WO2024111464A1 - ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法 - Google Patents
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Definitions
- the present invention relates to a method for improving the gastric and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei.
- probiotics have been proposed to include not only live bacteria but also dead bacteria.
- the mechanism of action of probiotics is that useful microorganisms grow in the intestinal flora and produce various metabolic products that eliminate competing harmful microorganisms or suppress their growth, making it possible for them to exert their function more effectively, so it is considered advantageous for them to exist in a live state in the intestines.
- digestive fluids such as gastric juice and bile contain various digestive enzymes in addition to gastric acid and bile acid, and when exposed to these digestive fluids, they will die, or even if they survive, they will lose their colony-forming ability (ability to grow), and will suffer serious damage.
- Patent Document 1 a method of enhancing the gastric acid and bile acid resistance of the microorganism itself by destroying the hrcA gene of the microorganism
- Patent Document 2 a method of encapsulating lactic acid bacteria in an enteric capsule to avoid direct contact with gastric fluids and improve survival
- Non-Patent Document 1 it has been reported that a simpler method, Lactobacillus lactis, can be cultured in a medium containing an excess of Tween 80 to improve its bile acid resistance.
- Non-Patent Document 1 when the present applicant applied this technology to Lacticaceae Bacillus paracasei, no improvement in bile acid resistance was observed, and it was confirmed that it was actually reduced.
- Patent Document 3 The applicant has discovered that resistance to gastric and bile acids can be improved by culturing lactic acid bacteria, including Lacticaceae Bacillus paracasei, in a medium containing oleic acid or a salt thereof, and has filed a patent application (Patent Document 3).
- the objective of the present invention is therefore to provide a new method for improving the resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei to gastric acid and bile acid.
- the present invention relates to a method for producing a lactic acid bacteria culture medium comprising inoculating a pre-culture solution of 10 7 to 10 9 cfu/ml of lactic acid bacteria at 0.01% by mass into a 10% by mass skim milk medium and culturing the medium in a 37° C. incubator. After 4 hours of incubation, the pH was 6.0-6.5. After 8 hours of incubation, the pH was 5.0-6.0. When the culture time was 12 hours, the pH was 4.5 to 5.5.
- the present invention relates to a method for improving the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei, the method being characterized by co-culturing Lacticaceae Bacillus paracasei with Lacticaceae Bacillus paracasei.
- the present invention also relates to a method for producing a culture medium containing 0.1 to 20% by mass of skim milk, the method comprising inoculating a preculture solution of Lacticaceae Bacillus paracasei; After 8 hours of incubation, the pH was 5.5 to 6.25. When the culture time was 16 hours, the pH was 4.25 to 5.5.
- the method for improving the gastric and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei is characterized in that the pH is adjusted to 4.0 to 4.75 after 24 hours of culture.
- the present invention relates to Lacticaceae Bacillus paracasei having improved gastric acid and bile acid resistance by the above-mentioned method for improving gastric acid and bile acid resistance.
- the resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei to gastric acid and bile acid can be improved.
- Lacticaceae Bacillus paracasei with improved resistance to gastric acid and bile acid obtained by the present invention, it becomes possible to deliver a large amount of live bacteria to the intestines, and to more effectively obtain the various efficacious effects that Lacticaceae Bacillus paracasei has previously possessed.
- FIG. 2 is a graph showing changes in pH with each culture time in Example 1.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of a gastric acid and bile acid continuous tolerance test in Example 1.
- FIG. 2 is a graph showing the survival rate in the gastric acid and bile acid continuous tolerance test in Example 1.
- FIG. 1 shows changes in pH with each culture time in Example 2.
- FIG. 1 shows the results of a gastric acid and bile acid continuous tolerance test in Example 3.
- FIG. 1 shows changes in pH with each culture time in Example 4.
- FIG. 1 shows the results of a gastric acid and bile acid continuous tolerance test in Example 4.
- FIG. 13 is a graph showing the survival rate in the gastric acid and bile acid continuous resistance test in Example 4.
- the method for improving the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei includes the following two methods.
- ⁇ Improvement method 1 of the present invention> When a 10% by mass skim milk medium was inoculated with a pre-culture solution of 10 7 to 10 9 cfu/ml of lactic acid bacteria at 0.01% by mass and incubated in a constant temperature bath at 37°C, After 4 hours of incubation, the pH was 6.0-6.5. After 8 hours of incubation, the pH was 5.0-6.0. When the culture time was 12 hours, the pH was 4.5 to 5.5.
- Lactic acid bacteria with a pH of 4.0 to 4.5 after 24 hours of culture A method for improving the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei, comprising co-culturing said Lacticaceae Bacillus paracasei with said Lacticaceae Bacillus paracasei.
- ⁇ Improvement method 2 of the present invention A preculture solution of Lacticaceae Bacillus paracasei is inoculated into a medium containing 0.1 to 20% by mass of skim milk; After 8 hours of incubation, the pH was 5.5 to 6.25. When the culture time was 16 hours, the pH was 4.25 to 5.5.
- a method for improving the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei comprising culturing the strain while adjusting the pH to 4.0 to 4.75 after 24 hours of culture.
- the lactic acid bacteria used in the present invention's improvement method 1 are, for example, inoculated with 0.01% by mass of a pre-cultured lactic acid bacteria solution into a 10% by mass skim milk medium and cultured in a thermostatic chamber at 37°C, and the pH becomes 6.0-6.5 after 4 hours of culture, 5.0-6.0, preferably 5.4-5.9, after 8 hours of culture, 4.5-5.5, preferably 4.6-5.2, after 12 hours of culture, and 4.0-4.5 after 24 hours of culture.
