JP7178203B2 - 乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法 - Google Patents

Description

IPOD FERM BP-1366 IPOD FERM BP-11500

本発明は、保存後も高い生菌数を維持することのできる乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法に関するものである。

腸内細菌として知られている乳酸菌は、従来からヨーグルトやチーズ等の乳製品の製造に広く利用されている。近年では、乳酸菌の種々の機能を利用するため生菌体を利用した乳製品のみならず、乾燥させた生菌体を用いた種々の形態の食品、飲料等の開発も進んでいる。

しかし、乾燥菌体を得る工程では、菌体が損傷し、死滅することが多く、必要量の生菌体を得ることは難しかった。

そこで、乾燥菌体を得る工程における、菌体の損傷や死滅を減らすために、菌体を乾燥させる際に使用する分散媒に工夫をする技術が知られている。そのような技術としては、例えば、グルタミン酸ナトリウム（特許文献１）やトレハロース（非特許文献１）を分散媒に添加したり、または、これらを組み合わせたりして使用すること（特許文献２）が知られている。また、本出願人も分散媒として、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含有するものを使用することにより高温（３０～４０℃）での品質安定性が高くなることを報告している（特許文献３）。

上記技術でも乾燥菌体を得る工程における菌体の損傷や死滅を減らすことはできるが、乾燥菌体における生菌体の量は限りなく乾燥前の生菌体の量に近づいた方がよいことは言うまでもない。

特許第３５０４３６５号 特開２０１０－４７８７号公報 国際公開第ＷＯ２０１７／０７３７５２号パンフレット

G.L.DE ANTONI et. al.「Trehalose, a Cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus」 Cryobiology 26, p.149-153, 1989

従って、本発明の課題は、乾燥菌体を得る工程における菌体の損傷や死滅を減らすことのできる新たな技術を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、分散媒の組成ではなく、乾燥工程前の分散媒のｐＨを特定の範囲にすることにより、乾燥菌体を得る工程における菌体の損傷や死滅を減らせることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、乳酸菌菌体を分散媒に分散し、当該分散媒のｐＨを７．５～１０．５に調整した後、凍結乾燥することを特徴とする乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法である。

また、本発明は、３７℃で８週間保存後の生菌数が、乳酸菌菌体を分散媒に分散し、当該分散媒のｐＨを７．０に調整した後、凍結乾燥して得られる乳酸菌凍結乾燥菌体を３７℃で８週間保存後の生菌数を１００％とした時の１２０％以上であることを特徴とする乳酸菌凍結乾燥菌体である。

本発明によれば、乾燥菌体を得る工程における菌体の損傷や死滅を減らすことができるため、保存後にも生菌数の高い乳酸菌凍結乾燥菌体を製造することができる。

従って、本発明の乳酸菌凍結乾燥菌体は、種々の形態の食品、飲料等に利用することができる。

本発明の乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法（以下、「本発明方法」という）は、乳酸菌菌体を分散媒に分散し、当該分散媒のｐＨを７．５～１０．５に調整した後、凍結乾燥するものである。

本発明方法に用いられる乳酸菌は、特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・クレモリス（Lactobacillus cremoris）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブルッキー サブスピーシーズ．ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキー サブスピーシーズ．デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アシジピスシス（Lactobacillus acidipiscis）、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・コリニフォルミス(Lactobacillus coryniformis)、ラクトバチルス・ケフィーリ(Lactobacillus kefiri)、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィラノファシエンス(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens)、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス・サブスピーシーズ・ケフィリグラナム(Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum)、ラクトバチルス・ノデンシス(Lactobacillus nodensis)、ラクトバチルス・パラブレビス(Lactobacillus parabrevis)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・パラケフィーリ(Lactobacillus parakefiri)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ぺロレンス(Lactobacillus perolens)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ツセッティ（Lactobacillus tucceti）ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）等のラクトバチルス属細菌、カルノバクテリウム・ダイバージェンズ（Carnobacterium divergens）、カルノバクテリウム・マルタノマティカム（Carnobacterium maltaromaticum）等のカルノバクテリウム属細菌、ワイセラ・サイバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・ヘレニカ（Weissella hellenica）等のワイセラ属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・ガロィチカス（Streptococcus gallolyticus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属細菌、ペディオコッカス・パルヴルム（Pediococcus parvulus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）等のペディオコッカス属細菌、ロイコノストック・サイテレウム（Leuconostoc citreum）、ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis）等のロイコノストック属細菌等の乳酸菌を挙げることができる。これら乳酸菌は１種または２種以上用いることができ、これらの中でもラクトバチルス属細菌が好ましく、ラクトバチルス・クリスパータスおよび／またはラクトバチルス・カゼイがより好ましく、ラクトバチルス・クリスパータス ＹＩＴ １２３１９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１１５００、受託日：２０１１年４月２８日、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室））および／またはラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６、受託日：昭和５６年５月１日、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室））が特に好ましい。

