KR20140005988A - 과일 음료 중의 프로바이오틱 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 파라 카제이 아종 파라카제이의 균주와 같은, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 높은 생존 계수를 포함하는 프로바이오틱 과일 음료를 생산하는 방법 및 그와 같은 방법에 의하여 얻어지는 프로바이오틱 과일 음료에 관한 것이다.

Description

과일 음료 중의 프로바이오틱{PROBIOTICS IN FRUIT BEVERAGES}
본 발명은 살아있는 프로바이오틱의 높은 계수를 포함하는 과일 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그와 같은 방법에 의하여 얻어지는 프로바이오틱 과일 음료 및 산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아의 프로바이오틱 과일 음료의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
몇몇 박테리아는 프로바이오틱 특성, 즉 적당한 생존가능한 양으로 섭취되는 경우 숙주에게 유익한 건강적 효능을 갖는 것으로 알려져 있다. 특히 락토바실러스 및 비피도박테리아 속에 속하는 박테리아 균주는, 다양한 분야에서 특정 생리학적 기능에 대한 예방적인 임상적 효과를 설명하는 수많은 연구의 대상이 되어 왔다. 이러한 프로바이오틱은 일반적으로 안전하고 장내 식물군의 적절한 처리를 촉진하는 현저한 능력이 있다. 박테리아가 프로바이오틱으로서 정의되기 위해서는, 그것이 소비자의 건강에 긍정적인 영향을 갖는다는 명백한 증거에 더하여, 장내에서 생존하여 군집화할 수 있는 능력과 식품의 생산 및 저장의 가혹한 과정 중에서 생존할 수 있는 능력을 가져야 한다. 임상적인 증거는 프로바이오틱 효과를 보증하기 위한 프로바이오틱 박테리아의 일일 투여량은 적어도 109 CFU이어야 한다는 것을 나타낸다.
프로바이오틱 제품 시장은 성장을 계속하고 있다. 프로바이오틱은 특히 젖산균이 배지에 상대적으로 잘 적응하는 낙농 제품 중에 포함된다. 현재는 오렌지 주스와 다른 종류의 과일 주스 및 과일 퓨레와 과일 주스를 함유하는 음료가 프로바이오틱 배양의 중요한 담체로서 알려져 있는데, 이는 과일 및 프로바이오틱 모두에 유익하다. 또한, 우유 성분을 포함하지 않는 과일 음료는 L. 카제이 431®(Chr. Hansen, Hoersholm, Denmark)과 같은 저알레르기성 프로바이오틱의 투여를 위한 탁월한 방법이다.
그러나, 다소 산성인 과일 주스의 환경은, 예컨대 오렌지 주스에 프로바이오틱 참조 용량을 첨가한 경우, 초기 세포 계수(count)의 큰 감소를 야기한다. 과일 음료 중에서 프로바이오틱을 성공적으로 배양하기 위해서는, 보관 기간 동안 프로바이오틱 세포의 농도가 적절하게 보장되어야 한다. 따라서 오렌지 주스 및 다른 과일 주스 중의 프로바이오틱 배양물의 생존의 증가는 매우 중요한 것으로 여겨진다.
살아있는 락토바실러스의 유효량을 함유하는 과일 음료를 생산하는 방법이 유럽 특허 EP 0113055와 같이 당업계에 알려져 있는데, 이는 정균(bacteriostatic) 성분을 제거하기 위하여 과일 주스를 고형 제제와 접촉하게 하는 단계 및 pH 4.0 이하의 과일 주스 중에서 락토바실러스를 번성시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
그러나 그와 같은 과일 음료 중에서는, 소비에 부적합하게 하는 가스 생성 및 이취를 유도하는 박테리아의 성장 및/또는 활성을 관찰하는 것이 가능하다.
미국특허출원 US 2010/0086646는 살아있는 프로바이오틱과 pH 3 내지 4의 양성화된 약한 식이 단일산을 함유하는 신선한 식물 주스 및/또는 우유에 기반한 식품에 관한 것인데, 여기서 단일산은 식품 중에서 프로바이오틱이 나쁜 맛 및/또는 가스를 생성시키는 것을 예방한다.
PCT 특허출원 WO 2010/132017는 적어도 1종의 프로바이오틱 박테리아 균주 및 아세로라, 석류열매, 크렌베리, 아크니아(arqnia), 블랙 커런트, 갈매나무 열매(buckthorn) 또는 엘더베리 중에서 선택되는 적어도 1종의 가스 형성 감소제를 포함하는 프로바이오틱 과일 주스 음료에 관한 것이다.
단일산의 부과는 식품의 관능적 효과에 영향을 미칠 수 있고, 또한 프로바이오틱 박테리아의 생존율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 산 형성 감소제의 첨가 또한 프로바이오틱 박테리아의 생존율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보인다. 게다가, 정균 성분의 제거를 위한 및/또는 식품 내 나쁜 맛 및/또는 가스의 감소를 위한 제제의 첨가는 비싼 것으로 입증될 수도 있다.
따라서, 이취 및 가스 생성 없이 좋은 맛을 나타니고, 장기간의 보관 기간을 갖는, 높은 프로바이오틱 가치를 가지는 프로바이오틱 과실 음료를 생산하기 위한 대체적인 방법의 제공에 대한 요구가 당업계에 존재한다. 특히 과실 음료의 관능적 품질에 영향을 줄 수 있는 고형제, 단일산 또는 다른 화합물의 첨가를 수반하지 않는 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 과일 음료 중으로 접종하기에 앞서 산 적응된 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 과일 음료를 생산하는 대체적인 방법을 제안한다.
본 발명의 목적은 과일 음료의 산성 환경 중에서 생존할 수 있는 강건한 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 프로바이오틱 과일 음료를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 좋은 맛을 가진 프로바이오틱 과일 음료를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 장기간의 저장 수명을 가지는 그와 같은 프로바이오틱 과일 음료를 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 프로바이오틱 박테리아의 과다한 양의 첨가 없이, 과일 음료 중에 프로바이오틱 박테리아의 높은 CFU/ml를 얻기 위하여, 프로바이오틱 박테리아의 산에 대한 내성을 개선하기 위한 연구를 수행해왔으며, 그 결과 프로바이오틱 박테리아가 낮은 pH에 대하여 강건하도록 하였다.
본 발명은 발효 결과 생산물에 현저한 영향을 미치지 않고, 특정 시간의 기간 동안 pH 안정화 없는 번식에 의하여 프로바이오틱 박테리아가 산에 적응할 수도 있다는 발견에 기초한다.
산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아는 낮은 pH(4.2 미만)의 과일 음료에 첨가되기 위한 프로바이오틱 조성물로서 매우 유용하다. 이는 프로바이오틱 박테리아의 유익한 모든 능력과 과일의 높은 영양적 가치를 조합시킨다.
본 발명의 방법은 프로바이오틱 과일 음료의 관능적 특성에 영향을 미칠 수 있는 화학적 화합물의 과일 음료에의 첨가를 수반하지 않는다.