- These pH ranges for each culture time can be combined as appropriate.
- the skim milk medium contains 10% by mass of skim milk, and may contain, for example, ingredients used in normal lactic acid bacteria culture media, such as vitamins A, B vitamins, vitamin C, and vitamin E; salts such as calcium and magnesium; nitrogen sources such as meat extract, peptone, yeast extract, and amino acids; and carbon sources such as glucose, xylose, fructose, and maltose.
- ingredients used in normal lactic acid bacteria culture media such as vitamins A, B vitamins, vitamin C, and vitamin E
- salts such as calcium and magnesium
- nitrogen sources such as meat extract, peptone, yeast extract, and amino acids
- carbon sources such as glucose, xylose, fructose, and maltose.
- a pre-culture solution of 10 to 10 cfu/ml of lactic acid bacteria may be prepared by inoculating frozen lactic acid bacteria into a skim milk medium and allowing the bacteria to stand in a thermostatic bath at a temperature suitable for the growth of lactic acid bacteria (preferably 30 to 37°C) for 24 hours.
- the thermostatic bath used here is not particularly limited, and may be, for example, an incubator or a thermostatic water bath.
- "standing still” refers to leaving the mixture in a stationary state without stirring.
- the pH during culture may be measured at specified times using, for example, a pH meter.
- Such lactic acid bacteria include, for example, lactic acid bacteria of the genera Streptococcus, Lactococcus, Lacticaseibacillus, Lactipranchibacillus, Latilactobacillus, Rigilactobacillus, Rimosilactobacillus, Lentilactobacillus, and Leviractobacillus.
- lactic acid bacteria of the genera Streptococcus and Lactococcus are preferred.
- lactic acid bacteria of the genera Streptococcus and Lactococcus
- Streptococcus thermophilus and Lactococcus lactis are preferred, and Streptococcus thermophilus YIT 2001, Streptococcus thermophilus YIT 2021, and Lactococcus lactis YIT 2027 are more preferred.
- One or more of these lactic acid bacteria can be used.
- Streptococcus thermophilus YIT 2001 has been internationally deposited with the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Organism Depositary Center (Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818), which is the international depositary authority of the Budapest Treaty, as Streptococcus thermophilus YIT 2001 (FERM BP-7538, date of deposit: April 5, 2001).
- Streptococcus thermophilus YIT 2021 has been internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Organism Depositary Center as Streptococcus thermophilus YIT 2021 (FERM BP-7537, date of deposit: April 5, 2001).
- Lactococcus lactis YIT 2027 has been internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Organism Depositary as Lactococcus lactis YIT 2027 (FERM BP-6224, date of deposit: January 16, 1998).
- the Lacticaceibacillus paracasei to be co-cultured with the above-mentioned lactic acid bacteria is not particularly limited, but examples thereof include Lacticaceibacillus paracasei YIT 0209 (reference strain), Lacticaceibacillus paracasei YIT 9029 strain, Lacticaceibacillus paracasei YIT 0180, etc.
- Lacticaceibacillus paracasei may be used.
- Lacticaceibacillus paracasei Lacticaceibacillus paracasei YIT 9029 is preferred.
- Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 9029 has been internationally deposited as Lactobacillus casei YIT 9029 (FERM BP-1366, date of deposit: May 1, 1981) at the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Organism Depositary Center (Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818, Japan), which is the international depositary authority of the Budapest Treaty.
- Lacticaseibacillus paracasei YIT 9029 was previously classified as Lactobacillus casei, but in recent years the genus Lactobacillus has been reclassified as Lacticaseibacillus paracasei (Zheng et al., A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020 Apr; 70(4):2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107). In this specification, the classification of lactic acid bacteria is described using the new classification based on the above literature.
- Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 0209 is a type strain and can be obtained from ATCC etc.
- the method of mixed culturing the above-mentioned lactic acid bacteria and Lacticase Bacillus paracasei is not particularly limited, but an example thereof is a method in which the above-mentioned lactic acid bacteria are inoculated into a medium at 0.005 to 0.5 mass%, preferably 0.01 to 0.1 mass%, and Lacticase Bacillus paracasei is inoculated at 0.05 to 5 mass%, preferably 0.1 to 1 mass%, and the medium is cultured at 25 to 40°C, preferably 30 to 37°C, for 24 to 72 hours, preferably 40 to 50 hours.
- the culture may be static or shaking.
- the medium is not particularly limited, but may be, for example, a skim milk medium.
- the medium may also contain ingredients used in normal lactic acid bacteria medium, such as vitamins A, B vitamins, vitamin C, vitamin E, etc., salts such as calcium and magnesium, nitrogen sources such as meat extract, peptone, yeast extract, amino acids, and carbon sources such as glucose, xylose, fructose, maltose, etc.
- the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceobacillus paracasei is improved.
- the method for confirming the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceobacillus paracasei is not particularly limited, but examples thereof include a gastric acid and bile acid continuous test method using artificial gastric acid or artificial bile acid.
- the gastric acid and bile acid continuous test method can be performed, for example, by the method described in the Examples.
- Lacticaceae Bacillus paracasei with improved gastric acid and bile acid resistance described above has a survival rate that is 3 to 100 times higher after continuous gastric acid and bile acid testing than when the improvement method 1 of the present invention is not performed.
- a preculture solution of Lacticaceae Bacillus paracasei is inoculated into a medium containing 0.1 to 20% by mass of skim milk, and cultured for the following culture time while adjusting the pH to be within the following range.
- the culture may be left stationary in a thermostatic chamber at 37°C for 24 to 72 hours, preferably 40 to 50 hours.
