WO2021256476A1 - 乳酸菌の胃液・胆汁耐性向上方法 - Google Patents

乳酸菌の胃液・胆汁耐性向上方法 Download PDF

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bile
paracasei
acid bacteria
lacticasei
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博 牧野
健介 清水
康介 小穴
憲司 大石
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株式会社ヤクルト本社
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    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving resistance to gastric fluid and bile of lactic acid bacteria, and more particularly to a method of imparting or enhancing resistance of lactic acid bacteria to gastric acid, bile acid, etc., and allowing the lactic acid bacteria to reach the intestine alive after ingestion.
  • probiotics in recent years, the idea of including not only live bacteria but also dead bacteria has been proposed.
  • the mechanism of action of probiotics is to eliminate competing harmful microorganisms or suppress their growth by proliferating useful microorganisms in the intestinal flora and producing various metabolites. Therefore, it can be said that the function can be exerted more effectively, and it is considered that it is advantageous to exist in a living state in the intestine. In this way, it is desirable that the ingested useful microorganisms reach the intestine in a living state, but by the time they reach the intestines, they inhibit the growth of microorganisms such as temperature, pH, and oxygen.
  • digestive juices such as gastric acid and bile
  • various digestive enzymes in addition to gastric acid and bile acids
  • Serious injury such as loss of forming ability (proliferative ability).
  • Patent Document 1 a method of enhancing the gastric acid / bile acid resistance of the microorganism itself by disrupting the hrcA gene of the microorganism (Patent Document 1), or encapsulating lactic acid bacteria in an enteric capsule to directly contact with gastric fluid or the like.
  • Patent Document 2 A method of avoiding the problem and increasing the survivability (see Patent Document 2) and the like are disclosed.
  • the former requires complicated genetic engineering techniques, and the latter has restrictions on the dosage form, so it is difficult to say that these techniques are highly versatile.
  • Non-Patent Document 1 it has been reported that the bile resistance of Lactobacillus lactis is improved by culturing it in a medium supplemented with Tween80. However, it was confirmed that when the applicant applied this technique to lacticasei bacillus paracasei, no improvement in bile tolerance was observed, but rather decreased.
  • an object of the present invention is to provide a technique for enhancing the resistance of lactic acid bacteria to gastric juice and bile and improving the survival property in the living body.
  • the present inventors enhanced resistance to gastric fluid and bile by culturing lactic acid bacteria in a medium supplemented with oleic acid or a salt thereof, and survived after exposure. We have found that the properties are improved, and have completed the present invention.
  • the present invention is a method for improving gastric fluid and / or bile resistance of lactic acid bacteria, which comprises culturing lactic acid bacteria in a medium containing oleic acid or a salt thereof.
  • the present invention is a lacticase bacillus paracasei in which the proportion of oleic acid in the cells is 28 to 38%.
  • the present invention is Lacticase ibacillus paracasei YIT9029 (FERM BP-1366) in which the ratio of oleic acid to the bacterial cells is 28 to 38%.
  • the present invention is an oral preparation containing lacticasei bacillus paracasei having the above-mentioned oleic acid ratio of 28 to 38%.
  • the present invention is a food or drink containing lacticasei bacillus paracasei in which the proportion of oleic acid is 28 to 38%.
  • lactic acid bacteria themselves to gastric juice, bile, etc. Therefore, when foods and drinks containing this are ingested, more cells are kept in a viable state while maintaining their growth ability. It becomes possible to reach the intestines. Therefore, it is possible to continuously obtain more excellent effects on various physiological functions of lactic acid bacteria.
  • FIG. 1 It is a graph which shows the survival rate of lacticasei bacillus paracasei after continuous exposure to gastric juice and bile in Example 1.
  • FIG. It is a graph which shows the constituent fatty acid composition of the Lacticaseibacillus paracasei cell after continuous exposure to gastric juice and bile in Example 1.
  • FIG. It is a graph which shows the survival rate of lacticasei bacillus paracasei after continuous exposure to gastric juice and bile in Comparative Example 1.
  • lactic acid bacteria used in the present invention according to the reclassification of lactic acid bacteria by Zheng et al.
  • the genus name will be changed in the department. In this specification, it is shown by the notation of the new classification after the reclassification.
  • those that can be newly classified as Lacticaseibacillus paracasei are It shall be included in Lacticaseibacillus paracasei of the present application.