따라서, 본 발명의 제1의 관점은 다음의 단계를 포함하는 프로바이오틱 과일 음료를 생산하는 방법에 관한 것이다:
(a) 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 증식시키는 동안 산에 적응시키는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주로 과일 음료를 접종하는 단계; 및
(c) 프로바이오틱 과일 음료를 포장하는 임의의 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)에서 프로바이오틱 박테리아를 산에 적응시키는 단계는
(i) 초기 pH가 약 6.0 내지 약 7.0이고, pH가 약 5.0 내지 약 4.0에 도달할 수 있게 하는 조성을 가진 적절한 배지 중에서, 25℃ 내지 43℃의 온도, 좋기로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서, pH 안정화 없이 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 증식시키는 단계;
(ii) 산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 수확하는 단계;
(iii) 산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 농축시키는 임의의 단계; 및
(iv) 산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 동결 또는 동결 건조시키는 임의의 단계에 의하여 수행된다.
바람직한 구현예에서, 단계 (i)에서 상기 배지는 증식 적어도 8시간 후에 약 5.0 내지 약 4.0의 pH에 배지가 도달하는 것을 허용하는 조성을 가진다.
보다 바람직한 구현예에서, 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주는 단계 (iii), 즉 산에 적응시킨 박테리아를 수확한 후에 농축된다.
본 발명의 제2의 관점은 제1의 관점에 따른 방법에 의하여 얻을 수 있는 프로바이오틱 과일 음료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 균주 CRL431 (L. 카제이 431®)를 포함하는 프로바이오틱 과일 음료에 관한 것이다.
본 발명의 제3의 관점은 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주의 배양물을 얻는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 초기 pH가 약 6.0 내지 약 7.0이고, pH가 약 5.0 내지 약 4.0에 도달할 수 있게 하는 조성을 가진 적절한 배지 중에서, 25℃ 내지 43℃의 온도, 좋기로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서, pH 안정화 없이 프로바이오틱 균주를 증식시키는 단계;
(b) 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주를 수확하는 단계;
(c) 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주를 농축시키는 임의의 단계; 및
(d) 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주를 동결 또는 동결 건조시키는 임의의 단계.
바람직한 구현예에서, 단계 (a)에서 상기 배지는 증식 적어도 8시간 후에 배지가 약 5.0 내지 약 4.0의 pH에 도달하는 것을 허용하는 조성을 갖는다.
특히 바람직한 구현예에서, 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주는 단계 (c), 즉 산에 적응시킨 프로바이오틱 박테리아를 수확한 후에 농축된다.
제4의 관점은 본 발명의 제3의 관점에 따른 방법에 의하여 얻을 수 있는 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주의 배양물과 관련된 것이다.
제5의 관점은 본 발명의 제4의 관점에 따른 산에 적응시킨 프로바이오틱 균주의 배양물의, 프로바이오틱 과일 음료의 제조를 위한 용도에 관련된 것이다.
도 1은 L. 카세이 431®에 의한 MRS 배지(Difco)의 산성화를 나타낸다. 산에 적응시킨 세포를 pH 5.0, pH 4.5 및 pH 4.0에서 원심분리에 의하여 수확하였다.
도 2는 대규모의 생산 동안 L. 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 3은 생산하는 동안 비적응시키거나(다이아몬드), 아니면 pH 4.0(삼각형) 또는 pH 5.0(사각형)에 적응시킨 후, 저농도(5x107 CFU/ml, 닫힌 기호) 또는 고농도(1x108 CFU/ml, 열린 기호)로 딸기/바나나 주스에 첨가한 경우의 L. 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 4는 생산하는 동안 비적응시키거나(다이아몬드), 아니면 pH 4.0(삼각형) 또는 pH 5.0(사각형)에 적응시킨 다음에 저농도(5x107 CFU/ml, 닫힌 기호) 또는 고농도(1x108 CFU/ml, 열린 기호)로 열대 주스에 첨가한 경우의 L. 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 5는 생산하는 동안 비적응시키거나(다이아몬드), 아니면 pH 4.0(삼각형) 또는 pH 5.0(사각형)에 적응시킨 다음에 저농도(5x107 CFU/ml, 닫힌 기호) 또는 고농도(1x108 CFU/ml, 열린 기호)로 적과일 주스에 첨가한 경우의 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 6은 생산하는 동안 비적응시키거나(대조군), pH 4.0, 4.5 또는 5.0에 적응시킨 다음에 1.5x108 CFU/ml의 농도로 100%의 오렌지 주스에 첨가한 경우의 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 7은 생산하는 동안 비적응시키거나(대조군), pH 4.0, 4.5 또는 5.0에 적응시킨 다음, -50℃에서 동결된 펠렛으로 보관하고, 평판 배지법에 의하여 해동 배양에서 정기적으로 생존도를 측정한 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 8은 생산하는 동안 비적응시키거나(대조군), pH 4.0에 적응시킨 다음, -50℃에서 6달 동안 동결된 펠렛으로 보관하고, 그 다음 x축 상에 지시된 기간 동안에 8℃에서 보관된 오렌지 주스에 첨가한 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
도 9는 생산하는 동안 비적응시키거나(사각형), 아니면 pH 4.0에 적응시키고(삼각형), 그 다음 8℃에서 저장한 세포를 오렌지 주스에 첨가한 경우의 카세이 431®의 세포 계수를 나타낸다.
정의
본 명세서의 문맥에서, 용어 "과일 주스"는 열 및 용매의 존재 없이 신선한 과일을 기계적으로 짜거나 소화시켜 제조한 과일 중에 자연적으로 함유되어 있는 액체를 의미한다. "과일 주스"는 1종의 과일 또는 1종 이상의 과일 혼합물로부터 유래한 주스로 이루어질 수 있다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "과일 드링크"는 0 내지 29%의 과일 주스 함량을 갖는 음료를 의미한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "넥타"는 과일 주스 30 내지 99%의 과일 주스 함량을 갖는 음료를 의미한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "퓨레"는 열 및 용매의 존재 없이 갈거나, 압착하거나 및/또는 여과하여 짙은 액체 또는 부드러운 페이스트의 점성으로 제조된 과일을 의미한다. "퓨레"는 단지 과일의 주스로부터 만들어지는 것과 반대되게 100% 과일로 만들어진다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "과일 음료"는 과일 주스, 과일 농축 및/또는 과일 퓨레를 포함하는 음료를 의미한다. 용어 "과일 음료"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 "과일 주스", "과일 드링크" 및 "넥타"를 망라한다. "과일 음료"는 펄프를 포함하는 것 또는 원심분리와 같은 조작에 의하여 펄프가 제거된 것일 수 있다. 과일 음료는 예컨대, 귀리, 콩, 아몬드, 유장 및/또는 비발효된 우유, 예컨대 분유형태의 것을 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 과일 음료는 우유와 같은 낙농 성분을 포함하지 않는다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "산에 적응된" (박테리아)이란 배양 중에 낮아지는 pH 레벨에의 점진적 노출에 의하여, 낮은 pH에 대하여 관용적으로 만들어진 살아있는 박테리아를 의미한다. 따라서, 프로바이오틱 박테리아 균주를 산에 적응시키는 과정은 일반적으로 점진적으로 낮아지는 pH 레벨의 존재 중에서, 예컨대 pH가 4.0 내지 5.0에 도달할 때까지 이러한 균주를 배양하는 것을 포함한다. 좋기로는, 산 적응을 겪는 프로바이오틱 박테리아 그 자신이 그들이 번식하는 동안 산을 생산하며, 이는 배지에 축적된다. 보다 좋기로는 산을 생산하는 프로바이오틱 박테리아는 젖산 박테리아의 군에 속한다. 대체적으로는, 산 적응을 겪는 프로바이오틱 박테리아가 자연적으로 산을 생산하지 않는 경우에는 외부적인 산의 첨가에 의하여 낮아지는 pH를 또한 얻을 수 있다.
