃范围内且最优选地在约37℃的温度下，在不进行pH稳定的情况下使益生菌增殖。
在本发明的优选实施方案中，益生菌的至少一种菌株属于属乳杆菌属或双歧杆菌属。
在本发明的更优选实施方案中，益生菌的至少一种菌株属于类干酪乳杆菌种。如果使用类干酪乳杆菌，那么用于增殖的温度优选为37℃或38℃。
菌株类干酪乳杆菌类干酪亚种CRL431(干酪乳杆菌)依照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)于1994年1月24日以保藏号ATCC55544保藏在美国典型培养物保藏中心(American Tissue type Collection Center)(10801University Blvd，Manassas，VA20110，USA)。该众所周知的益生菌可以产品名称F-DVS干酪乳杆菌物品编号501749和以产品名称C-Powder-30物品编号687018商购自Chr.Hansen A/S(10-12Boege Alle，DK-2970Hoersholm，Denmark)。
在本发明的甚至更优选的实施方案中，益生菌的至少一种菌株选自由以下组成的组：以保藏号ATCC55544保藏在美国典型培养物保藏中心的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株CRL431(干酪乳杆菌)、其突变体和其变体。
收获和浓缩酸适应性益生菌的方法为所属领域内所熟知。例如，细菌的收获可通过离心细菌培养物以去除培养基上清液来完成。离心应当足够轻缓以避免破坏细菌。通过离心收获细胞的方法众所周知，并且包括例如在2000×g到6000×g下离心2-20分钟。也可以通过已经在细菌发酵的背景下描述的其它技术(例如过滤，例如错流过滤)收获细菌。用于浓缩的方法同样为所属领域内已知。例如，细菌的浓缩可以通过离心和随后以较小的体积再悬浮、冷冻干燥或膜过滤技术(例如经由柱或过滤器过滤)完成。
通常，以以下的量(初始CFU/ml)向水果饮料接种酸适应性益生菌的至少一种菌株：约1×104CFU/ml到1×1010CFU/ml的量、更优选地以约1×105CFU/ml到1×109CFU/ml的量且甚至更优选地以约1×106CFU/ml到1×108CFU/ml的量。
令人惊讶地，在进行上述酸性条件适应后，益生菌的活力特别高并且在4-10℃的温度下储存数个月时间后仍然很高。在一个实施方案中，在水果饮料中在8℃的温度下储存至少30天后，例如在8℃的温度下储存至少42天后，例如在8℃的温度下储存至少70天后，酸适应性益生菌的至少一种菌株的活力是初始CFU/ml的至少50％。
在优选实施方案中，在上述储存条件下，酸适应性益生菌的至少一种菌株的活力是初始CFU/ml的至少60％，优选为初始CFU/ml的至少70％，且更优选为初始CFU/ml的至少80％。
根据所属领域内的标准方法，通过对琼脂板进行菌落计数，通过定量连续稀释液中的菌落形成单位(CFU)数，来测量活细胞数。适宜培养基和培育条件在下文实施例中给出。
在收获和/或浓缩后，任选地冷冻或冷冻干燥酸适应性细菌。例如，可在约-20℃，优选地在约-80℃或更低下冷冻益生菌。冷冻程序优选地尽可能快地实施，优选地通过休克冷冻来实施，以避免细胞损害。休克冷冻可例如通过将含有细菌的容器倾倒入液氮中来实施。因此，在特别优选的实施方案中，将酸适应性益生菌在约-196℃下休克冷冻。用于冷冻干燥的方法也为所属领域内所熟知。在冷冻干燥期间，将材料冷冻并且随后降低周围压力以使冷冻材料中的水从固相直接升华到气相。在冷冻或休克冷冻酸适应性细菌后，可将细菌储存在约-20℃、约-55℃、约-80℃或在液氢中在-196℃。特别优选地，将酸适应性细菌储存在约-55℃。
根据本发明实施方案，将益生菌水果饮料方便地包装在含有10ml到5000ml(例如50ml到1000ml或200ml到1000ml)产品的密封包装中。
在第二个方面，本发明涉及可通过根据本发明第一个方面的方法获得的益生菌水果饮料，其中所述益生菌水果饮料包含酸适应性益生菌的至少一种菌株。
在一个实施方案中，在8℃的温度下储存至少30天后，例如在8℃的温度下储存至少42天后，益生菌的至少一种菌株以约1×104CFU/ml到1×1010CFU/ml的量，更优选地以约1×105CFU/ml到1×109CFU/ml的量且甚至更优选地以约1×106CFU/ml到1×108CFU/ml的量存在于水果饮料中。
根据所属领域内的标准方法，通过对琼脂板进行菌落计数，通过定量连续稀释液中的菌落形成单位(CFU)数，来测量活细胞计数。适宜培养基和培育条件在下文实施例中给出。