  • the lactic acid bacterium used in the present invention is not particularly limited, and for example, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseri, and other Lactobacillus casei bacteria. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus del Brucchis subspecies. Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subspice. Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • Non-Patent Document 2 Lacticaseibacillus casei is Lactobacillus casei in the old classification, and Ligilactobacillus salivarius.
  • Lacticaseibacillus paracasei is preferable because it has excellent resistance to gastric juice and bile.
  • Lacticasei Bacillus paracasei is not particularly limited as long as it is classified into this species, and is commercially available, deposited with a depository organization such as ATCC, newly discovered, or Mutant strains thereof and the like can be used.
  • Examples of such a lacticase bacillus paracasei include lacticaze bacillus paracasei YIT9029, lacticasei bacillus paracasei YIT0209 T and the like.
  • Lacticaseibacillus paracasei YIT9029 is preferable because it is more resistant to gastric juice and bile.
  • Lacticaseibacillus paracasei YIT9029 is an independent administrative agency product evaluation technology infrastructure organization that is the international depositary authority of the Budapest Treaty as Lactobacillus casei YIT9029 (FERM BP-1366, deposit date: May 18, 1987). It has been deposited internationally at the Patent Organism Depositary Center (Room 120, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818). Lactobacillus casei YIT9029 was classified as Lactobacillus casei by the reclassification of the genus Lactobacillus, but it was classified as Lactobacillus paracasei.
  • the medium for culturing the above lactic acid bacteria is not particularly limited, and includes raw milk such as milk, goat milk, mare milk, and sheep milk, and animal milk medium consisting of dairy products such as defatted milk powder, whole milk powder, and fresh cream.
  • Various synthetic media can be mentioned.
  • Ingredients used in ordinary lactic acid bacteria media may be added to the medium, and such components include, for example, vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, and vitamin E, various peptides, and amino acids. Examples include salts such as calcium and magnesium.
  • the synthetic medium may be either a liquid medium or a solid medium, but a medium containing a nitrogen source and a carbon source is preferable.
  • meat extract As a nitrogen source, meat extract, peptone, gluten, casein, yeast extract, amino acids, etc. are used, and as carbon sources, glucose, xylose, fructose, inositol, maltose, water candy, koji juice, starch, bacas, fusuma, etc. Molasses, glycerin and the like can be used. Further, as an inorganic substance, ammonium sulfate, potassium phosphate, magnesium chloride, salt, iron, manganese, molybdenum and the like can be added, and vitamins and the like can be further added. Suitable synthetic media include MRS medium, LBS medium, Rogosa medium, WYP medium, GYP medium and the like.
  • the resistance of lactic acid bacteria after culturing to gastric acid and bile can be improved.
  • the salt of oleic acid include sodium oleate, potassium oleate and the like, and one or two of these can be used. Of these, sodium oleate is preferable from the viewpoint of improving gastric fluid / bile resistance.
  • the concentration of oleic acid or a salt thereof in the medium is 0.001 to 0.3% by mass (hereinafter, "%" means mass% unless otherwise specified) from the viewpoint of the effect of improving gastric fluid / bile resistance. It is preferably 0.005 to 0.2%, and more preferably 0.005 to 0.2%.
  • the timing of adding oleic acid or a salt thereof to the medium is not particularly limited, but it is preferable to add oleic acid or a salt thereof before culturing the lactic acid bacteria.
  • the culture conditions are not particularly limited, but for example, the culture temperature is usually 20 to 50 ° C, preferably 25 to 40 ° C, and more preferably 35 to 38 ° C.
  • the culture time is usually 6 to 62 hours, preferably 12 to 48 hours, and more preferably 15 to 30 hours.
  • the pH of the medium is usually 3-8, preferably 4-7, more preferably 6-7.
  • the culturing may be carried out in an incubator, or the culturing may be carried out by aeration shaking.
  • the ratio of oleic acid to the constituent fatty acids of the lactic acid bacteria cells cultured as described above depends on the species of the lactic acid bacteria, but in the case of lacticase bacillus paracasei, for example, the ratio of oleic acid to the constituent fatty acids is 28. It is preferably ⁇ 38%, more preferably 34 ⁇ 36%.
  • the ratio of oleic acid to the constituent fatty acids of the cells is a value measured by the fatty acid composition analysis described in Examples.
  • the form of adding the lactic acid bacterium cultured as described above to an oral preparation, food or drink, etc. is not particularly limited, and for example, the culture obtained by culturing in the above-mentioned various media such as animal milk medium is added as it is.
  • the method and the like can be mentioned.
  • a method for collecting lactic acid bacteria and a method for drying a culture solution or a collected product a known method can be used. If necessary, the collected cells may be washed by centrifugal washing or the like.