これら乳酸菌は、本発明方法を行う前に、常法に従って培地で培養し、集菌しておくことが好ましい。培地は、乳酸菌の種類に合わせて適宜選択すればよく、例えば、ＭＲＳ（deMan、Rogosa、Sharpe）培地、後記するＳＭＢ培地等を用いることができる。培養条件も乳酸菌の種類に合わせて適宜選択すればよい。培養後は、例えば、高速冷却遠心機、デラバル型連続遠心機等を用いて集菌すればよい。また、集菌後は、必要により洗浄を行ってもよい。洗浄液としては生理食塩水、ＰＢＳ等が挙げられる。

上記乳酸菌菌体は分散媒に分散させる。分散媒は乳酸菌の種類に合わせて適宜選択すればよいが、例えば、保護剤および抗酸化剤を含有する水溶液を用いることが好ましい。乳酸菌菌体を分散媒に分散させる方法は特に限定されず、分散媒に乳酸菌菌体を添加し、撹拌等をすればよい。また、分散媒に分散させる乳酸菌菌体の量は特に限定されないが、例えば、０．０１～２０質量％（以下、単に「％」という）程度である。なお、分散させる乳酸菌は基本的に生菌体だが、死菌体が含まれていてもよい。

分散媒に用いられる保護剤は、特に限定されず、例えば、グルタミン酸や、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム等のグルタミン酸の塩、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類、グリセロール、マルトデキストリン、サイクロデキストリン、脱脂粉乳、馬鈴薯デンプン等が挙げられる。これら保護剤は１種または２種以上を用いることができるが、トレハロース、脱脂粉乳および馬鈴薯デンプンを用いることが好ましい。分散媒における保護剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、１～４０％が好ましく、３～４０％がより好ましく、３～３０％が特に好ましい。

分散媒に用いられる抗酸化剤は、特に限定されず、例えば、アスコルビン酸や、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸の塩、ビタミンＥ、カテキン、グルタチオン、アスタキサンチン等が挙げられる。これら抗酸化剤は１種または２種以上を用いることができるが、アスコルビン酸が好ましい。分散媒における抗酸化剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、０.０１～１０％が好ましく、０.０５～５％がより好ましい。

分散媒としては、脱脂粉乳、トレハロース、アスコルビン酸および馬鈴薯デンプンからなる群から選ばれる１種以上を含有する水溶液が好ましく、脱脂粉乳、トレハロース、アスコルビン酸および馬鈴薯デンプンを含有する水溶液がより好ましく、脱脂粉乳、トレハロース、アスコルビン酸および馬鈴薯デンプンをそれぞれ３～４０％、３～２０％、０．１～５％、３～２０％含有する水溶液が特に好ましい。なお、溶解してもｐＨに影響を与えない分散媒（馬鈴薯デンプン等）については、後述する乳酸菌菌体の分散媒懸濁液のｐＨ調整後に当該分散媒を添加することもできる。

上記のようにして乳酸菌菌体を分散媒に分散した後は、当該分散媒のｐＨを７．５～１０．５に調整、好ましくはｐＨを８．０～１０．０に調整する。ｐＨの調整は水酸化ナトリウム等のアルカリ物質を用いて行えばよい。

分散媒のｐＨを調整した後は、凍結乾燥させる。凍結乾燥の条件は、特に限定されないが、例えば、－３５℃～－４５℃で６～４８時間の凍結処理を行った後、１２℃～３５℃で４０～９０時間の乾燥処理を行う条件等を挙げることができる。なお、凍結乾燥機の例としては、ＴＦ２０－８０ＴＡＮＮＳ（（株）宝製作所製）等を挙げることができる。