- the method of adjusting the pH so that the pH is 5.5 to 6.25, preferably 5.6 to 6.2, when the culture time is 8 hours, 4.25 to 5.5, preferably 4.4 to 5.4, when the culture time is 16 hours, and 4.0 to 4.75 when the culture time is 24 hours is not particularly limited, and for example, the pH of the medium may be adjusted at a specified time with an acid such as lactic acid or hydrochloric acid, or an alkali such as sodium bicarbonate or sodium hydroxide. The pH may also be adjusted by simultaneously culturing a specific microorganism or by adjusting the culture temperature. These pH ranges for each culture time can be combined as appropriate.
- the Lacticaceae Bacillus paracasei used in the present invention improvement method 2 may be the same as that used in the present invention improvement method 1.
- the skim milk medium used in the present invention's improvement method 2 may be the same as that used in the present invention's improvement method 1.
- the thermostatic bath, the method for preparing the pre-cultured bacterial solution, the standing, and the measurement of pH may also be the same as those used in the present invention's improvement method 1.
- the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei is improved.
- the method for confirming the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceae Bacillus paracasei may be the same as the method used in the improvement method 1 of the present invention.
- lactic acid bacteria similar to those used in the present invention improvement method 1 may be used together with Lacticaceae Bacillus paracasei during cultivation, as long as it does not affect Lacticaceae Bacillus paracasei.
- the Lacticaceae Bacillus paracasei with improved gastric acid and bile acid resistance described above has, for example, a 3 to 19 times higher number of surviving bacteria and a 10 to 70 times higher survival rate after a continuous gastric acid and bile acid test, compared to a case where the improvement method 2 of the present invention is not performed.
- improved gastric acid and bile acid resistance refers to a survival rate that is 3 times or more higher after a continuous gastric acid and bile acid test.
- Lacticaceae Bacillus paracasei with improved resistance to gastric acid and bile acid can be obtained.
- This Lacticaceae Bacillus paracasei can be used in foods and beverages such as lactic acid bacteria drinks and fermented milk. This Lacticaceae Bacillus paracasei can also be used in the formulation of medicines, health foods, etc.
- a medium containing Lacticase Bacillus paracasei (and mixed cultured lactic acid bacteria, if necessary) after cultivation in the improvement method of the present invention can be produced in the same manner as food and beverage products using a medium containing conventionally known lactic acid bacteria.
- Lacticaceae Bacillus paracasei when used in a formulation, it can be produced in the same manner as a formulation using a conventionally known medium containing lactic acid bacteria by separating, purifying, and drying the medium containing Lacticaceae Bacillus paracasei (and mixed cultured lactic acid bacteria, if necessary) after cultivation in the improvement method of the present invention.
- Example 1 Mixed culture test: ⁇ Preparation of pre-cultured bacterial solution> The following preculture solutions (1) to (5) were prepared.
- Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 9029 and Lactococcus lactis YIT 2027 were inoculated into 10% by mass skim milk medium at 0.5% by mass and 0.01% by mass, respectively, and incubated in a thermostatic chamber at 37°C.
- ⁇ Gastric and bile acid continuous tolerance test> After 48 hours of incubation, the monoculture and mixed culture of (A) to (E) were subjected to a gastric acid and bile acid continuous resistance test.
- the gastric acid conditions were pH 4.0, 1 hour, and 37°C, and the subsequent bile acid conditions were pH 4.4, 0.3 mass% oxgall (bovine bile acid), 5 minutes, and 37°C.
- the bacterial liquid sampled before and after exposure to gastric acid was appropriately diluted with PBS and smeared on an LLV agar medium.
- Example 2 Monoculture test: In order to determine what kind of properties the strains have that significantly improve gastric and bile acid resistance when co-cultured with Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 9029, the strains used in the co-culture were cultured alone, and the pH was measured with a pH meter after 0, 4, 8, 12, 16, and 24 hours of culture. The culture was the same as in Example 1, except that all the strains were used alone. The results are shown in Figure 4.
- lactic acid bacteria to be co-cultured with Lacticaceobacillus paracasei YIT 9029 should preferably be Streptococcus thermophilus YIT 2001, Streptococcus thermophilus YIT 2021 or Lactococcus lactis YIT 2027, which have a pH of 6.0-6.5 after 4 hours of culture, a pH of 5.0-6.0 after 8 hours of culture, a pH of 4.5-5.5 after 12 hours of culture and a pH of 4.0-4.5 after 24 hours of culture.
- Streptococcus thermophilus YIT 2037 which did not improve the gastric acid and bile acid resistance of Lacticaceobacillus paracasei YIT 9029 when co-cultured with Lacticaceobacillus paracasei YIT 9029 in Example 1, did not have such properties.
- Example 3 Mixed culture test: ⁇ Preparation of pre-cultured bacterial solution> The following pre-cultured bacterial solutions (6) to (10) were prepared.
- Lactobacillus gasseri YIT 0168 Frozen and preserved Lactobacillus gasseri YIT 0168 was inoculated into a skim milk medium at 0.1% (v/v) and cultured aerobically for 48 hours at 37° C. Lactobacillus gasseri YIT 0168 was internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) International Patent Organism Depositary as Lactobacillus acidophilus YIT 0168 (FERM BP-7536, date of deposit: April 5, 2001), which is a former classification.
- NITE National Institute of Technology and Evaluation
- Lactobacillus helveticus YIT 0083 type strain
- Lactococcus lactis YIT 2027 were inoculated into 10% by mass skim milk medium at 0.5% by mass and 0.01% by mass, respectively, and incubated in a thermostatic chamber at 37°C.
- Lactobacillus gasseri YIT 0168 and Lactococcus lactis YIT 2027 were inoculated into 10% by mass skim milk medium at 0.5% by mass and 0.01% by mass, respectively, and incubated in a thermostatic chamber at 37°C.
- Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 0180 and Lactococcus lactis YIT 2027 were inoculated into 10% by mass skim milk medium at 0.5% by mass and 0.01% by mass, respectively, and incubated in a thermostatic chamber at 37°C.
- Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 0209 type strain
- Lactococcus lactis YIT 2027 were inoculated into 10% by mass skim milk medium at 0.5% by mass and 0.01% by mass, respectively, and incubated in a thermostatic chamber at 37°C.
- Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 9029 and Lactococcus lactis YIT 2027 were inoculated into a 10% by mass skim milk medium at 0.5% by mass and 0.01% by mass, respectively, and incubated in a thermostatic chamber at 37°C.
- Example 4 pH Controlled Culture Test Using a culture apparatus equipped with a pH control device (Bio Jr. 8, Biot Co., Ltd.), in the same manner as in Example 1, the pH during monoculture of Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 9029 was adjusted with lactic acid to pH 5.5 to 6.25 after 8 hours of culture, pH 4.25 to 5.5 after 16 hours of culture, and pH 4.0 to 4.75 after 24 hours of culture, in accordance with the behavior of pH during mixed culture of Lacticaceae Bacillus paracasei YIT 9029 and Lactococcus lactis YIT 2027. The results are shown in FIG. 6.
- a gastric acid and bile acid continuous resistance test was performed in the same manner as in Example 1, and the number of surviving bacteria and the survival rate were calculated before the gastric acid reaction, after the gastric acid reaction, and after the bile acid reaction. The same test was repeated three times, and the results are shown in Figures 7 and 8.
- the bile acid conditions were pH 4.4, 1.0% oxgol by mass, 5 minutes, and 37°C.
- Lacticaceae Bacillus paracasei with improved resistance to gastric acid and bile acid obtained by this invention it becomes possible to deliver large amounts of live bacteria to the intestines, and this can be used to promote health.
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Abstract
１０質量％スキムミルク培地に乳酸菌の前培養菌液を０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した場合に、 培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、 培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、 培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、 培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となる乳酸菌と、 ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法またはスキムミルクを０．１～２０質量％含有する培地に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの前培養菌液を接種し、 培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、 培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、 培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整して培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸、胆汁酸の耐性を向上する新たな方法である。
Description
本発明は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法に関する。
近年、プロバイオティクスとして、腸内細菌叢のバランスを改善し、宿主の健康に有益な作用をもたらす微生物が注目されている。このような微生物として乳酸菌やビフィズス菌が利用されており、これらを摂取することで、便秘・下痢症の改善効果、免疫機能改善による感染防御・アレルギー抑制効果、動脈硬化の予防効果など様々な生理効果を得られることが報告されている。
プロバイオティクスの定義に関しては、近年、生菌だけでなく死菌を含める考え方も提唱されている。しかし、プロバイオティクスの作用機序として、腸内細菌叢において有用な微生物が増殖し、様々な代謝産物を産生することによって、競合する有害な微生物を排除したり、増殖を抑制したりすることで、その機能がより効果的に発揮され得るといえることから、腸内において生きた状態で存在している方が有利と考えられる。このように、摂取された有用微生物は、生きたままの状態で腸内に到達することが望まれるが、腸内に到達するまでには、温度、ｐＨ、酸素など、微生物の生育を阻害する様々な因子が存在し、特に胃液や胆汁などの消化液は、胃酸や胆汁酸の他、様々な消化酵素を含み、これらの消化液に曝されると、死滅したり、生き残ったとしてもコロニー形成能（増殖能）を喪失したりするなど重大な傷害を受ける。
そのため、有用微生物を消化液から保護し、消化管内での生残性を向上させる技術が検討されている。例えば、微生物のhrcA遺伝子を破壊することにより、微生物自体の胃酸・胆汁酸耐性を増強する方法（特許文献１）や、乳酸菌を腸溶性カプセル内に封入し、胃液などとの直接的な接触を回避して生残性を高める方法（特許文献２）などが開示されている。しかし、前者は煩雑な遺伝子工学的手法を要するものであり、後者は剤型に制約が生じるなど、これらの技術は汎用性が高いものとは言い難かった。一方、より簡便な方法として、ラクトバチルス・ラクチスを、Tween 80を過剰添加した培地で培養することにより、その胆汁酸耐性が向上することが報告されている（非特許文献１）。しかし、本出願人が、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイにこの技術を適用したところ、胆汁酸耐性の向上は認められず、むしろ低下してしまうことが確認された。
そこで、本出願人は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイを含む乳酸菌をオレイン酸又はその塩を含有する培地で培養することにより、胃酸胆汁酸耐性が向上することを見出し、特許出願している（特許文献３）。
しかしながら、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイを含む乳酸菌の胃酸胆汁酸耐性の向上の技術は、生菌を取り扱う多種多様な飲食品に関わる技術であることから、多種多様な技術があった方がよいことも明らかである。
Kimoto H, Ohmomo S, Okamoto T. Enhancement of bile tolerance in lactococci by Tween 80. J Appl Microbiol. (2002) 92, 41-46.