  • the cultured lactic acid bacteria can be formulated as it is or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier to form an oral preparation.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, glucose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glyceride, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, amino acids, gelatin, albumin. , Water, physiological saline and the like. Further, if necessary, conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, tonicity agents, and excipients can be appropriately added.
  • the dosage form is not particularly limited as long as it is an oral preparation, and examples thereof include liquids, powders, granules, capsules, tablets, tablets and the like, which are prepared according to a conventional method.
  • the content of lactic acid bacteria in the oral formulations of the present invention is not particularly limited, but for example when the dosage form is a liquid, the viable cell count of lactic acid bacteria is 10 6 cfu / mL ⁇ 10 8 cfu / mL In the case of a solid, it is preferably 10 7 cfu / g to 10 10 cfu / g.
  • the viable cell number preferably 1 day 10 3 cfu or more, more preferably 10 6 cfu or more.
  • the food and drink of the present invention can be prepared according to a conventional method by blending known food additives and / or food materials with lactic acid bacteria cultured as described above.
  • the form is not particularly limited, and may be, for example, liquid, tablets, capsules, pastes, granules and the like.
  • Foods and drinks include fermented milk foods and drinks, fermented soymilk, fermented fruit juices, fermented vegetable juices and other fermented foods and drinks, breads, biscuits, hot cakes, noodles, tablet confectionery and other starch-based foods, gums, candies and Japanese sweets.
  • Confectionery such as ham, sausage and other livestock food, chikuwa, kamaboko and other fish meat food, seafood food, dressing, soy sauce, jam, sprinkle and other seasonings, tea, juice, refreshing beverage, liquor and other beverages Can be mentioned.
  • the above fermented milk food and drink can be manufactured according to a conventional method.
  • a veterinary milk medium consisting of raw milk such as milk and goat milk, defatted milk powder, full-fat milk powder, and dairy products such as fresh cream is inoculated with lactic acid bacteria and cultured, and homogenized to obtain a fermented milk base.
  • a syrup solution can be added and mixed with this fermented milk base, and flavors and food materials can be further added to make a final product.
  • various food materials such as various sugars, thickeners, emulsifiers, and various vitamins can be added to these fermented milk foods and drinks.
  • specific examples of these food materials include sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose, xylose, and malt sugar, sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, palatinit, reduced water candy, and reduced malt sugar water candy.
  • High sweetness sweeteners such as sugar alcohol, aspartame, somatin, sucralose, acesulfam K, stevia, agar, gelatin, carrageenan, guar gum, xanthan gum, pectin, locust bean gum, gellan gum, carboxymethyl cellulose, soybean polysaccharide, propylene glycol alginate, etc.
  • sucrose fatty acid ester sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, sorbitol fatty acid ester, emulsifiers such as lecithin, milk fat such as cream, butter, sour cream, citric acid, lactic acid, acetic acid, apple Acidulants such as acid, tartrate acid, gluconic acid, various vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin E, minerals such as calcium, magnesium, zinc, iron, manganese, yogurt type, berry type, Flavors such as orange, garlic, perilla, citrus, apple, mint, grape, apricot, pair, custard cream, peach, melon, banana, tropical, herb, tea, coffee, etc. Can be mentioned.
  • Is not particularly limited content of lactic acid bacteria in food or drink of the present invention for example, when food or beverage is a liquid, it viable cell count of lactic acid bacteria is 10 6 cfu / mL ⁇ 10 8 cfu / mL In the case of a solid, it is preferably 10 7 cfu / g to 10 10 cfu / g.
  • the viable cell number preferably 1 day 10 3 cfu or more, more preferably 10 6 cfu or more.
  • the lactic acid bacterium contained in the oral preparation or food or drink of the present invention has high resistance to acids such as gastric acid and bile acid, it has high resistance to digestive juice such as gastric acid and bile. Therefore, even if the lactic acid bacterium is orally ingested and then exposed to the digestive juice, many cells can pass through the digestive tract as a live bacterium and reach the intestine. For example, oleic acid or a salt thereof.
  • the survival rate after continuous exposure to gastric fluid and bile is preferably 5 times or more, more preferably 20 times or more, as compared with the cells cultured in the additive-free medium.
  • the survival rate of lactic acid bacteria after continuous exposure to gastric juice and bile means a value obtained by the method described in Examples.
  • the oral preparation or food or drink of the present invention is a lactic acid bacterium having high survival in the gastrointestinal tract or high reachability in the intestine.