斯くして得られる乳酸菌凍結乾燥菌体は、保存後も高い菌数を維持することができる。具体的には、乳酸菌凍結乾燥菌体を３７℃で８週間保存後の生菌数が、乳酸菌菌体を分散媒に分散し、当該分散媒のｐＨを７．０に調整した後、凍結乾燥して得られる乳酸菌凍結乾燥菌体を３７℃で８週間保存後の生菌数を１００％とした時の１２０％以上である。なお、当然ながら、上記分散媒のｐＨを７．０に調整して得られる乳酸菌凍結乾燥菌体の製造には、分散媒のｐＨを７．５～１０．５に調整して得られる乳酸菌凍結乾燥菌体の製造に用いたのと、分散媒のｐＨ以外は同じ条件、菌株を用いる。また、乳酸菌凍結乾燥菌体を３７℃で８週間保存後の生残率（％）が、乳酸菌菌体を分散媒に分散し、当該分散媒のｐＨを７．０に調整した後、凍結乾燥して得られる乳酸菌凍結乾燥菌体を３７℃で８週間保存後の生残率を１００％とした時の１１０％以上であることがさらに好ましい。なお、生残率は（保存期間後の生菌数／保存０日の生菌数）×１００として計算される。

上記の乳酸菌凍結乾燥菌体は、そのまま、あるいは通常食品に添加される他の食品素材と混合することにより、食品や飲料に利用することができる。例えば、食品としては、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、ヨーグルトや発酵乳等が挙げられる。飲料としては、清涼飲料、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料等が挙げられる。また、飲食品の形態としては、通常用いられる飲食品の形態、例えば、粉末、顆粒等の固体状、ペースト状、液状等が挙げられる。また、微生物乾燥菌体を、錠剤、散剤、チュアブル剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤、ガム等に加工してもよい。なお、口腔用組成物として、洗口剤、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディー、チューインガムなどに、またペットフード等に使用することも可能である。

以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

実 施 例 １
乳酸菌凍結乾燥菌体の製造：
（１）分散媒懸濁液の調製
ＭＲＳ培地で前培養したラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（以下、「ＬｃＳ」ということもある）の培養液を、別のＭＲＳ培地４Ｌに０．１％接種後、３７℃で１６時間（定常期に達するまで）静置培養した。次いで、培養液を遠心（４℃、１４０００×ｇ、３０分間）し、菌体を生理食塩水で１回洗浄後、ＬｃＳの菌体を分散媒（脱脂粉乳１０％、トレハロース５％、アスコルビン酸０．５％を含有する水溶液）に添加・混合し、分散媒懸濁液を得た。分散媒を４等分し、５Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ７．０、８．０、９．０または１０．０にｐＨを調整した後、馬鈴薯デンプンを５％添加・混合し、分散媒懸濁液を得た。

（２）凍結乾燥および粉砕
（１）で得た分散媒懸濁液を凍結乾燥器（ＴＦ２０－８０ＴＡＮＮ：（株）宝製作所製）にてマイナス４０℃で２日間凍結後、棚温２０℃で２日間凍結乾燥を行った。この凍結乾燥物を粉砕し、ＬｃＳ凍結乾燥菌体を得た。

（３）保存試験
（２）で得たＬｃＳ凍結乾燥菌体を、チャック付きラミネート袋（ラミジップ：生産日本社製）に分包し、乾燥剤（ケアドライCP-5、大江化学工業（株））を入れ、空気をよくぬきチャックを閉めた。その後、３７℃にて表１に記載の期間保存し、保存前、保存後の生菌数を測定した。生菌数の測定は、スパイラルプレーター（ＥＤＤＹ ＪＥＴ、ＩＵＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行った。また、生菌数から各保存期間後の生残率を算出した。それらの結果も表１に示した。さらに、ｐＨ７．０に調整した生菌数を１００％とした時に、ｐＨ９．０の生菌数との生菌数の比がいくつになるかを以下の式で算出した。

この結果より、凍結乾燥前の分散媒のｐＨが高いほど、生菌数や生残率が高くなることが分かった。なお、乳酸菌凍結乾燥菌体の３７℃で８週間保存後の生菌数は、ｐＨ７．０に調整したものを１００％とすると、ｐＨ８．０、９．０、１０．０に調整したものはそれぞれ１２４％、１４７％、２００％であった。

実 施 例 ２
乳酸菌凍結乾燥菌体の製造：
実施例１において、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９に代えてラクトバチルス・クリスパータス ＹＩＴ １２３１９（以下、「ＬｃＹ」ということもある）を用い、培養液の遠心条件を４℃、４５００×ｇ、７分間とし、分散媒のｐＨを７．０または９．０にする以外は同様にしてＬｃＹ凍結乾燥菌体を得た。これらについて実施例１と同様にして生菌数を測定した。その結果を表２に示した。また、ｐＨ７．０の生菌数を１００％とした時に、ｐＨ９．０の生菌数との生菌数の比がいくつになるかを実施例１と同様にして算出した。