従って、本発明の課題は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸、胆汁酸の耐性を向上する新たな方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイと乳酸菌を混合培養するにあたり、乳酸菌として特定の経過時間におけるｐＨが特定の範囲になる乳酸菌を用いることにより、上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイを培養するにあたり、特定の経過時間におけるｐＨを特定の範囲になるように調整することにより、上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、１０質量％スキムミルク培地に１０７～１０９ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌の前培養菌液を０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した場合に、
培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、
培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となる乳酸菌と、
ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法である。
培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、
培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となる乳酸菌と、
ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法である。
また、本発明は、スキムミルクを０．１～２０質量％含有する培地に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの前培養菌液を接種し、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、
培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整して培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法である。
培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、
培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整して培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法である。
更に、本発明は、上記胃酸胆汁酸耐性向上方法により胃酸胆汁酸耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイである。
本発明によれば、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸、胆汁酸の耐性を向上することができる。
従って、本発明により得られる胃酸、胆汁酸の耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイを利用すれば、生菌を腸まで多く届けられるようになり、これまでラクチカゼイバチルス・パラカゼイが有している種々の効能についてもより強く得ることができる。
本発明のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法（以下、「本発明向上方法」という）としては、以下の二つの方法が挙げられる。
＜本発明向上方法１＞
１０質量％スキムミルク培地に１０７～１０９ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌の前培養菌液を０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した場合に、
培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、
培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となる乳酸菌と、
ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
＜本発明向上方法１＞
１０質量％スキムミルク培地に１０７～１０９ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌の前培養菌液を０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した場合に、
培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、
培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となる乳酸菌と、
ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
＜本発明向上方法２＞
スキムミルクを０．１～２０質量％含有する培地に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの前培養菌液を接種し、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、
培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整して培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
スキムミルクを０．１～２０質量％含有する培地に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの前培養菌液を接種し、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、
培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整して培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
まず、本発明向上方法１について説明する。本発明向上方法１に用いられる、乳酸菌は、例えば、１０質量％スキムミルク培地に乳酸菌の前培養菌液を０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養し、培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、好ましくはｐＨ５．４～５．９、培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、好ましくはｐＨ４．６～５．２、培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となるものである。これら各培養時間におけるｐＨの範囲は適宜組み合わせることができる。
上記スキムミルク培地には、１０質量％のスキムミルクを含む他、例えば、通常の乳酸菌培地に使用される成分を添加してもよく、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類やカルシウム、マグネシウム等の塩類、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸等の窒素源、グルコース、キシロース、フルクトース、マルトース等の炭素源等を含んでいてもよい。
また、１０７～１０９ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌の前培養菌液は、凍結保存された乳酸菌をスキムミルク培地に接種して恒温槽で乳酸菌の生育に適した温度（好ましくは３０～３７℃）で２４時間静置培養するようにして調製すればよい。ここで用いられる恒温槽は特に限定されず、例えば、インキュベーターや恒温水槽等を用いればよい。ここで静置とは、撹拌を行わず静止した状態で置くことをいう。培養時におけるｐＨの測定は、例えば、ｐＨメーター等で規定の時間に測定すればよい。
このような乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ラクチカゼイバチルス属、ラクチプランチバチルス属、ラチラクトバチルス属、リギラクトバチルス属、リモシラクトバチルス属、レンチラクトバチルス属、レビラクトバチルス属等の乳酸菌が挙げられる。これらの乳酸菌の中でもストレプトコッカス属、ラクトコッカス属の乳酸菌が好ましい。これらのストレプトコッカス属、ラクトコッカス属の乳酸菌の中でもストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクチスが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2001、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2021、ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027がより好ましい。これら乳酸菌は１種または２種以上を用いることができる。
上記した乳酸菌のうち、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2001は、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2001（ＦＥＲＭ ＢＰ－７５３８、受託日：２００１年４月５日）としてブダペスト条約の国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室）に国際寄託されている。
また、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2021は、ストレプトコッカス・サーモフィルス YIT 2021（ＦＥＲＭ ＢＰ－７５３７、受託日：２００１年４月５日）として上記した独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに国際寄託されている。
更に、ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027は、ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027（ＦＥＲＭ ＢＰ－６２２４、受託日：１９９８年１月１６日）として上記した独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに国際寄託されている。
本発明向上方法１において、上記した乳酸菌と混合培養されるラクチカゼイバチルス・パラカゼイは、特に限定されないが、例えば、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 0209（基準株）、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 9029株、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 0180等が挙げられる。これらラクチカゼイバチルス・パラカゼイは１種または２種以上を用いることができる。これらラクチカゼイバチルス・パラカゼイの中でもラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029が好ましい。