산 적응 과정은 좋기로는 pH 안정화 없이 배지 중에서 프로바이오틱 박테리아를 번식시키는 것에 의하여 수행된다. 표현 "pH 안정화 없이"란 점진적으로 낮아지는 pH를 상쇄하기 위한 그 어떠한 수단도 취해지지 않음을 의미한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아가 접종되는 배지는 일반적으로 산의 형성 또는 부가시 pH를 안정하게 유지할 수 있는 완충제를 포함하지 않는다. 대체적으로는, 시작 배지가 완충제의 특정 농도를 포함하는 경우에, 배양은 완충제의 용량이 소모될 때까지 계속될 수 있으며, 배양 동안에 추가적인 완충제가 첨가되지 않을 수 있다. 특히, 배양 중에 낮아지는 pH를 중화하기 위하여 염기성 화합물을 첨가하지 아니한다.
"이취"라는 용어는 식품의 비정상적인 맛을 의미한다. 이취는 소비자에게 불쾌하며 따라서 추구되지 않는다. 또한, 소위 "긍정적인" 표시, 예컨대 과일의 종류의 표시와 같은 것이 제품 중에서 탐지될 수도 있다. 이러한 맛이 소비자에게 불쾌하기 때문에, 본 발명에 따른 것들은 이취를 포함하지 않는다.
본 발명의 문맥에서, 용어 프로바이오틱 과일 음료를 "포장"하는 것은 예컨대 개인 또는 개인들의 그룹에 의하여 섭취될 수 있는 제품을 제조하기 위한, 프로바이오틱 과일 음료의 최종 포장과 관련된다. 적절한 포장은 따라서 병, 곽 또는 이와 유사한 것일 수 있으며, 적당한 양은 예컨대 10 ml 내지 5000 ml일 수 있지만, 포장 중의 양이 50 ml 내지 1000 ml, 예컨대 200 ml 내지 1000 ml인 것이 현재 선호된다.
용어 "프로바이오틱 박테리아"는 소비자의 건강 증진 효과 획득을 위한 목적으로 소비자에게 적당한 양으로 투여되는 살아있는 박테리아를 의미한다. 프로바이오틱은 분리된 투여 형태, 예컨대 캡슐, 현탁액 등과 같은 형태로서 투여될 수 있다. 대체적으로는, 프로바이오틱 박테리아는 식품 또는 식이 보충제의 형태로서 투여된다. 프로바이오틱 박테리아는 섭취된 후 위장관의 환경에서 생존할 수 있고, 소비자의 장에서 군집을 형성할 수 있는 능력이 있다. 프로바이오틱 박테리아로서 박테리아의 다양한 종이 본 기술 분야에서 사용되어 왔는데, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii)와 같은 락토바실러스 속의 박테리아, 비피도박테리움 에니멀리스(Bifidobacterium animalis), 피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 등과 같은 비피도박테라이 속의 박테리아를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "돌연변이체"는 유도된 균주 또는 예컨대 유전공학, 방시능 및/또는 화학 처리에 의하여 본 발명의 균주(또는 모체 균주)로부터 유도된 균주로서 이해되어야만 한다. 돌연변이체는 또한 자발적 발생 돌연변이체일 수도 있다. 돌연변이체는 기능적으로 동등한 변이체, 예컨대 돌연변이체는 모체 균주와 실질적으로 동일한, 또는 개선된 특성(예컨대, 맛, 사후 산성화, 산성화 속도 및/또는 산에 적응되는 능력에 관한 것)을 가진 돌연변이체인 것이 선호된다. 그와 같은 돌연변이체는 본 발명의 일부이다. 특이 용어 "돌연변이체"는 본 발명의 균주를 예컨대 에탄 메탄 술포네이트(EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)과 같은 화학적 변이원 처리, 자외선 처리를 포함하는, 통상적으로 사용되는 임의의 돌연변이발생법으로 처리하는 것에 의하여 얻어지는 균주 또는 자발적으로 발생하는 돌연변이체를 의미한다. 돌연변이체는 수개의 돌연변이발생 처리(단일의 처리는 그 다음에 스크리닝/선별 단계가 오는 단일의 돌연변이 발생 단계로 이해되어야 함)를 겪을 수도 있지만, 20개를 넘지 않는, 또는 10개를 넘지 않는, 또는 5개를 넘지 않는 처리법(또는 스크리닝/선별 단계)이 수행되는 것이 현재 선호된다. 현재 선호되는 돌연변이체에서는, 모체 균주와 비교하여 박테리아 게놈 내 뉴클레어타이드의 5% 미만, 또는 1% 미만, 또는 심지어 0.1% 미만이 다른 뉴클레오타이드로 교체되거나, 또는 삭제되어 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "변이체"는 본 발명의 균주와 기능적으로 동등한 균주, 예컨대, 동일하거나 개량된 특성(예컨대 맛, 사후 산성화, 산성화 속도 및/또는 산에 적응되는 능력과 관련된 것)을 가지는 것으로 이해되어야만 한다. 그와 같은 변이체는 적절한 스크리닝 기법을 사용하여 동정될 수 있는데, 이들은 본 발명의 일부이다.
본 발명을 기술하는 문맥(특히 하기 청구항의 문맥)에 있어서, 용어 하나("a" 및 "an") 및 그("the") 및 유사한 용어는, 본 명세서에 다르게 지시되거나 또는 문맥에 명백하게 모순되는 것이 아닌한, 단일 및 복수 모두를 포괄하는 것으로 해석되기 위한 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", "함유하는" 및 "보유하는"은 다르게 표시된 바 없다면 개방된 용어(즉, 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님을 의미함)로서 해석되기 위한 것이다.