  • lactic acid bacteria may lose their ability to form colonies even if they do not die, but the lactic acid bacteria contained in the oral preparation or food or drink of the present invention maintained their ability to form colonies. Since it can reach the intestine in a viable state, it is possible to continuously obtain a higher physiological effect.
  • the food and drink of the present invention can expressly or implicitly indicate the effect or function of lactic acid bacteria on the high survival in the digestive tract or the high reachability in the intestine.
  • Such indications include, but are not limited to, "high ability to reach the intestine alive”, “high ability to proliferate in the intestine", or indications that can be equated with these.
  • Such a label may be attached to the food or drink itself, or may be attached to these containers or packages, depending on the aspect of the food or drink of the present invention.
  • Example 1 (Culture of Lacticasei Bacillus paracasei)
  • the cryopreserved Lacticase ibacillus paracasei YIT9029 was inoculated into MRS liquid medium at 1% (v / v) and aerobically cultured at 37 ° C. for 24 hours (preculture).
  • 1% (v / v) of the preculture solution was inoculated into an MRS liquid medium containing no additives or 0.01% or 0.1% sodium oleate (Tokyo Chemical Industry), and the mixture was aerobic at 37 ° C.
  • the cells were cultured for 24 hours (main culture) to prepare a cultured bacterial solution.
  • Comparative Example 1 After exposure to gastric fluid in the same manner as in Example 1 except that, instead of adding 0.01% or 0.1% of sodium oleate to the medium, 0.1%, 1% or 5% of Tween 80 was added. And the survival rate and fatty acid composition analysis after continuous exposure to gastric fluid and bile were performed. The results after continuous exposure to gastric juice and bile are shown in FIGS. 3 and 4.
  • the present invention is useful as a method for producing health functional foods containing lactic acid bacteria, because it can enhance the resistance of lactic acid bacteria themselves to gastric juice, bile, etc., and allow them to reach the intestines in a living state to exert their functions. ..

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Abstract

本発明の課題は、乳酸菌の胃液や胆汁に対する耐性を高め、生体内での生残性を向上させる技術を提供することである。当該課題を解決した方法は、乳酸菌を、オレイン酸又はその塩を含有する培地で培養することを特徴とする。

Description

乳酸菌の胃液・胆汁耐性向上方法
　本発明は、乳酸菌の胃液・胆汁耐性向上方法に関し、さらに詳細には、乳酸菌自体の胃酸、胆汁酸等に対する耐性を付与ないし増強し、摂取後、生きたまま腸内に到達させ得る方法に関する。
　近年、プロバイオティクスとして、腸内細菌叢のバランスを改善し、宿主の健康に有益な作用をもたらす微生物が注目されている。このような微生物として乳酸菌やビフィズス菌が利用されており、これらを摂取することで、便秘・下痢症の改善効果、免疫機能改善による感染防御・アレルギー抑制効果、動脈硬化の予防効果など様々な生理効果を得られることが報告されている。
　プロバイオティクスの定義に関しては、近年、生菌だけでなく死菌を含める考え方も提唱されている。しかし、プロバイオティクスの作用機序として、腸内細菌叢において有用な微生物が増殖し、様々な代謝産物を産生することによって、競合する有害な微生物を排除したり、増殖を抑制したりすることで、その機能がより効果的に発揮され得るといえるから、腸内において生きた状態で存在している方が有利と考えられる。このように、摂取された有用微生物は、生きたままの状態で腸内に到達することが望まれるが、腸内に到達するまでには、温度、ｐＨ、酸素など、微生物の生育を阻害する様々な因子が存在し、特に胃液や胆汁などの消化液は、胃酸や胆汁酸の他、様々な消化酵素を含み、これらの消化液に曝されると、死滅したり、生き残ったとしてもコロニー形成能（増殖能）を喪失するなど重大な傷害を受ける。