在第三个方面，本发明涉及在不进行pH稳定的情况下通过增殖获得培养物的酸适应性益生菌菌株的方法。在优选实施方案中，在不进行pH稳定的情况下，使益生菌在25℃到43℃范围内、更优选地在25℃到40℃范围内的温度下在初始pH介于约6.0与约7.0之间的培养基中增殖，所述培养基具有在增殖至少8小时后允许培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH的组分，从而产生酸适应性益生菌；收获所述酸适应性益生菌；浓缩所述酸适应性益生菌；并且任选地冷冻或冷冻干燥所述酸适应性益生菌。
在一个优选实施方案中，培养基包含至少0.4％酵母提取物和至少2％糖。
培养基的初始pH是培养基在添加益生菌之前的pH。在优选实施方案中，培养基的初始pH介于约6.2与约6.6之间。
在本发明的优选实施方案中，在益生菌增殖至少10小时后，优选地在益生菌增殖至少12小时后，培养基达到介于约5.0与约4.0之间的pH。
在优选实施方案中，益生菌属于属乳杆菌属或双歧杆菌属。
在本发明的更优选实施方案中，益生菌的至少一种菌株属于类干酪乳杆菌种。
在本发明的甚至更优选的实施方案中，益生菌的至少一种菌株选自由以下组成的组：以保藏号ATCC55544保藏在美国培养物保藏中心的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株CRL431(干酪乳杆菌)、其突变体和其变体。
本发明的第四个方面涉及根据本发明第三个方面的酸适应性益生菌菌株的培养物。
第五个方面涉及根据第四个方面的培养物用于产生益生菌水果饮料的用途。
在一个优选实施方案中，益生菌水果饮料具有最多4.2的pH。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1.酸适应性干酪乳杆菌 的产生
向来自Difco的MRS培养基(编号288110)接种1％(V/V)来自冻存物的干酪乳杆菌使所述培养物在37℃下生长过夜直到pH低于3.9，并且将其储存在5℃直到使用。将此过夜培养物用于接种4L(1％，V/V)MRS培养基(Difco)并且在37℃下培育过夜直到pH低于3.9，并且将其储存在5℃下直到使用。进行此预接种步骤以获得足量的接种物用于发酵。向含有10℃的400L适宜培养基的生物反应器接种整个体积的预接种物。通过将温度增加到35℃来起始发酵并且在发酵时监测pH的降低作为碳水化合物产生乳酸的代谢的指示。在此pH下降期间，细胞逐渐适应低pH。在pH5.0、4.5和4.0下通过离心收获酸适应性细胞。根据收获点发酵时间介于10-17小时之间(图1)。
立即将浓缩细胞团冷冻在液氮(-196℃)中并且储存在-55℃下直到使用。
实施例2.用于酸适应性干酪乳杆菌 的收获标准的优化
为了获得最大的活细胞数，如下确定最佳收获标准。向生物反应器接种预接种物并且如实施例1中所描述来起始发酵。从接种后11小时(对应于pH4.5)开始，每30分钟取发酵物样品，直到pH低于4.0，并且通过测定菌落形成单位(CFU)数来评估活力(图2)。通过在MRS琼脂中倾倒平铺合适的10倍稀释液、之后在37℃下厌氧培育3天来测定CFU。
细胞计数增加直到接种后12h(对应于4.24的pH)，并且在整个发酵期间，都保持在恒定水平。此表明，细胞是稳健的并且甚至在pH下降到低于4.0时，仍然是活的。将pH＜4.0确定为在可行的处理时间内提供适应酸且为活的足量细胞的最佳收获标准。
实施例3.添加有适应性干酪乳杆菌 的各种水果饮料的存活和感官品质
使用根据实施例1中描述的程序产生的干酪乳杆菌接种由以下成分构成的基于水果的不同饮料：
草莓和香蕉汁(pH3.75)
31％草莓酱
26％香蕉酱
葡萄汁、橙汁、芒果酱、桃酱和蓝莓酱，补足到100％
热带果汁(pH3.88)
32％菠萝汁
32％橙汁
26％香蕉酱
7％芒果酱
3％酸橙汁
红色水果汁(pH3.55)
16％不同的红色水果(覆盆子酱、黑醋栗汁、蓝莓酱)
葡萄汁、草莓酱及香蕉酱，补足到100％
在盐水蛋白胨中稀释益生菌培养物的F-DVS以确保，通过将1％v/v的接种物添加到不同水果汁的纸箱中获得5×107CFU/ml或1×108CFU/ml的初始细胞计数。向果汁接种适应pH4.0或pH5.0的干酪乳杆菌和作为对照的非适应性的干酪乳杆菌作为感官分析的对照，向纸箱接种相同体积的盐水蛋白胨。将接种的果汁避光储存在8℃下。通过在MRS琼脂中倾倒平铺合适的10倍稀释液、之后在37℃下厌氧培育3天来定期测定干酪乳杆菌的细胞计数。感官评估是在储存期间由3个经过培训的感官评估人组成的小组来实施。
图3、4和5中对不同果汁中干酪乳杆菌的细胞计数进行了图解说明。酸适应性干酪乳杆菌细菌未受到在pH3.5-3.9的酸性环境中储存至少30天的影响，而非适应性的干酪乳杆菌细菌在水果饮料中的活力低了1000倍。
30天储存期间的感官评估显示，与添加有对应体积的盐水蛋白胨的相同水果饮料相比，添加有干酪乳杆菌的任一种水果饮料都没有感官变化。
实施例4.橙汁中的干酪乳杆菌 在适应三种不同的pH值时的存活