본 명세서에서 값 범위에 대한 언급은, 본 명세서에 달리 지시된 바 없다면, 단지 그 범위에 속하는 각각의 분리되는 값을 개별적으로 언급하는 빠른 수단으로서의 기능으로 의도된 것에 불과하다며, 각각의 개별적인 값은 마치 그들이 본 명세서에 개별적으로 언급된 바와 같이 명세서에 통합된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 다르게 지시되거나 달리 해석시 문맥에 명백하게 모순되는 것이 아닌한, 그 어떠한 적절한 순서로도 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의 및 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예컨대, 와 같은)의 사용은, 다르게 주장된 바가 없다면, 단지 본 발명을 더 명확하게 하기 위한 것을 의도한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위에 제한을 부가하지 아니한다. 명세서의 그 어떠한 언어도 본 발명을 수행하는데 필수적인 청구되지 않은 임의의 요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 수행 및 관점
락토바실러스 및 비피도박테리아 속의 것과 같은 프로바이오틱 박테리아 균주는 음료에 사용될 수 있다. 그러나, 그들은 산성 환경에 민감하고 4.2 이하의 배지에 접종되는 경우 생존한 세포 계수는 급속하게 감소한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 프로바이오틱 박테리아 균주를 산에 적응시키는 것에 의하여, 일반적으로 과일 산으로 인하여 3-4의 범위보다 낮은 pH를 가지는 과일 음료 중에서 그들의 생존이 현저하게 증가하는 것을 관찰하였다. 산에 적응된 프로박테리아의 생존능력은 과일 음료 중에서 10주에 달하는 차가운 저장기간 동안에 낮은 pH에 필수적인 영향을 받지 아니하였으며, 산성 환경 중의 높은 생존능력은 박테리아의 동결 보관 중에도 유지되었다.
추가적으로, 적과일, 열대 과일 및 딸기/바나나 과일 음료와 같은 과일 음료에 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아를 첨가한 경우 그 어떠한 이취도 탐지되지 않았다.
따라서, 본 발명의 제1의 관점은 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주로 과일 음료를 접종하는 것에 의하여 프로바이오틱 과일 음료를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 사용되기에 적합한 과일 음료의 예로는 낮은 pH 값을 갖는 것들, 특히 오렌지 주스와 같은 감귤류 주스, 포도 주스, 라임 주스 및 만다린 주스 및 이들의 혼합물을 포함하는 것들이 있다. 과일 음료의 다른 예로는 사과 주스를 함유하는 과일 음료가 포함된다.
본 발명에 사용되기에 적합한 과일 음료는 예컨대 과일 주스, 농축액으로부터 온 과일 주스, 과일 드링크 및 과일 텍타, 임의로는 과일 퓨레 및/또는 물을 함유하는 것일 수 있다.
과일 음료 중의 과일 주스 및/또는 과일 퓨레의 총 함량은 일반적으로 약 20 내지 약 99.99 중량%, 좋기로는 약 30 내지 95 중량%, 더 좋기로는 약 40 내지 90 중량%, 더 더욱 좋기로는 약 50 내지 80 중량%, 및 가장 좋기로는 60 내지 70 중량%이다.
일 구현예에서, 본 발명의 과일 음료는 실질적으로 우유 성분을 포함하지 않으나, 야채 주스, 야체 농축 및/또는 야체 퓨레는 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 과일 음료의 pH는 3.2 내지 4.2, 좋기로는 3.5 내지 3.9의 범위이다.
바람직한 일 구현예에서, 과일 음료는 전체 또는 부분적으로 딸기, 바나나, 포도, 오렌지, 사과, 망고, 복숭아, 블루베리, 파인애플, 라임, 라즈베리 및 블랙 커런트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 과일로부터 제조된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 과일 음료는 딸기 퓨레, 바나나, 퓨레, 포도 주스, 오렌지 주스, 망고 퓨레, 복숭아 퓨레 및 블루베리 퓨레를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 과일 음료는 파인애플 주스, 오렌지 주스, 바나나 퓨레, 망고 퓨레 및 라임 주스를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 과일 음료는 라즈베리 퓨레, 블렉 커런트 주스, 블루베리 퓨레, 포도 주스, 딸기 퓨레 및 바나나 퓨레를 포함한다.
적어도 하나의 프로바이오틱 박테리아는 적절한 배지 중에서 pH 안정화 없이 번식에 의하여 산에 적응된다. 일 구현예에서 적어도 1종의 프로바이오틱 박테리아는
25℃ 내지 43℃, 좋기로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서, 약 6.0 내지 약 7.0의 초기 pH를 갖는 배지 중에서 pH 조정없이 번식되는데, 여기서 상기 배지는 좋기로는 적어도 8시간의 번식 후에 pH 약 5.0 내지 약 4.0에 도달하게 하는 것을 허용하는 조성을 가진 것이며, 그에 의하여 산에 적응된 프로바이오 박테리아 적어도 1종의 균주를 생산한다; 산에 적응된 프로바이오 박테리아 적어도 1종의 균주를 수확한다; 산에 적응된 프로바이오 박테리아 적어도 1종의 균주를 바람직하게는 농축시킨다; 그리고, 산에 적응된 프로바이오 박테리아 적어도 1종의 균주를 임의로 동결시키거나 또는 동결 건조시킨다.
프로바이오틱 박테리아를 산에 적응시키기 위하여 사용하는 배지는 좋기로는, 프로바이오틱 박테리아의 번식 중에 배지가 약 5.0 내지 약 4.0의 pH에 도달하는 것을 허여하는 조성을 가지는 것이다. 이는 프로바이오틱 박테리아에 의한 산의 생산으로 인해, 또는 대체적으로는 배양에의 연속적인 또는 단계적인 산 첨가에 의하여 배지의 pH가 감소함을 의미한다. 따라서, 배지는 약 5.0 내지 약 4.0의 pH에서 분해되거나 또는 효과적이지 않게 되거나 또는 심지어 독성을 갖게 되는 그 어떠한 필수적인 성분도 포함하지 않는다. 배지의 필수적인 성분은 영양소, 탄소 및 질소원, 비타민 등과 같이, 프로바이오틱 박테리아의 증식을 위하여 요구되는 화합물이다.
바람직한 구현예에서, 번식에 사용되는 배지는 이스트 추출물 적어도 0.4%와 당 적어도 2%를 포함한다.
프로바이오틱 박테리아, 특히 젖산균의 번식에 사용될 수 있는 적절한 배지는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 만일 사용하고자 하는 프로바이오틱 박테리아가 젖산균이라면, 젖산균을 위한 상업적으로 이용가능한 그 어떠한 배양 배지라도 사용할 수 있는 데, 예컨대 락토바실리 MRS 배지(de Man, Rogosa and Sharpe)가 있다. 프로바이오틱 박테리아의 번식을 위하여 사용될 수 있는 예시적인 MRS 배지는, pH 6.0-7.0, 25℃에서, 펩톤 1.0 %, 고기 추출물 0.8 %, 이스트 추출물 0.4 %, 글루코스 2.0 %, 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 0.5 %, 폴리소르베이트 80(또한 트윈 80으로도 알려짐) 0.1 %, 디포타슘 하이드로겐 포스페이트 0.2 %, 트리암모늄 시트레이트 0.2 %, 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 0.02 % 및 망간 설페이트 테트라하이드레이트 0.005 %를 포함한다. 프로바이오틱 박테리아를 적응시키기 위하여 이 배지를 사용하는 경우, 디포타슘 하이드로겐 포스페이트 성분은 제거하여 배지가 박테리아에 의한 산에 형성 또는 외부적 산 첨가에도 불구하고 안정한 pH를 제공하는 것을 불가능하게 하는 것이 특히 바람직하다. 보다 더욱 바람직한 구현예에서, 디포타슘 하이드로겐 포스페이트 성분과 소듐 아세테이트 트리하이드레이트 성분 둘 모두를 상기 MRS 배지로부터 제거한다. 그러나, 본 명세서의 다른 곳에서 약술된 바와 같이, 프로바이오틱 박테리아를 산에 적응시키기 위하여 사용하는 배지 중에 완충 성분을 유지하는 것 또한 가능하다. 이 경우, pH의 하강은 버퍼의 용량이 소진된 이후에 발생할 것이다. 프로바이오틱 박테리아의 배양은 그 어떠한 염기의 외부 첨가를 포함하지 않을 것이다.