　そのため、有用微生物を消化液から保護し、消化管内での生残性を向上させる技術が検討されている。例えば、微生物のhrcA遺伝子を破壊することにより、微生物自体の胃酸・胆汁酸耐性を増強する方法（特許文献１）や、乳酸菌を腸溶性カプセル内に封入し、胃液などとの直接的な接触を回避して生残性を高める方法（特許文献２参照）などが開示されている。しかし、前者は煩雑な遺伝子工学的手法を要するものであり、後者は剤型に制約が生じるなど、これらの技術は汎用性が高いものとは言い難かった。一方、より簡便な方法として、ラクトバチルス・ラクチスを、Tween 80を過剰添加した培地で培養することにより、その胆汁耐性が向上することが報告されている（非特許文献１）。しかし、本出願人が、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイにこの技術を適用したところ、胆汁耐性の向上は認められず、むしろ低下してしまうことが確認された。
特開２００５－１６０号公報 特開２０１４－１３９２００号公報
Kimoto H, Ohmomo S, Okamoto T. Enhancement of bile tolerance in lactococci by Tween 80. J Appl Microbiol. (2002) 92, 41-46. Zheng et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020;70:2782-2858
　従って、本発明の課題は、乳酸菌の胃液や胆汁に対する耐性を高め、生体内での生残性を向上させる技術を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、乳酸菌を、オレイン酸又はその塩を添加した培地で培養することにより、胃液及び胆汁に対する耐性が増強され、曝露後の生残性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は乳酸菌を、オレイン酸又はその塩を含有する培地で培養することを特徴とする乳酸菌の胃液及び／または胆汁耐性向上方法である。
　また本発明は、菌体に占めるオレイン酸の割合が２８～３８％であるラクチカゼイバチルス・パラカゼイである。
　また本発明は、菌体に占めるオレイン酸の割合が２８～３８％であるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ－１３６６）である。
　また本発明は、上記オレイン酸の割合が２８～３８％であるラクチカゼイバチルス・パラカゼイを含有する経口製剤である。
　また本発明は、上記オレイン酸の割合が２８～３８％であるラクチカゼイバチルス・パラカゼイを含有する飲食品である。
　本発明により、乳酸菌自身の胃液や胆汁等に対する耐性を付与ないし増強することができるため、これを含有する飲食品等を摂取すると、より多くの菌体が増殖能を維持したまま生菌状態で腸内へ到達することが可能となる。そのため、乳酸菌が有する様々な生理機能において、より優れた効果を持続的に得ることができる。
実施例１における胃液胆汁連続曝露後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの生残率を示すグラフである。 実施例１における胃液胆汁連続曝露後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ菌体の構成脂肪酸組成を示すグラフである。 比較例１における胃液胆汁連続曝露後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの生残率を示すグラフである。 比較例１における胃液胆汁連続曝露後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ菌体の構成脂肪酸組成を示すグラフである。
　本発明に用いる乳酸菌について、Zhengらの乳酸菌の再分類（非特許文献２）によると、従来ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属していた乳酸菌について、その菌属が細分化され、ならびに菌種の一部において属名が変更されることになった。本明細書では再分類以降の新分類の表記で示すものとする。
　また、旧分類においてラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）又はラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に分類されていた乳酸菌のなかで、新たにラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei）として分類され得るものは、本願のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei）に含まれるものとする。本発明に用いる乳酸菌としては特に制限されず、例えば、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei）、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）等のラクチカゼイバチルス属細菌、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブルッキィー サブスピーシーズ．ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキィー サブスピーシーズ．デルブルッキィー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）等のラクトバチルス属細菌、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）等のリギラクトバチルス属細菌、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）等のリモシラクトバチルス属細菌、リクオリラクトバチルス・マリ（Liquorilactobacillus mali）等のリクオリラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属細菌を挙げることができ、これらの乳酸菌を１種または２種以上用いることができる。