使用根据实施例1中描述的程序产生的干酪乳杆菌接种100％橙汁(pH3.8)。在盐水蛋白胨中稀释益生菌培养物的F-DVS以确保通过将1％v/v的接种物添加到橙汁的纸箱中获得1.5×108CFU/ml的初始细胞计数。向果汁接种适应pH4.0、pH4.5或pH5.0的干酪乳杆菌和作为对照的非适应性的干酪乳杆菌将果汁在8℃下避光储存42天并且定期取样，以供通过在MRS琼脂中倾倒平铺合适的10倍稀释液、之后在37℃下厌氧培育3天来测定细胞计数。
如图6中所图解说明，当在产生期间适应pH4.0、4.5或5.0时，干酪乳杆菌的细胞计数相当恒定，而非适应性的干酪乳杆菌则观察到显著的细胞计数减小。
实施例5.适应性干酪乳杆菌431在冷冻储存期间的稳定性.
将根据实施例1产生的干酪乳杆菌作为冷冻颗粒储存在-50℃，并且定期测试其活力。通过在MRS琼脂中倾倒平铺合适的10倍稀释液、之后在37℃下厌氧培育3天对解冻培养物进行细胞计数测定。如图7中所图解说明，在产生期间，非适应性以及适应pH4.0、4.5或5.0的干酪乳杆菌的细胞计数在至少6个月内非常恒定。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知用于实施本发明的最佳模式。所属领域的技术人员在阅读前述说明后可以明了那些优选实施方案的各种变化形式。本发明人期望所属领域的技术人员适当采用所述变化形式，并且所述发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的本文所附权利要求书中所引述标的物的所有修改形式和等效形式。此外，除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖在所有可能的变化形式中上述要素的任一组合。
实施例6.果汁中的干酪乳杆菌在长期冷冻储存后的存活
作为冷冻颗粒在-50℃下储存6个月后，测定在产生期间适应pH4.0的干酪乳杆菌431批次在100％橙汁中的存活。在盐水蛋白胨中稀释益生菌培养物的F-DVS以确保，通过将1％(v/v)的接种物添加到橙汁的纸箱中获得108CFU/ml的初始细胞计数。作为对照，向100％橙汁的其它纸箱中添加在-50℃下储存6个月的非适应性的干酪乳杆菌将果汁在8℃下避光储存并且定期取样，以供通过在MRS琼脂中倾倒平铺合适的10倍稀释液、之后在37℃下厌氧培育3天来测定干酪乳杆菌细胞计数。
如图8中所图解说明，当在产生期间适应pH4.0，在-50℃下储存6个月并且随后在橙汁中冷储存6周时，干酪乳杆菌的细胞计数相当恒定。相反，当在-50℃下储存6个月并且添加到橙汁时，非适应性的干酪乳杆菌观察到显著的细胞计数减小。此图解说明，在产生期间适应pH4.0的干酪乳杆菌在橙汁中的良好存活甚至在培养物在-50℃长期冷冻储存后仍然得以维持。
实施例7.适应性干酪乳杆菌 在100％橙汁中的长期储存稳定性
使用根据实施例1中描述的程序产生的干酪乳杆菌接种100％橙汁(pH3.8)。在盐水蛋白胨中稀释益生菌培养物的F-DVS以确保，通过将1％v/v的接种物添加到果汁的纸箱中获得约108CFU/ml的初始细胞计数。向果汁接种适应pH4.0的干酪乳杆菌或作为对照的非适应性的“对照”干酪乳杆菌将橙汁在8℃下避光储存70天并且定期取样，以供通过在MRS琼脂中倾倒平铺合适的10倍稀释液、之后在37℃下厌氧培育3天来测定细胞计数。
如图9中所图解说明，当在产生期间适应pH4.0并且随后在橙汁中冷储存长达10周时，干酪乳杆菌的细胞计数相当恒定。相反，当在橙汁中冷储存时，非适应性的干酪乳杆菌从储存3周的第一次取样点观察到显著的细胞计数减小。此图解说明，甚至在长达10周的冷储存后，适应pH4.0的干酪乳杆菌在橙汁中的存活仍然极好。
参考文献
欧洲专利EP0113055
美国专利申请案US2010/0086646
PCT专利申请案WO2010/132017
此专利文件中引述的所有参考文献都以整体引用的方式并入本文中。

Claims (23)

1.一种产生益生菌水果饮料的方法，所述方法包括：
(a)使益生菌的至少一种菌株在增殖期间进行酸适应，所述酸适应包括：
(i)在不进行pH稳定的情况下，使益生菌的所述至少一种菌株在25℃到43℃范围的温度下在具有初始pH为6.0至7.0的适宜培养基中，在逐渐降低的pH水平直到达到介于4.0与5.0之间的pH存在下增殖，所述培养基具有允许所述培养基达到5.0至4.0的pH的组分；
(ii)收获酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；
(iii)浓缩酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；和
(iv)任选地，冷冻或冷冻干燥酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；