上記したラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029は、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６、受託日：昭和５６年５月１日）としてブダペスト条約の国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室）に国際寄託されている。なお、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 9029は以前の分類ではラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）とされていたが、近年ラクトバチルス属の再分類がなされ、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei）に分類された（Zheng et al., A taxonomic note on the genus Lactobacillus : Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020 Apr; 70(4):2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107）。本明細書では、乳酸菌の分類について、上記文献に基づいて分類された新分類で表記している。
上記したラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0209は基準株なので、ＡＴＣＣ等から入手できる。
本発明向上方法１において、上記した乳酸菌と、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養する方法は、特に限定されないが、例えば、培地に上記した乳酸菌を０．００５～０．５質量％、好ましくは０．０１～０．１質量％、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイを０．０５～５質量％、好ましくは０．１～１質量％で接種し、これを２５～４０℃、好ましくは３０～３７℃で、２４～７２時間、好ましくは４０～５０時間培養する方法が挙げられる。培養は、静置、振盪であってもよい。
上記培地としては、特に限定されないが、例えば、スキムミルク培地である。また、培地には通常の乳酸菌培地に使用される成分を添加してもよく、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類やカルシウム、マグネシウム等の塩類、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸等の窒素源、グルコース、キシロース、フルクトース、マルトース等の炭素源等の成分を含んでいてもよい。
上記のようにして乳酸菌と、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することにより、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性が向上する。ここでラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸、胆汁酸の耐性を確認する方法は、特に限定されないが、例えば、人工胃酸や人工胆汁酸を用いる胃酸胆汁酸連続試験方法等が挙げられる。胃酸胆汁酸連続試験方法は、例えば、実施例に記載の方法で行うことができる。
また、上記した胃酸胆汁酸耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイは、例えば、本発明向上方法１を行わない場合と比較して、胃酸胆汁酸連続試験後の生残率が３～１００倍となる。
次に、本発明向上方法２について説明する。本発明向上方法２においては、スキムミルクを０．１～２０質量％含有する培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイの前培養液を接種し、下記培養時間で下記範囲になるようにｐＨを調整しながら培養する。培養条件は特に限定されないが、例えば、３７℃の恒温槽に静置して２４～７２時間、好ましくは４０～５０時間培養すればよい。
上記培養において、培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、好ましくはｐＨ５．６～６．２、培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、好ましくはｐＨ４．４～５．４、培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整する方法は、特に限定されず、例えば、規定の時間に培地のｐＨを乳酸、塩酸等の酸や、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリで調整すればよい。また、特定の微生物等を同時に培養することや、培養温度を調整することでｐＨを調整しても良い。これら各培養時間におけるｐＨの範囲は適宜組み合わせることができる。
本発明向上方法２において用いられるラクチカゼイバチルス・パラカゼイは本発明向上方法１で用いられるものと同様でよい。
本発明向上方法２に用いられるスキムミルク培地は、本発明向上方法１で用いられるものと同様でよい。また、恒温槽、前培養菌液の調製方法、静置、ｐＨの測定についても本発明向上方法１で用いられるものと同様でよい。
上記のようにして、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの培養をｐＨの調整をしながら行うことにより、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性が向上する。ここでラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸、胆汁酸の耐性を確認する方法は、本発明向上方法１で用いられる方法と同様でよい。
なお、本発明向上方法２において、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに影響を及ぼさない範囲で、培養の際に、本発明向上方法１で用いる乳酸菌と同様の乳酸菌をラクチカゼイバチルス・パラカゼイと共に用いてもよい。
また、上記した胃酸胆汁酸耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイは、例えば、本発明向上方法２を行わない場合と比較して、胃酸胆汁酸連続試験後の生残菌数が３～１９倍、生残率が１０～７０倍高くなる。ここで、胃酸胆汁酸耐性が向上したとは、胃酸胆汁酸連続試験後の生残率が３倍以上となることを指す。
以上説明した本発明向上方法によれば、胃酸、胆汁酸の耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイが得られる。
このラクチカゼイバチルス・パラカゼイは、乳酸菌飲料、発酵乳等の飲食品に利用することができる。また、このラクチカゼイバチルス・パラカゼイは医薬品、健康食品等の製剤にも利用することができる。
具体的に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイを飲食品に利用する場合、本発明向上方法において培養後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（および必要により混合培養した乳酸菌）を含む培地を、従来公知の乳酸菌を含む培地を利用した飲食品と同様に製造すればよい。
また、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイを製剤に利用する場合、本発明向上方法において培養後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（および必要により混合培養した乳酸菌）を含む培地から、必要により分離・精製・乾燥を行って、従来公知の乳酸菌を含む培地を利用した製剤と同様に製造すればよい。
このような飲食品や製剤は、これに含まれる胃酸胆汁酸耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイを含むため、従来のラクチカゼイバチルス・パラカゼイを含む飲食品や製剤よりも効果が高いものとなる。効果としては、便通改善、ＮＫ細胞の活性化、睡眠の質の向上などがある。
以下、本発明を本発明の実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実 施 例 １
混合培養試験：
＜前培養菌液の調製＞
以下の（１）～（５）の前培養菌液を調製した。
混合培養試験：
＜前培養菌液の調製＞
以下の（１）～（５）の前培養菌液を調製した。
（１）ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
（２）ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001の前培養菌液の調製
凍結保存されたストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した。
凍結保存されたストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した。
（３）ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021の前培養菌液の調製
凍結保存されたストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した。
凍結保存されたストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した。
（４）ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2037（基準株）の前培養菌液の調製
凍結保存されたストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2037（基準株）をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した。
凍結保存されたストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2037（基準株）をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した。
（５）ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３０℃で好気的に２４時間培養した。
凍結保存されたラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３０℃で好気的に２４時間培養した。
＜混合培養＞