なお、Zhengらの乳酸菌の再分類（非特許文献２）によると、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）は旧分類ではラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）であり、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）は旧分類ではラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）であり、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）は旧分類ではラクトバチルス・ファーメンタル（Lactobacillus fermentum）であり、リクオリラクトバチルス・マリ（Liquorilactobacillus mali）は旧分類ではラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）である。
　上記乳酸菌の中でも胃液・胆汁耐性に優れること等からラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei）が好ましい。ラクチカゼイバチルス・パラカゼイは、この種に分類されるものであれば特に限定されず、市販されているもの、ＡＴＣＣ等の寄託機関に寄託されているもの、新たに見出されたもの、あるいは、それらの変異株等を用いることができる。このようなラクチカゼイバチルス・パラカゼイとしては、例えば、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ０２０９Ｔ等が挙げられる。これらラクチカゼイバチルス・パラカゼイの中でも、より胃液、胆汁耐性に優れること等から、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９が好ましい。ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ　ＹＩＴ９０２９は、本出願人がラクトバチルス・カゼイ　ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６、寄託日：１９８７年５月１８日）としてブダペスト条約の国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒２９２-０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に国際寄託している。なお、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ　ＹＩＴ９０２９は、以前の分類ではラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）とされていたが、ラクトバチルス属の再分類により、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに分類された。
　上記乳酸菌を培養する培地は特に制限されるものではなく、牛乳、山羊乳、馬乳、羊乳等の生乳や、脱脂粉乳、全粉乳、生クリーム等の乳製品等からなる獣乳培地のほか、各種合成培地を挙げることができる。培地には、通常の乳酸菌培地に使用される成分を添加してもよく、このような成分として、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類や、各種ペプチド、アミノ酸類、カルシウム、マグネシウム等の塩類が挙げられる。合成培地としては、液体培地及び固体培地のいずれでもよいが、窒素源及び炭素源を含有するものが好ましい。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を、また、炭素源としては、グルコース、キシロース、フルクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、デンプン、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等を用いることができる。また、無機質として、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン等を添加することができ、さらにビタミン等を添加することができる。好適な合成培地としては、ＭＲＳ培地、ＬＢＳ培地、Ｒｏｇｏｓａ培地、ＷＹＰ培地、ＧＹＰ培地等が挙げられる。
　本発明においては、上記培地に、オレイン酸又はその塩を添加することにより、培養後の乳酸菌の胃液・胆汁耐性を向上させることができる。オレイン酸の塩としては、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム等が挙げられ、これらの１種または２種を用いることができる。これらのうち、胃液・胆汁耐性向上効果等の観点から、オレイン酸ナトリウムが好ましい。
　オレイン酸又はその塩の培地中の濃度は、胃液・胆汁耐性向上効果の観点から、０．００１～０．３質量％（以下、特に断らない限り「％」は質量％を意味する）であることが好ましく、０．００５～０．２％であることがより好ましい。オレイン酸又はその塩を培地に添加する時期は特に制限されないが、乳酸菌を培養する前に添加しておくことが好ましい。
　培養条件は特に制限されるものではないが、例えば、培養温度は通常２０～５０℃、好ましくは２５～４０℃、より好ましくは３５～３８℃である。培養時間は通常６～６２時間であり、好ましくは１２～４８時間であり、より好ましくは１５～３０時間である。培地のｐＨは通常３～８、好ましくは４～７であり、より好ましくは６～７である。培養はインキュベーター中で行ってもよく、また、培養の際は通気振とうしてもよい。
　上記のようにして培養した乳酸菌菌体の構成脂肪酸に占めるオレイン酸の割合は、乳酸菌の種等にもよるが、例えば、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの場合、構成脂肪酸に占めるオレイン酸の割合は２８～３８％であることが好ましく、３４～３６％であることがより好ましい。菌体の構成脂肪酸に占めるオレイン酸の割合は、実施例に記載の脂肪酸組成分析によって測定される値である。