(b)向水果饮料接种步骤(a)的酸适应性益生菌的所述至少一种菌株；和
(c)任选地，包装所述益生菌水果饮料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的酸适应包括：在不进行pH稳定的情况下，使益生菌的所述至少一种菌株在25℃到40℃范围的温度下增殖。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中的所述培养基包含至少2％糖和至少0.4％酵母提取物。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(b)中，向所述水果饮料接种以下初始CFU/ml水果饮料的量的酸适应性益生菌的所述至少一种菌株：1×104CFU/ml水果饮料到1×1010CFU/ml水果饮料。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述初始CFU/ml水果饮料的量为1×105CFU/ml水果饮料到1×109CFU/ml水果饮料。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述初始CFU/ml水果饮料的量为1×106CFU/ml水果饮料到1×108CFU/ml水果饮料。
7.根据权利要求1-3和5-6中任一权利要求所述的方法，其中在所述水果饮料中在8℃的温度下储存至少30天后，酸适应性益生菌的所述至少一种菌株的活力是初始CFU/ml水果饮料的至少50％。
8.根据权利要求4所述的方法，其中在所述水果饮料中在8℃的温度下储存至少30天后，酸适应性益生菌的所述至少一种菌株的活力是初始CFU/ml水果饮料的至少50％。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在所述水果饮料中在8℃的温度下储存至少42天后，酸适应性益生菌的所述至少一种菌株的活力是初始CFU/ml水果饮料的至少50％。
10.根据权利要求8所述的方法，其中在所述水果饮料中在8℃的温度下储存至少42天后，酸适应性益生菌的所述至少一种菌株的活力是初始CFU/ml水果饮料的至少50％。
11.根据权利要求9所述的方法，其中在所述水果饮料中在8℃的温度下储存至少70天后，酸适应性益生菌的所述至少一种菌株的活力是初始CFU/ml水果饮料的至少50％。
12.根据权利要求10所述的方法，其中在所述水果饮料中在8℃的温度下储存至少70天后，酸适应性益生菌的所述至少一种菌株的活力是初始CFU/ml水果饮料的至少50％。
13.根据权利要求1-3、5-6和8-12中任一权利要求所述的方法，其中所述益生菌水果饮料的pH在3.2到4.2范围内。
14.根据权利要求4所述的方法，其中所述益生菌水果饮料的pH在3.2到4.2范围内。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述益生菌水果饮料的pH在3.2到4.2范围内。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述益生菌水果饮料的pH在3.5到3.9范围内。
17.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述益生菌水果饮料的pH在3.5到3.9范围内。
18.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中益生菌的所述至少一种菌株选自由乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)组成的组。
19.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中所述益生菌水果饮料包含20重量％到99.99重量％的水果汁和/或水果酱。
20.一种益生菌水果饮料，其能通过根据权利要求1-19中任一权利要求所述的方法获得。
21.根据权利要求20所述的益生菌水果饮料，其中在8℃的温度下储存至少30天后，益生菌的所述至少一种菌株以1×104CFU/ml到1×1010CFU/ml的量存在于所述水果饮料中。
22.根据权利要求21所述的益生菌水果饮料，其中在8℃的温度下储存至少30天后，益生菌的所述至少一种菌株以1×105CFU/ml到1×109CFU/ml的量存在于所述水果饮料中。
23.根据权利要求22所述的益生菌水果饮料，其中在8℃的温度下储存至少30天后，益生菌的所述至少一种菌株以1×106CFU/ml到1×108CFU/ml的量存在于所述水果饮料中。
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