일반적으로, 숙련된 자는 프로바이오틱 박테리아 번식을 위하여 적당한 배지를 인식할 것이다. 완충 성분을 갖거나 갖지 않는 상기 배지는 50 L 이상, 100 L 이상, 200 L 이상, 또는 400 L 이상의 부피를 갖는 배양과 같이 대규모 박테리아 배양을 위해서도 적합할 뿐만 아니라, 약 100 mL, 약 500 mL, 약 1000 mL, 약 2000 mL, 약 4000 mL 또는 그 이상의 부피를 갖는 출발 배지와 같은 출발 배지 중의 번식을 위하여도 적당하다. 그와 같은 대규모 배양은 전형적으로 발효기 내에서 수행될 것이다. 적절한 배지의 사용은 하기 실시예 1에 예시되어 있다.
배지의 초기 pH란 프로바이오틱 박테리아의 첨가 전의 배지의 pH이다. 바람직한 구현예에서, 배지의 초기 pH는 약 6.0 내지 7.0, 좋기로는 약 6.2 내지 6.6이다.
본 발명의 일 구현예에서, 배지는 좋기로는 프로바이오틱 박테리아의 번식 6시간, 적어도 8 시간, 적어도 10시간 후에, 더 좋기로는 프로바이오틱 박테리아의 번식 적어도 12시간 후에 pH 5.0 및 4.0 사이에 도달한다. 바람직한 특정의 구현예에서, 배지는 적어도 8시간 후에 5.0 및 4.0 사이의 pH에 도달한다.
프로바이오틱 박테리아는 발효 동안의 젖산 생성에 의하여 번식 동안 pH의 강하를 야기할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 배지는, 그것이 번식 동안 젖산의 형성에도 불구하고 pH를 안정하게 유지시킬 완충제제를 포함하지 않거나 또는 필수적으로 포함하지 않기 때문에, 이러한 pH 하강을 허용한다.
바람직하게, 프로바이오틱 박테리아는 25℃ 내지 43℃, 좋기로는 25℃ 내지 40℃, 더 좋기로는 30 내지 40 ℃, 및 가장 좋기로는 약 37℃의 온도에서 pH 안정화 없이 번식한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 락토바실러스 또는 비피도박테리아의 속에 속한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 락토바실러스 파라카제이 종에 속하는 것이다. 만일 락토바실러스 파라카제이가 사용된다면, 번식을 위한 온도는 좋기로는 37 또는 38℃이다.
특허 절차 목적 미생물 기탁의 국제적 인식에 대한 부다페스트 조약에 따라, 수탁번호 ATCC 55544하에, 1994년 1월 24일, 균주 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 CRL431 (strain Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CRL431; L. 카제이 431®)를 미국, VA 20110, 마나사스, Blvd 대학 10801의 미국 조직형 수집 센터(ATCC)에 기탁하였다. 잘 알려진 프로바이오틱 박테리아가 Probio-Tec® F-DVS L. 카제이-431® 식별번호 501749의 상품명 및 Probio-Tec® C-파우더-30, 식별번호 687018의 상품명 하에 Chr. 한센 에이/에스(덴마크 디케이-2970 호르솔름 보게 알레 10-12)사로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 더 더욱 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 수탁번호 ATCC55544하에 ATTC(American Tissue Type Collection)에 기탁된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 균주 CRL431 (L. 카제이 431®), 그의 돌연변이체 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
산에 적응된 프로바이오틱 박테리아를 수확하고 농축하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 박테리아의 수확은 배양 배지 상등액을 제거하기 위하여, 박테리아 배양액을 원심분리하는 것에 의하여 얻을 수 있다. 원심분리는 박테리아의 파괴를 피하기에 충분할 정도로 부드럽게 행해질 것이다. 원심분리에 의하여 세포를 수확하는 방법은 일반적으로 알려져 있으며, 2000 내지 6000 x g에서 2 내지 20분 동안 원심분리하는 것을 포함한다. 박테리아는 또한 여과법, 예컨대 십자류-여과 여과법과 같은, 박테리아 발효의 문맥에서 기술되어온 다른 기법에 의하여 수확될 수도 있다. 농축의 방법도 유사하게 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 박테리아의 농축은 원심분리와 그에 뒤따르는 더 작은 부피에 재현탁하는 것에 의하여, 동결 건조에 의하여, 또는 컬럼이나 필터를 통한 여과법에 의하여 얻어질 수도 있다.
일반적으로, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를, 약 1x104 내지 1x1010 CFU/ml의 양(초기 CFU/ml)으로, 더 좋기로는 약 1x105 내지 1x109 CFU/ml의 양으로, 보다 더 좋기로는 약 1x106 내지 1x108 CFU/ml의 양으로 사용하여 과일 음료를 접종시킨다.
놀랍게도, 프로바이오틱 박테리아의 생존능력은 상기 기술한 산성 환경에의 적응 이후에 특히 높으며, 4-10℃의 온도에서 수개월의 저장 시간 후에도 높게 유지될 것이다. 일 구현예에서 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주의 생존능력은 과일 음료 중 8℃의 온도에서 적어도 30일 동안 저장 후, 에컨대 8℃의 온도에서 적어도 42일의 저장 후, 8℃의 온도에서 적어도 70일의 저장 후, 초기 CFU/ml의 적어도 50%이다.
바람직한 구현예에서, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주의 생존능력은 전술한 저장 조건 하에서, 초기 CFU/ml의 적어도 60%, 좋기로는 초기 CFU/ml의 적어도 70%, 더 좋기로는 초기 CFU/ml의 적어도 80%이다.
생존한 세포 계수의 측정은 당업계의 표준 기법에 따라, 아가 플레이트 상의 콜로니 카운팅에 의한, 일련의 희석 중 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 정량하는 것이 의한다. 적절한 배지 및 배양 조건은 하기 실시예에 주어져 있다.
수확 및/또는 농축 후에, 산에 적응된 박테리아를 임의로 동결 또는 동결건조시킨다. 예를 들어, 프로바이오틱 박테리아는 약 -20℃, 좋기로는 약 -80℃, 또는 그 미만에서 동결될 수 있다. 동결 절차는 세포 손상을 피하기 위하여, 가능한 한 빠르게, 좋기로는 급속 동결(shock-freezing)에 의하여 수행하는 것이 바람직하다.