以下の（Ａ）の単独培養、（Ｂ）～（Ｅ）の混合培養を行い、培養０、８、１２、１６、２４、４８時間後のｐＨを均一になるまで撹拌した菌液にポータブルｐＨメーターを浸漬することで測定した。それらの結果を図１に示した。
以下の（Ａ）の単独培養、（Ｂ）～（Ｅ）の混合培養を行い、培養０、８、１２、１６、２４、４８時間後のｐＨを均一になるまで撹拌した菌液にポータブルｐＨメーターを浸漬することで測定した。それらの結果を図１に示した。
（Ａ）（１）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029を０．５質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｂ）（１）および（２）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029およびストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｃ）（１）および（３）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029およびストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｄ）（１）および（４）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029およびストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2037（基準株）をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｅ）（１）および（５）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029およびラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
＜胃酸胆汁酸連続耐性試験＞
（Ａ）～（Ｅ）の単独培養および混合培養について４８時間の培養後、胃酸胆汁酸連続耐性試験を行った。胃酸の条件はｐＨ４．０、１時間、３７℃であり、その後の胆汁酸の条件はｐＨ４．４、オックスゴール（牛の胆汁酸）０．３質量％、５分、３７℃である。胃酸暴露前および胆汁酸暴露後にサンプリングした菌液を適宜ＰＢＳで希釈し、ＬＬＶ寒天培地に塗抹した。３７℃で好気的に２～３日培養してコロニーを計測し、菌液中の生菌数（ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍｌ）および生残率（％）を測定した。生残率（％）は胃酸曝露後および胆汁酸曝露後の生菌数を胃酸暴露前の生菌数で除することで算出した。同様の試験を４回繰り返し、それらの結果を図２および図３に示した。
（Ａ）～（Ｅ）の単独培養および混合培養について４８時間の培養後、胃酸胆汁酸連続耐性試験を行った。胃酸の条件はｐＨ４．０、１時間、３７℃であり、その後の胆汁酸の条件はｐＨ４．４、オックスゴール（牛の胆汁酸）０．３質量％、５分、３７℃である。胃酸暴露前および胆汁酸暴露後にサンプリングした菌液を適宜ＰＢＳで希釈し、ＬＬＶ寒天培地に塗抹した。３７℃で好気的に２～３日培養してコロニーを計測し、菌液中の生菌数（ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍｌ）および生残率（％）を測定した。生残率（％）は胃酸曝露後および胆汁酸曝露後の生菌数を胃酸暴露前の生菌数で除することで算出した。同様の試験を４回繰り返し、それらの結果を図２および図３に示した。
＜結果＞
これらの結果から、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021またはラクトコッカス・ラクチスYIT 2027と混合培養することにより胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上することが分かった。
これらの結果から、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021またはラクトコッカス・ラクチスYIT 2027と混合培養することにより胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上することが分かった。
実 施 例 ２
単独培養試験：
どのような性質を有する菌株がラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と混合培養した時に胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上するかを判断するために、混合培養に用いた菌株を単独培養し、培養０、４、８、１２、１６、２４時間後のｐＨをｐＨメーターで測定した。なお、培養は菌株を全て単独で用いる以外は全て実施例１と同様である。それらの結果を図４に示した。
単独培養試験：
どのような性質を有する菌株がラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と混合培養した時に胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上するかを判断するために、混合培養に用いた菌株を単独培養し、培養０、４、８、１２、１６、２４時間後のｐＨをｐＨメーターで測定した。なお、培養は菌株を全て単独で用いる以外は全て実施例１と同様である。それらの結果を図４に示した。
この結果から、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と混合培養する乳酸菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2001、ストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2021またはラクトコッカス・ラクチスYIT 2027のように培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となるものがよいことが分かった。一方、実施例１でラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と混合培養してもラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029の胃酸胆汁酸耐性が向上しなかったストレプトコッカス・サーモフィルスYIT 2037は、このような性質ではなかった。
実 施 例 ３
混合培養試験：
＜前培養菌液の調製＞
以下の（６）～（１０）の前培養菌液の調製を調製した。
混合培養試験：
＜前培養菌液の調製＞
以下の（６）～（１０）の前培養菌液の調製を調製した。
（６）ラクトバチルス・ヘルベティカスYIT 0083（基準株）の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクトバチルス・ヘルベティカスYIT 0083（基準株）をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
凍結保存されたラクトバチルス・ヘルベティカスYIT 0083（基準株）をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
（７）ラクトバチルス・ガセリYIT 0168の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクトバチルス・ガセリYIT 0168をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。なお、ラクトバチルス・ガセリYIT 0168は、旧分類であるラクトバチルス・アシドフィルスYIT 0168（ＦＥＲＭ ＢＰ－７５３６、受託日：２００１年４月５日）として上記した独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに国際寄託されている。
凍結保存されたラクトバチルス・ガセリYIT 0168をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。なお、ラクトバチルス・ガセリYIT 0168は、旧分類であるラクトバチルス・アシドフィルスYIT 0168（ＦＥＲＭ ＢＰ－７５３６、受託日：２００１年４月５日）として上記した独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに国際寄託されている。
（８）ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0180の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0180をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0180をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
（９）ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0209（基準株）の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0209（基準株）をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0209（基準株）をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
（１０）ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に４８時間培養した。
（１１）ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027の前培養菌液の調製
凍結保存されたラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３０℃で好気的に２４時間培養した。
凍結保存されたラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をスキムミルク培地に０．１％（ｖ／ｖ）接種して３０℃で好気的に２４時間培養した。
＜混合培養＞
以下の（Ｆ）～（Ｊ）の混合培養および同じ条件でそれぞれの菌株の単独培養を行った。
以下の（Ｆ）～（Ｊ）の混合培養および同じ条件でそれぞれの菌株の単独培養を行った。
（Ｆ）（６）および（１１）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクトバチルス・ヘルベティカスYIT 0083（基準株）およびラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｇ）（７）および（１１）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクトバチルス・ガセリYIT 0168およびラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｈ）（８）および（１１）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0180およびラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｉ）（９）および（１１）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 0209（基準株）およびラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