　上記のようにして培養した乳酸菌を、経口製剤や飲食品等に添加する形態は特に制限されるものではなく、例えば、獣乳培地等の上記各種培地で培養して得られる培養物をそのまま添加する方法、培養液から乳酸菌を遠心分離、膜分離等で集菌した集菌物を添加する方法、培養液を乾燥させた培養液乾燥物または集菌物を乾燥させた乾燥菌体を添加する方法等が挙げられる。乳酸菌の集菌方法や培養液または集菌物の乾燥法としては、公知の方法を用いることができる。また必要に応じ、集菌物を遠心洗浄等により洗浄してもよい。
　培養した乳酸菌は、そのままあるいは薬学的に許容される担体を組み合わせて製剤化して経口製剤とすることができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。またその剤型としては、経口製剤であれば特に限定されるものではなく、例えば、液剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、タブレット等が挙げられ、これらは常法に従って調製される。
　本発明の経口製剤における乳酸菌の含有量は特に限定されるものではないが、例えば剤型が液体の場合には、乳酸菌の生菌数は１０６ｃｆｕ／ｍＬ～１０８ｃｆｕ／ｍＬであることが好ましく、固体の場合には１０７ｃｆｕ／ｇ～１０１０ｃｆｕ／ｇであることが好ましい。投与量も特に限定されるものではないが、生菌数として、好ましくは１日当たり１０３ｃｆｕ以上、より好ましくは１０６ｃｆｕ以上である。
　一方、本発明の飲食品は、上記のようにして培養した乳酸菌に、公知の食品添加物及び／又は食品素材を配合し、常法に従って調製することができる。その形態は特に限定されず、例えば、液状、錠剤、カプセル、ペースト、顆粒等とすることができる。飲食品としては、発酵乳飲食品、発酵豆乳、発酵果汁、発酵野菜汁等の発酵飲食品、パン、ビスケット、ホットケーキ、麺、錠菓等のデンプンを主体とする食品、ガム、キャンディー、和菓子等の菓子類、ハム、ソーセージ等の畜肉食品、ちくわ、かまぼこ等の魚肉食品、魚介類食品、ドレッシング、醤油、ジャム、ふりかけ等の調味料、茶、ジュース、清涼飲料、酒類等の飲料等が挙げられる。
　上記発酵乳飲食品は常法に従って製造することができる。例えば、牛乳、山羊乳などの生乳、脱脂粉乳、全脂粉乳、生クリーム等の乳製品からなる獣乳培地に、乳酸菌を接種して培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得て、この発酵乳ベースにシロップ溶液を添加・混合し、更にフレーバーや食品素材を添加して最終製品とすることができる。
　これらの発酵乳飲食品には、必要に応じて、各種食品素材、例えば、各種糖質、増粘剤、乳化剤、各種ビタミン剤等の任意成分を配合することができる。これらの食品素材として具体的なものは、ショ糖、グルコース、フルクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖等の糖質、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコール等の各種増粘（安定）剤、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、クリーム、バター、サワークリームなどの乳脂肪、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等の各種ビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル系、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバー類を挙げることができる。
　本発明の飲食品における乳酸菌の含有量は特に限定されるものではないが、例えば飲食品が液体の場合には、乳酸菌の生菌数は１０6ｃｆｕ／ｍＬ～１０８ｃｆｕ／ｍＬであることが好ましく、固体の場合には１０７ｃｆｕ／ｇ～１０１０ｃｆｕ／ｇであることが好ましい。投与量も特に限定されるものではないが、生菌数として、好ましくは１日当たり１０３ｃｆｕ以上、より好ましくは１０６ｃｆｕ以上である。
　本発明の経口製剤または飲食品に含まれる乳酸菌は、胃酸や胆汁酸などの酸に対する耐性が高いことから、胃液や胆汁などの消化液に対し高い耐性を有する。そのため、上記乳酸菌は経口摂取された後、消化液に曝されても多くの菌体が生菌のまま消化管内を通過し、腸内に到達し得るものであり、例えば、オレイン酸又はその塩無添加の培地で培養した菌体と比較して、胃液胆汁連続曝露後の生残率が好ましくは５倍以上、より好ましくは２０倍以上のものである。本発明において、胃液胆汁連続曝露後の乳酸菌の生残率とは、実施例に記載の方法によって求められる値をいう。このように本発明の経口製剤または飲食品は、乳酸菌消化管内高生残性または腸内高到達性のものである。また乳酸菌は、胃液や胆汁に暴露されると、死滅には至らなくてもコロニー形成能を失う場合があるが、本発明の経口製剤または飲食品に含まれる乳酸菌は、コロニー形成能を維持したまま生菌状態で腸内に到達し得るものであるため、より高い生理効果を持続して得ることが可能となる。
　本発明の飲食品には、乳酸菌の消化管内高生残性または腸内高到達性に関する効果ないし機能を明示的又は暗示的に表示することができる。このような表示としては、特に限定されないが、「生きたまま腸に届く能力が高い」、「腸内で増殖する能力が高い」、あるいはこれらと同視できる表示などが挙げられる。このような表示は、本発明の飲食品の態様に応じて、飲食品自体に付してもよいし、これらの容器又は包装に付してもよい。
　以下、本発明を、実施例等を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら限定されるものではない。
実施例１
（ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの培養）
　凍結保存されたラクチカゼイバチルス・パラカゼイ　ＹＩＴ９０２９をＭＲＳ液体培地に１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養した（前培養）。次に、無添加あるいは０．０１％、０．１％のオレイン酸ナトリウム（東京化成工業）を含むＭＲＳ液体培地に、前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種して３７℃で好気的に２４時間培養し（本培養）、培養菌液とした。
（人工胃液胆汁連続曝露）