급속 동결은 예컨대 박테리아를 포함하는 용기를 액체 질소 중에 두어 수행될 수 있다. 따라서, 바람직한 특정 구현예에서, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아는 약 -196℃에서 급속 냉동된다. 동결 건조의 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 동결 건조 동안에, 물질을 동결시키고, 그 다음에 물질 중의 동결된 수분이 고체상으로부터 직접 기체상으로 승화되도록 주위 압력을 하강시킨다. 산에 적응된 박테리아를 동결 또는 급속 동결시킨 후에, 박테리아를 약 -20℃, 약 -55℃, 약 -80℃, 또는 -196℃의 액체 질소 중에 보관할 수 있다. 산에 적응된 박테리아를 약 -55℃에 보관하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 50 내지 1000 ml 또는 200 내지 1000 ml와 같이, 10 내지 5000 ml의 제품을 함유하는 밀봉된 포장 내에 프로바이오틱 과일 음료를 편리하게 포장할 수 있다.
제2의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 제1의 관점에 따른 방법에 의하여 얻어지는 프로바이오틱 과일 음료에 관한 것인데, 여기서 프로바이오틱 과일 음료는 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 포함한다.
일 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는, 8℃의 온도에서 적어도 30일의 저장 후에, 예컨대 8℃의 온도에서 적어도 42일의 저장 후에, 과일 음료 중에 약 1x104 내지 1x1010 CFU/ml의 양으로, 더 좋기로는 약 1x105 내지 1x109 CFU/ml의 양으로, 더 더욱 좋기로는 약 1x106 내지 1x108 CFU/ml의 양으로 존재한다.
생존 세포 계수의 측정은 당업계의 표준 기법에 따라, 아가 플레이트 상의 콜로니 계수에 의한, 일련의 희석 중의 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 정량하는 것에 의하여 행해진다. 적합한 배지 및 접종 조건은 하기 실시예에 주어져 있다.
제3의 관점에서, 본 발명은 pH의 안정화 없이 번식에 의하여 산에 적응된 프로바이오틱 균주의 배양물을 얻는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아는 약 6.0 및 약 7.0 사이의 초기 pH를 가지는 배지 중에서 pH 안정화 없이, 25℃ 내지 43℃의 온도에서, 더 좋기로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 번식하는데, 여기서 상기 배지는 적어도 8시간의 번식 후에, 배지가 약 5.0 및 약 4.0 사이의 pH에 도달하는 것을 허여하는 조성을 갖는 것이고, 그에 의하여 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아를 생산하는 것이다; 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아는 수확된다; 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아는 농축된다; 그리고 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아는 임의로 동결 또는 동결건조된다.
바람직한 일 구현예에서, 배지는 이스트 추출물 적어도 0.4%와 당 적어도 2%를 포함한다.
배지의 초기 pH는 프로바이오틱 박테리아를 첨가하기 전의 배지의 pH이다. 바람직한 구현예에서, 배지의 초기 pH는 약 6.2 내지 약 6.6이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 10시간의 번식 후, 좋기로는 프로바이오틱 박테리아의 적어도 12시간의 번식 후에, 배지는 약 5.0 및 약 4.0 사이의 pH에 도달한다.
바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 또는 비피도박테리움 속에 속한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 락토바실러스 파라카제이 종에 속한다.
본 발명의 더 더욱 바람직한 구현예에서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 수탁번호 ATCC55544하에 ATTC(American Tissue Type Collection)에 기탁된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 균주 CRL431 (L. 카제이 431®), 그의 돌연변이 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 제4의 관점은 본 발명의 제3의 관점에 따라 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아 균주의 배양물에 관한 것이다.
제5의 관점은 제4의 관점에 따른 배양물의 프로바이오틱 과일 음료의 생산을 위한 용되에 관한 것이다.
바람직한 일 구현예에서, 프로바이오틱 과일 음료는 최대 4.2의 pH를 갖는다.
다음의 비제한적인 실시예에 의하여 본 발명이 더 기술되어 진다.
실시예
실시예 1. 산 적응된 L. 카제이 431 ® 의 생산
동결시킨 스톡으로부터 얻은 L. 카제이 431® 1% (V/V)를 Difco(참조번호: 288110)에서 구입한 MRS 배지에 접종하였다. pH가 3.9 미만이 될 때까지 배양액을 37℃에서 밤새 배양하고, 사용할 때까지 5℃ 보관하였다. 밤새 배양한 이 배양액을 MRS 배지(Difco) 4 L (1%, V/V) 접종을 위하여 사용하고, pH가 3.9 미만이 될 때까지 37℃에서 밤새 배양하였으며, 사용할 때까지 5℃에서 보관하였다. 이 접종 전 단계는 발효를 위한 충분한 양의 접종원를 얻기 위하여 행하여졌다. 10℃에서 적절한 배지 400 L를 포함하는 생반응기에 사전-접종원의 전 부피를 접종하였다. 발효는 온도를 35℃까지 증가시키는 것에 의하여 발효를 개시하고, 탄수화물의 젖산 생산물로의 대사에 대한 지시자로서 pH의 감소를 관찰하였다. 이러한 pH의 하강 중에, 세포는 낮은 pH에 점차적으로 적응한다. 산 적응된 세포를 pH 5.0, 4.5 및 4.0에서 원심분리에 의하여 수확하였다. 발효 시간은 수확 시점에 의존하여 10 내지 17 시간이었다(도 1).
농축된 세포 덩어리는 즉시 액상 질소(-196℃) 중에서 동결시키고 사용할 때까지 -55℃에서 보관하였다.
실시예 2. 산 적응된 L. 카제이 431 ® 을 위한 수확 표준의 최적화
최대 수의 생존 세포를 얻기 위한 최적화된 수확 표준은 다음과 같이 결정하였다. 사전-접종원으로 생반응기를 접종하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 발효를 시작하였다. 접종 후 11시간(pH 4.5에 해당)부터 pH가 4.0 미만이 될 때까지 매 30분 마다, 발효물 시료를 채취하고, 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 측정하는 것에 의하여 생존도를 평가하였다(도 2). CFU는 MRS 아가 중의 적절한 10배 희석을 평판 도말하고, 37℃에서 3일 동안 혐기성 배양하는 것에 의하여 측정하였다.
세포 계수는 접종 후 12시간(pH 4.24에 해당)이 될 때까지 증가하였으며, 15는 발효 전과정에 걸쳐 일정한 레벨로 유지되었다. 이는 세포가 강건하여 심지어 pH가 4.0 미만으로 떨어지는 경우에도 생존한 채 남아 있음을 나타내는 것이다. pH < 4.0은 수행가능한 공정 시간 내에 산에 적응되고 생존한 세포의 충분한 양을 제공하는 최적의 수확 표준으로 결정되었다.