（Ｊ）（１０）および（１１）で調製した前培養菌液を用いて１０質量％スキムミルク培地にラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029およびラクトコッカス・ラクチスYIT 2027をそれぞれ０．５質量％、０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した。
＜胃酸胆汁酸連続耐性試験＞
（Ｆ）～（Ｊ）の混合培養および単独培養について４８時間の培養後、選択培地以外は実施例１と同様にして胃酸胆汁酸連続耐性試験を行い、生残率（％）を算出した。生残率（％）は胃酸曝露後および胆汁酸曝露後の生菌数を胃酸暴露前の生菌数で除することで算出した。（Ｆ）と（Ｇ）では選択培地としてテトラサイクリンを０．５ μｇ／ｍｌ含有するＭＲＳ寒天培地を使用し、（Ｈ）～（Ｊ）ではバンコマイシンを１０μｇ／ｍｌ含有するＭＲＳ寒天培地を使用した。同様の試験を４～５回繰り返し、それらの結果を図５に示した。なお、ラクトバチルス・ヘルベティカスYIT 0083（基準株）の生残率を評価する際には胆汁酸の条件をｐＨ４．４、オックスゴール０．１５質量％、５分、３７℃とした。
（Ｆ）～（Ｊ）の混合培養および単独培養について４８時間の培養後、選択培地以外は実施例１と同様にして胃酸胆汁酸連続耐性試験を行い、生残率（％）を算出した。生残率（％）は胃酸曝露後および胆汁酸曝露後の生菌数を胃酸暴露前の生菌数で除することで算出した。（Ｆ）と（Ｇ）では選択培地としてテトラサイクリンを０．５ μｇ／ｍｌ含有するＭＲＳ寒天培地を使用し、（Ｈ）～（Ｊ）ではバンコマイシンを１０μｇ／ｍｌ含有するＭＲＳ寒天培地を使用した。同様の試験を４～５回繰り返し、それらの結果を図５に示した。なお、ラクトバチルス・ヘルベティカスYIT 0083（基準株）の生残率を評価する際には胆汁酸の条件をｐＨ４．４、オックスゴール０．１５質量％、５分、３７℃とした。
＜結果＞
これらの結果から、ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027と、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0180、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0209（基準株）またはラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と混合培養することにより胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上することが分かった。一方、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属さないラクトバチルス・ヘルベティカスやラクトバチルス・ガセリはラクトコッカス・ラクチスYIT 2027と混合培養しても胃酸胆汁酸耐性が向上することはなかった。
これらの結果から、ラクトコッカス・ラクチスYIT 2027と、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0180、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 0209（基準株）またはラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029と混合培養することにより胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上することが分かった。一方、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属さないラクトバチルス・ヘルベティカスやラクトバチルス・ガセリはラクトコッカス・ラクチスYIT 2027と混合培養しても胃酸胆汁酸耐性が向上することはなかった。
実 施 例 ４
ｐＨ制御培養試験：
ｐＨ制御装置を備えた培養装置（Ｂｉｏ Ｊｒ．８、（株）バイオット製）を用いて実施例１と同様にし、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029とラクトコッカス・ラクチスYIT 2027とを混合培養した際のｐＨの挙動にあわせて、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029の単独培養の時のｐＨを培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるように乳酸で調整した。その結果を図６に示した。
ｐＨ制御培養試験：
ｐＨ制御装置を備えた培養装置（Ｂｉｏ Ｊｒ．８、（株）バイオット製）を用いて実施例１と同様にし、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029とラクトコッカス・ラクチスYIT 2027とを混合培養した際のｐＨの挙動にあわせて、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029の単独培養の時のｐＨを培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるように乳酸で調整した。その結果を図６に示した。
４８時間の培養後、実施例１と同様にして、胃酸胆汁酸連続耐性試験を行い、胃酸反応前、胃酸反応後、胆汁酸反応後の生残菌数および生残率を算出した。同様の試験を３回繰り返し、それらの結果を図７および図８に示した。なお、胆汁酸の条件をｐＨ４．４、オックスゴール１．０質量％、５分、３７℃とした。
この結果から、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029を単独で培養する時に、培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるように調整することでも、実施例１のような混合培養と同様に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイYIT 9029の胃酸胆汁酸耐性が顕著に向上することが分かった。
本発明により得られる胃酸、胆汁酸の耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイを利用すれば、生菌を腸まで多く届けられるようになり、健康の増進に利用することができる。
Claims (6)
- １０質量％スキムミルク培地に１０７～１０９ｃｆｕ／ｍｌの乳酸菌の前培養菌液を０．０１質量％接種し、３７℃の恒温槽に静置して培養した場合に、
培養時間が４時間の時にｐＨ６．０～６．５、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．０～６．０、
培養時間が１２時間の時にｐＨ４．５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．５となる乳酸菌と、
ラクチカゼイバチルス・パラカゼイとを混合培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。 - 乳酸菌が、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクチスからなる群から選ばれる１種または２種である請求項１記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
- ラクチカゼイバチルス・パラカゼイが、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 9029（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）である請求項１記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
- スキムミルクを０．１～２０質量％含有する培地に、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの前培養菌液を接種し、
培養時間が８時間の時にｐＨ５．５～６．２５、
培養時間が１６時間の時にｐＨ４．２５～５．５、
培養時間が２４時間の時にｐＨ４．０～４．７５となるようにｐＨを調整して培養することを特徴とするラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。 - ラクチカゼイバチルス・パラカゼイが、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ YIT 9029（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）である請求項４記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃酸胆汁酸耐性向上方法。
- 請求項１～５の何れか１項に記載の胃酸胆汁酸耐性向上方法により胃酸胆汁酸耐性が向上したラクチカゼイバチルス・パラカゼイ。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2017006138A (ja) * | 2011-01-21 | 2017-01-12 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | プロバイオティクス果実飲料 |
| WO2021256476A1 (ja) * | 2020-06-17 | 2021-12-23 | 株式会社ヤクルト本社 | 乳酸菌の胃液・胆汁耐性向上方法 |
-
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2017006138A (ja) * | 2011-01-21 | 2017-01-12 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | プロバイオティクス果実飲料 |
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|---|
| KANEKO TSUTOMU: "Adaptability of Lactic Acid Bacteria to Unusual Environment)", JAPANESE JOURNAL OF DAIRY AND FOOD SCIENCE, vol. 43, 1 January 1994 (1994-01-01), pages A25 - A34, XP093173035 * |
| KIMOTO, H. et al., Enhancement bile tolerance in lactococci by Tween 80, Journal of Applied Microbiology, 2002, vol. 92, pp. 41-46 * |
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