　上記培養菌液を遠心分離（７，０００　×ｇ、８分、４℃）した。上清を除去した後に、ペレットを１５　ｍｌの滅菌生理食塩水（大塚製薬）に再懸濁した（遠心洗浄操作）。この遠心洗浄操作を計２回実施した。再度、ペレットを１５　ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁して一部をサンプリングした。つづけて７，０００　×ｇ、８分、４℃の条件で遠心分離し、上清をすべて除去した後に、ペレットを１５０　ｍｌの下記表１に示す組成の人工胃液（ｐＨ　３．０に調整）に懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。胃液曝露後、菌液の一部をサンプリングした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　胃液曝露後、１Ｍ　ＮａＨＣＯ３で菌液のｐＨを４．４に調整し、最終濃度が０．１０％になるように人工胆汁であるｏｘｇａｌｌ（ＢＤ社製）を添加し、３７℃で１０分間曝露した（胆汁曝露）。胆汁曝露後に菌液の一部をサンプリングした。胃液曝露前、胃液曝露後および胃液胆汁連続曝露後にサンプリングした菌液を適宜ＰＢＳで希釈後、ＭＲＳ平板培地に５０　μｌずつ塗抹した。３７℃で好気的に３日間培養してコロニーを計数し、菌液中の生菌数（ｌｏｇ１０　ｃｆｕ／ｍｌ）を測定した。胃液曝露前の生菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）を１００％として、胃液曝露後及び胃液胆汁連続曝露後のラクチカゼイバチルス・パラカゼイの生残率を算出した。なお、本試験は再現性を確認するため、試験日を変えて同じ試験を３回実施した。胃液胆汁連続曝露後の結果を図１に示す。
　図１より、オレイン酸ナトリウムを添加した培地で培養することで、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの胃液及び胆汁に対する耐性が高まることが認められた。胃液胆汁連続曝露後において、オレイン酸ナトリウム無添加では生残率が大幅に低下したのに対し、オレイン酸ナトリウムを培地中に添加することで、曝露後の生残率が顕著に向上することが示された。
（菌体脂肪酸組成分析）
　各菌液について、菌体脂肪酸組成分析システム“Ｓｈｅｒｌｏｃｋ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ”（ＭＩＤＩ社製、ガスクロマトグラフィー）に基づき、菌体の構成脂肪酸組成を分析した。結果を図２に示す。
　図２より、オレイン酸ナトリウム添加培地で培養した菌体は、菌体中のオレイン酸の割合が上昇していることが確認された。
比較例１
　培地中にオレイン酸ナトリウムを０．０１％または０．１％添加することに代えて、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％、１％または５％添加した以外は実施例１と同様にして、胃液曝露後及び胃液胆汁連続曝露後の生残率及び脂肪酸組成分析を行った。胃液胆汁連続曝露後の結果を図３及び４に示す。
　Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％添加した場合、胃液暴露後の生残率は８７％であり、オレイン酸ナトリウムを０．１％添加した場合（生残率１１５％）と比較して生残率は低かった。また、図３及び４から明らかなように、Ｔｗｅｅｎ８０を０．１％添加した場合、オレイン酸ナトリウムを０．１％添加した場合と比較して胃液胆汁連続暴露後の生残率は低かった。そして、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度を１％、５％と上昇させるのに伴い、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイの生残率は低下し、菌体中のオレイン酸含量は減少した。
　本発明は、乳酸菌自身の胃液や胆汁等に対する耐性を高め、生きた状態で腸内に到達させてその機能を発揮させることができるため、乳酸菌を含有する保健機能食品等の製法として有用である。

 

Claims (11)

  1. 　乳酸菌を、オレイン酸又はその塩を含有する培地で培養することを特徴とする乳酸菌の胃液及び／または胆汁耐性向上方法。
  2. 　乳酸菌がラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Lacticaseibacillus paracasei）である請求項１記載の胃液及び／または胆汁耐性向上方法。
  3. 　前記ラクチカゼイバチルス・パラカゼイが、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ－１３６６）である請求項２に記載の胃液及び／または胆汁耐性向上方法。
  4. 　オレイン酸の塩が、オレイン酸ナトリウム及びオレイン酸カリウムよりなる群から選ばれる１種または２種である請求項１～３のいずれかの項記載の胃液及び／または胆汁耐性向上方法。
  5. 　培地中のオレイン酸又はその塩の含有量が、０．００５～０．２質量％である請求項１～４のいずれかの項記載の胃液及び／または胆汁耐性向上方法。
  6. 　菌体の構成脂肪酸に占めるオレイン酸の割合が２８～３８％であるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ。
  7. 　菌体の構成脂肪酸に占めるオレイン酸の割合が２８～３８％であるラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ－１３６６）。
  8. 　請求項６に記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイを１種又は２種以上含有する経口製剤。
  9. 　請求項７に記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ－１３６６）を含有する経口製剤。
  10. 　請求項６に記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイを１種又は２種以上含有する飲食品。
  11. 　請求項７に記載のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ  ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ－１３６６）を含有する飲食品。
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