실시예 3. 산 적응된 L. 카제이 431 ® 을 첨가한 다양한 과실 음료의 생존 및 관능적 품질
실시예 1에 기술된 절차에 따라 생산한 L. 카제이 431®을 다음과 같은 성분으로 구성된 다양한 과일 기반 음료의 접종에 사용하였다:
딸기 및 바나나 주스 ( pH 3.75)
31% 딸기 퓨레
26% 바나나 퓨레
100%까지 포도 주스, 오렌지 주스, 망고 퓨레, 복숭아 퓨레 및 블루베리 푸레.
열대 주스 ( pH 3.88)
32% 파인애플 주스
32% 오렌지 주스
26% 바나나 퓨레
7% 망고 퓨레
3% 라임 주스
적과일 주스 ( pH 3.55)
16% 다른 종류의 적과일 (라즈베리 퓨레, 블랙커런트 주스, 블루베리 퓨레)
100%까지 포도 주스, 딸기 퓨레 및 바나나 퓨레.
프로바이오틱 배양의 F-DVS를 염수 펩톤 중에 희석하여, 다른 종류의 과일 주스의 곽(cartons)에 대하여 1% v/v의 접종원을 첨가함에 의하여, 5x107 또는 1x108 CFU/ml의 초기 세포수가 얻어지는 것을 확실히 하였다. pH 4.0 또는 pH 5.0에 적응된 L. 카제이 431®과 대조군으로서 적응되지 않은 L. 카제이 431®을 주스에 접종하였다. 관능 분석을 위한 대조군으로서, 동일한 부피의 염수 펩톤을 곽(cartons)에 접종하였다. 접종된 주스를 빛으로부터 보호하여 8℃에서 보관하였다. L. 카제이 431®의 세포 계수는 MRS 아가 중의 적절한 10배 희석물을 평판 도말하고, 37℃에서 3일간 혐기성 배양하는 것에 의하여 측정하였다. 보관 중에, 감각 평가인으로 훈련받은 3인의 패널에 의하여 관능평가를 수행하였다.
다른 주스 중의 L. 카제이 431®의 세포 계수는 도 3, 4 및 5에 나타내었다. 산 적응된 L. 카제이 431® 박테리아는 pH 3.5-3.9의 산성 환경 중에 적어도 30일 보관한 것에 의하여 영향을 받지 않은 반면에, 비적응된 L. 카제이 431® 박테리아는 과일 음료 중에서 1000배 더 낮은 생존능력을 가졌다. 30일간의 저장 기간 동안의 관능 평가결과, 동일한 부피의 염수 펩톤을 가한 동일한 과일 음료와 비교하여 L. 카제이 431®를 첨가한 과일 음료에 그 어떠한 관능적인 변화도 나타나지 아니하였다.
실시예 4. 3가지 다른 pH 값에 적응시킨 경우 오렌지 주스 중에서 L. 카제이 431 ® 의 생존
100% 오렌지 주스(pH 3.8)의 접종에 실시예 1에 기술된 바와 같은 절차에 따라 생산한 L. 카제이 431®를 사용하였다. 프로바이오틱 배양의 F-DVS를 염수 펩톤에 희석하여, 오렌지 주스 곽에 접종원 1% v/v를 첨가함에 의하여 1.5x108 CFU/ml의 초기 세포수가 확보되도록 하였다. pH 4.0, pH 4.5 또는 pH 5.0에 적응시킨 L. 카제이 431®또는 대조군으로서 비적응된 L. 카제이 431®를 사용하여 주스를 접종하였다. 주스를 빛으로부터 보호하여 8℃에서 42일간 보관하고, MRS 아가 내 적절한 10배 희석물을 붓고, 37℃에서 3일간 혐기성 배양하는 것에 의하는 세포 계수 산정을 위하여 정규적으로 시료를 채취하였다.
도 6에 기술된 바와 같이, 생산 동안에 pH 4.0, 4.5 또는 5.0에 적응시킨 경우 L. 카제이 431®의 세포 계수는 다소 일정한 반면에, 비적응된 L. 카제이 431®의 경우에는 현저한 세포 계수 감소가 관찰되었다.
실시예 5. 동결 저장 동안에 적응된 L. 카제이 431의 안정성.
실시예 1에 따라 생산한 L. 카제이 431®를 -50℃에서 동결된 펠렛 상태로 보관하고, 생존도를 위해 정기적으로 시험하였다. 세포 계수는 MRS 중의 적당한 10배 희석을 5 평판 도말하고, 그 다음 37℃에서 3일간 혐기성 배양하는 것에 의한 해동 배양에 의하여 측정하였다. 도 7에 기술된 바와 같이, 생산 동안에 pH 4.0, 4.5 또는 5.0에 적응시킨 L. 카제이 431®뿐만 아니라, 비 적응된 것의 세포 계수의 경우도 -50℃에서 보관된 경우 적어도 6개월 동안 매우 일정하였다.
본 발명을 실시하기 위하여 본 발명자들에게 알려진 최선의 방식을 포함하여, 본 발명의 바람직한 구현예가 본 명세서에 기술되어 있다. 이러한 바람직한 구현예의 변형은 전술한 기술 내용을 읽은 당업계의 숙련된 자에게 자명하게 될 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자들이 적절한 것으로서 그와 같은 변형을 채택할 것을 기대하며, 본원발명자들은 본원발명이 본 명세서에 특별히 기술된 바와 다르게 실시되어 질 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 법령에 의하여 허용되는 바와 같이 본 명세서에 첨부된 청구항에 인용된 사항의 모든 변형 및 동등물을 포함한다. 또한, 상술한 요소의 가능한 모든 변형 중의 임의의 조합은 문맥에 의할 때 명백하게 모순되는 것이거나 또는 본 명세서에 다르게 지시되지 않은 한 본 발명의 범위에 속한다.
실시예 6. 장기간의 동결 보관에 따른 주스 중의 L. 카제이 431 ® 의 생존
동결된 펠렛으로서 -50℃에서 6개월 저장 후에, 생산 중에 pH 4.0에 적응시킨 L. 카제이 431 배치에 대하여, 100%의 25 오렌지 주스 내 생존을 측정하였다. 프로바이오틱 배양의 F-DVS를 염수 펩톤 중에 희석시키어, 오렌지 주스 곽에 접종원 1% (v/v)를 첨가한 것에 의하여 얻어지는 초기 세포 계수가 108 CFU/ml가 되는 것을 확실하게 하였다. 대조군으로서, 100% 오렌지 주스의 다른 곽에, -50℃에서 6개월 동안 보관한 비적응시킨 L. 카제이 431®를 첨가하였다. 상기 주스를 빛으로부터 보호하여 8℃에 보관하고, MRS 아가 중의 적절한 10배 희석을 평판 도말하고, 그 다음 37℃에서 3일간 혐기성 배양하는 것에 의하여 결정되는 L. 카제이 431® 세포 계수 측정을 위하여 정기적으로 시료를 채취하였다.