この結果より、ＬｃＳに代えてＬｃＹを用いた場合でも凍結乾燥前の分散媒のｐＨを高くすると生菌数が高くなることが分かった。なお、乳酸菌凍結乾燥菌体の３７℃で８週間保存後の生菌数は、ｐＨ７．０に調整したものを１００％とすると、ｐＨ９．０に調整したものは１７６％であった。

実 施 例 ３
乳酸菌凍結乾燥菌体の製造：
（１）分散媒懸濁液の調製
ＳＭＢ培地（大豆ペプトン２％、酵母エキス（ミーストＰ１Ｇ：登録商標、アサヒビール食品（株）製）２％、発酵大麦エキス（バーレックス：登録商標、三和酒類（株）製）６％、モノオレイン酸デカグリセリン（サンソフトＱ１７－Ｓ：登録商標、太陽化学（株）製）０．１％、ラクトース２％を含有するｐＨ６．７の培地）で前培養したＬｃＹの培養液を、ＳＭＢ培地２Ｌに０．１％ずつ接種後、３７℃で１２時間（定常期に達するまで）静置培養した。次いで、培養液をそれぞれ遠心（４℃、４５００×ｇ、７分間）し、菌体を生理食塩水で１回洗浄後、ＬｃＹの菌体を分散媒（脱脂粉乳２０％、トレハロース１０％、アスコルビン酸１％を含有する水溶液）に添加・混合した（ｐＨ５．１）。ｐＨを調整しない系では、さらに馬鈴薯デンプンを１０％添加・混合し、分散媒懸濁液を得た。一方、分散媒のｐＨを調整する系では５Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ７．０および９．０にｐＨを調整した後、馬鈴薯デンプンを１０％添加・混合し、分散媒懸濁液を得た。

（２）凍結乾燥および粉砕
（１）で得た分散媒懸濁液を凍結乾燥器（ＴＦ２０－８０ＴＡＮＮ：（株）宝製作所製）にてマイナス４０℃で２日間凍結後、棚温２０℃で２日間凍結乾燥を行った。この凍結乾燥物を粉砕し、ＬｃＹ凍結乾燥菌体を得た。

（３）保存試験
（２）で得たＬｃＹ凍結乾燥菌体を、チャック付きラミネート袋（ラミジップ：生産日本社製）に分包し、空気をよくぬきチャックを閉めた。その後、３７℃にて表３に記載の期間保存し、保存前、保存後の生菌数を測定した。生菌数の測定は、スパイラルプレーター（ＥＤＤＹ ＪＥＴ、ＩＵＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行った。また、実施例１と同様にして生残率を算出した。さらに、ｐＨ無調整の生菌数を１００％とした時に、ｐＨ７．０または９．０の生菌数との生菌数の比がいくつになるかを以下の式で算出した。それらの結果も表３に示した。また、ｐＨ７．０の生菌数を１００％とした時に、ｐＨ９．０の生菌数との生菌数の比がいくつになるかを実施例１と同様にして算出した。

この結果より、培地を代えても、凍結乾燥前の分散媒のｐＨを高くすると生菌数や生残率が高くなることが分かった。なお、乳酸菌凍結乾燥菌体の３７℃で８週間保存後の生菌数は、ｐＨ７．０に調整したものを１００％とすると、ｐＨ９．０に調整したものは２０２９０％であった。

実 施 例 ４
乳酸菌凍結乾燥菌体の製造：
実施例３において、静置培養を３７℃で１２時間行うのに代えて、３０℃で２２時間行う以外は同様にしてＬｃＹ凍結乾燥菌体を得た。これらについて実施例１と同様にして生菌数を測定し、生残率を算出した。また、ｐＨ７．０の生菌数を１００％とした時に、ｐＨ９．０の生菌数との生菌数の比がいくつになるかを実施例１と同様にして算出した。その結果を表４に示した。

この結果より、培養条件を代えても、培地を代えた時と同様に、凍結乾燥前の分散媒のｐＨを高くすると生菌数や生残率が高くなることが分かった。

本発明の乳酸菌凍結乾燥菌体は、種々の形態の食品、飲料等に利用することができる。

Claims (2)

1. 乳酸菌菌体を分散媒に分散し、当該分散媒のｐＨを９．０～１０．０に調整した後、凍結乾燥する乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法であって、
   分散媒が、脱脂粉乳、トレハロース、アスコルビン酸および馬鈴薯デンプンを含有するものであり、
   乳酸菌が、ラクトバチルス属乳酸菌であることを特徴とする乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法。
2. 乳酸菌が、ラクトバチルス・クリスパータスおよび／またはラクトバチルス・カゼイである請求項１記載の乳酸菌凍結乾燥菌体の製造方法。