도 8에 기술된 바와 같이, 생산 중에 pH 4.0에 적응시키고, -50℃에서 6개월간 보관한 다음, 6주간 오렌지 주스 중에서 차갑게 보관한 경우, L. 카제이 431® 의 세포 계수는 다소 일정하였다. 반면에, 비적응시킨 L. 카제이 431®의 경우는 -50℃에서 6개월 동안 보관하고, 오렌지 주스에 첨가한 경우 현저한 세포 계수의 감소가 관찰되었다. 이는 생산 중에 pH 4.0에 적응시킨 L. 카제이 431®의 오렌지 중의 좋은 생존이, 심지어 -50℃에서의 배양물의 장기 동결 보존 후에도 유지된다는 것을 보여준다.
실시예 7. 100% 오렌지 주스 중의 적응된 L. 카제이 431 ® 의 장기간 저장 안정성.
100 % 오렌지 주스(pH 3.8)의 접종에 실시예 1에 기술된 바와 같은 절차에 따라 생산한 L. 카제이 431®를 사용하였다. 프로바이오틱 배양의 F-DVS를 염수 펩톤 중에 희석하여, 과일 주스 곽에 1% v/v의 접종원을 첨가함에 의하여 얻어지는 초기 세포 계수가 대략 1e08 CFU/ml가 되도록 확실히 하였다. pH 4.0에 적응시킨 L. 카제이 431® 또는 비적응시킨 대조군 L. 카제이 431®로 주스를 접종하였다. 오렌지 주스를 빛으로부터 보호하여 8℃에서 70일간 보관하고, MRS 아가 내 적절힌 10배 희석을 평판 도말하고, 그 다음 37℃에서 3일간 혐기성 배양하는 것에 의한 세포 계수 측정을 위하여 정기적으로 시료를 채취하였다.
도 9에 기술된 바와 같이, 생산 중에 pH 4.0에 적응시키고, 10주까지의 기간 동안 오렌지 주스 중에 차갑게 저장한 경우, L. 카제이 431®의 세포 계수는 다소 일정하였다. 반면에, 비적응시킨 L. 카제이 431®의 경우는 오렌지 주스 중에 차갑게 저장시킨 경우 저장 3주 시점의 첫번째 시료부터 현저한 세포 계수의 감소가 관찰되었다. 이는 심지어 10주에 달하는 차가운 저장까지 오렌지 주스 중에서, pH 4.0에 적응시킨 L. 카제이 431®의 생존이 월등함을 나타낸다.
참조문헌
유럽특허 EP 0113055
미국특허출원 US 2010/0086646
PCT 특허출원 WO 2010/132017
본 특허 문헌에 인용된 모든 참조문헌은 인용에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 통합된다.

Claims (21)

  1. (a) 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 증식시키는 동안 산에 적응시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주로 과일 음료를 접종하는 단계; 및
    (c) 프로바이오틱 과일 음료를 포장하는 임의의 단계
    를 포함하는, 프로바이오틱 과일 음료를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 산에 적응시키는 단계는
    (i) 초기 pH가 약 6.0 내지 약 7.0이고, pH가 약 5.0 내지 약 4.0에 도달할 수 있게 하는 조성을 가진 적절한 배지 중에서, 25℃ 내지 43℃의 온도, 좋기로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서, pH 안정화 없이 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 증식시키는 단계;
    (ii) 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 수확하는 단계;
    (iii) 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 농축시키는 임의의 단계; 및
    (iv) 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를 동결 또는 동결 건조시키는 임의의 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 (i)에서 상기 배지는 적어도 당 2%와 이스트 추출물 0.4%를 포함하는 것인 방법.
  4. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (b)에서 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주를, 과일 음료 ml 당 약 1x104 내지 1x1010 CFU의 양(과일 음료 ml 당 초기 CFU)으로, 더 좋기로는 과일 음료 ml 당 약 1x105 내지 1x109 CFU의 양으로, 보다 더 좋기로는 과일 음료 ml 당 약 1x106 내지 1x108 CFU의 양으로 사용하여 과일 음료를 접종하는 것인 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아 적어도 1종의 균주의 생존능력은, 과일 음료 중에서 8℃에서 적어도 30일간의 저장 후에, 예컨대 8℃에서 적어도 42일간의 저장 후에, 8℃에서 적어도 70일간의 저장 후에, 과일 음료 ml 당 초기 CFU의 적어도 50%인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주의 생존능력은 과일 음료 ml 당 초기 CFU의 적어도 60%, 예컨대 과일 음료 ml 당 초기 CFU의 적어도 70%, 과일 음료 ml 당 초기 CFU의 적어도 80%인 것인 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로바이오틱 과일 음료의 pH의 범위는 3.2 내지 4.2, 예컨대 3.5 내지 3.9인 것인 방법.
  8. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 락토바실러스 및 비피도박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 종에 속하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는 수탁번호 ATCC55544하에 ATTC(American Tissue Type Collection)에 기탁된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 균주 CRL431 (L. 카제이 431®), 그의 돌연변이 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로바이오틱 과일 음료는 과일 주스 및/또는 과일 퓨레 20 내지 99.99 중량%를 포함하는 것인 방법.
  12. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 과일 음료는 딸기, 바나나, 포도, 오렌지, 사과, 망고, 복숭아, 블루베리, 파인애플, 라임, 라즈베리 및 블랙 커런트 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과일로부터 제조되는 것인 방법.
  13. 선행하는 항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의하여 얻어지는 프로바이오틱 과일 음료.
  14. 제13항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아의 적어도 1종의 균주는, 8℃에서 적어도 30일간의 저장 후에 과일 음료 중에 약 1x104 내지 1x1010 CFU/ml의 양으로, 더 좋기로는 약 1x105 내지 1x109 CFU/ml의 양으로, 보다 더 좋기로는 약 1x106 내지 1x108 CFU/ml의 양으로 존재하는 것인 프로바이오틱 과일 음료.
  15. (a) 초기 pH가 약 6.0 내지 약 7.0이고, pH가 약 5.0 내지 약 4.0에 도달할 수 있게 하는 조성을 가진 적절한 배지 중에서, 25℃ 내지 43℃의 온도, 좋기로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서, pH 안정화 없이 프로바이오틱 박테리아 균주를 증식시키는 단계;
    (b) 세포를 수확하는 단계;
    (c) 세포를 농축시키는 임의의 단계; 및
    (d) 세포를 동결 또는 동결 건조시키는 임의의 단계
    를 포함하는, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아 균주의 배양물을 취득하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 배지는 적어도 당 2% 및 이스트 추출물 0.4%를 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아 균주는 락토바실러스 또는 비피도박테리아 속에 속하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아 균주는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 종에 속하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아 균주는 수탁번호 ATCC55544하에 ATTC(American Tissue Type Collection)에 기탁된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이 균주 CRL431 (L. 카제이 431®), 그의 돌연변이 및 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의하여 얻어지는, 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아 균주의 배양물.
  21. 제20항에 따른 산에 적응된 프로바이오틱 박테리아 균주의 배양물의 프로바이오틱 과일 음료의 생산을 위한 용도.
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