CN112961779A - 一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，包括制作含有大肠杆菌的菌泥、制作冷冻干燥保护剂、将冷冻干燥保护剂与菌泥混匀冷冻干燥制成冻干粉等步骤，最终制成具有高活性的质控小球。使用该质控小球进行病原微生物检测，其检测标准统一，检测结果准确，具有可比较性。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的活性可控的保存方法，具体来说是一种大肠杆菌经冷冻干燥制得质控小球的方法。
背景技术
食源性污染包括31种不同的类型，例如微生物、病毒、毒素、寄生虫以及化学物质等。食源性污染会导致数百种临床疾病，全球每年因食源性污染导致的经济损失高达数千亿。在这些因素中，微生物污染是食源性污染的主要因素之一，严重影响着国民生命健康与经济安全，开展病原微生物检测和控制研究对国民经济建设与健康管理有重要意义。
常见的病原微生物检测方法包括平板培养、凝集实验、分子扩增以及基于微生物生长代谢特性的光电传感等，这些方法已经发展成为经典方法且已经取得了极为广泛的应用。然而，除了平板培养的方式能够以绝对定量的方式对病原微生物进行准确定量外，其他检测方式均为半定量的检测方式。因此，对于所有半定量方法或设备而言，病原微生物检测前的质控便是极为重要的一环，检测设备和方法的质控是保证设备和方法有效性的重要前提。这关系着病原微生物检测结果的准确度以及不同方法、不同设备、甚至相同设备的不同机器之间检测的精确度。通过微生物检测方法或设备的质控，可以有效提高准确度与精确度，可以更好、更准确地判断食品卫生情况，对食品的病原微生物污染程度做出正确评价，也可以为食品卫生相关的质控工作提供准确依据。
就目前的病原微生物检测来看，不同方法所采用的检测靶标与定量参数均不尽相同。如分子实验，不同检测机构可能会选择微生物的不同靶标片段或使用不同的引物来进行分析，因此得到的不同结果的判断也完全不同；再如微生物光电检测仪，现在市场上的微生物光电检测仪数量多、种类杂，如Tempo检测仪、Bactrac检测仪、Soleris检测系统、PN-INS32型检测仪、Biolog微生物鉴定系统和BAX System Q7检测系统等，光电传感的策略也有浊度、紫外吸光度、荧光等，不同仪器设备之间的结果更是无法放在同一标准下进行判断。微生物的冷冻干燥保存是常用的微生物保存方法，但是在实际应用中，冷冻干燥过程中常常会导致不可控的微生物损伤，从而导致活性的不可控损失。而合适的冷冻干燥保护剂能够有效缓解这一问题，因此，筛选合适的冷冻干燥保护剂是微生物保藏的重要一环，合适的冷冻干燥保护剂与冷冻干燥方法直接关系到微生物活性损失率的控制以及最终得到的质控小球中菌株数量的控制。
鉴于以上现状，能够明显看出病原微生物检测质控的重要性，为使检测结果具备可对比性，统一的活体微生物质控小球和方法也显得尤为重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，使用特制的冷冻干燥保护剂使得制得的质控小球具有高活性且方便保存和使用，保证后期检测标准统一，检测结果准确。
为达到上述目的，本发明所采取的技术手段为：
一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，包括以下步骤：
S1制作含有大肠杆菌的菌泥：使用营养肉汤培养增菌获取得到大肠杆菌的菌液，分装后制成菌泥待用。
其中步骤S1包括：
S11将获取得到的菌液分装为1mL/管；
S12分装完成的菌液依次进行离心处理，去掉上清液；
S13加入1×PBS作为清洗液，重复离心处理，去掉上清液；
S14去除其中的培养基和代谢产物，再次进行离心处理得到菌泥。
进一步地，S12、S13和S14中进行离心处理时，菌液在8000rpm下保持10分钟。
S2制作冷冻干燥保护剂：分别量取预定量的水溶性糖、蛋白质、表面活性剂、无机盐和抗氧化剂，将上述组分分别加入无菌水中震荡混合均匀得到水溶液作为冷冻干燥保护剂待用。
其中，所述冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2-5％的海藻糖、5-8％的脱脂奶粉、2-3％的甘油、4-5％的无机盐、0.05-0.1％的抗氧化剂，其余为无菌水。
优选地，所述冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2％的海藻糖、8％的脱脂奶粉、2％的甘油、5％的无机盐、0.05％的抗氧化剂，其余为无菌水。
其中，所述无机盐为谷氨酸钠、氯化钠、硫酸钠、氯化钾、氯化铵、碳酸钙中的任意一种。所述抗氧化剂为维生素C、维生素E、亚硫酸钠中的任意一种。优选地，所述无机盐为谷氨酸钠；所述抗氧化剂为维生素E。
S3混合：向步骤S1的菌泥中添加步骤S2制作的冷冻干燥保护剂，其中冷冻干燥保护剂:菌泥的体积比为1:10，混合均匀得到混合液；
S4冷冻和干燥：将步骤S3制得的混合液经过冷冻处理后，转入冷冻干燥机彻底干燥，得到质控小球保存备用。
其中，冷冻处理是指将混合液在-80℃的环境下冷冻5小时。
上述制备方法制得的质控小球通过添加生理盐水或其他对大肠杆菌活性无损的溶液进行重悬后，用于不同检测设备或检测方法的质控。使用该质控小球的可以保证检测样本统一，确保检测结果准确，可对比性强。
本发明的有益效果是：
本发明针对大肠杆菌这一病原微生物模型，从蛋白质、水溶性糖、表面活性剂、无机盐以及抗氧化剂等组分确定出能够有效保持大肠杆菌活性的冷冻干燥保护剂。基于该冷冻干燥保护剂，使用冷冻干燥方法制成具有高活性的大肠杆菌的质控小球，以用于基于不同检测方法或检测设备的质控。本发明中，水溶性糖为海藻糖，蛋白质为脱脂奶粉，能够使得冷冻干燥保护剂的效果达到最优，表面活性剂为甘油，能够提升质控小球中大肠杆菌的活性。
本发明筛选合适的冷冻干燥保护剂的组分与含量用于大肠杆菌的活性无损的保存，进而制备大肠杆菌的质控小球。并且经本发明制得的质控小球在制备过程中的活性损失可计算，方便指导后续应用中有特定菌株数量需求的质控小球制备。
本发明除了用于大肠杆菌的质控小球制备外，还可以用于其他病原微生物冷冻干燥质控小球的制备，为准确的病原微生物检测提供标准。
附图说明
图1a为不同浓度的大肠杆菌在FORBID仪器下得到的实时生长曲线；
图1b为由图1a统计得到的标准曲线；
图2a为大肠杆菌质控小球在重悬并稀释至不同浓度后于FORBID仪器下得到的实时生长曲线；
图2b为由图2a统计得到的标准曲线；
图3为质控小球中的理论菌株数量与根据标准曲线测出的菌株数量的一致性分析；
图4为本发明实施例2中使用不同糖类与使用海藻糖得到的实时生长曲线对比图；
图5为本发明实施例3中使用不同含量海藻糖得到的实时生长曲线对比图；
图6为本发明实施例4中使用不同含量的脱脂奶粉得到的实时生长曲线对比图；
图7为本发明实施例5中在冷冻干燥保护剂中添加和不添加甘油时得到的实时生长曲线对比图；
图8为本发明实施例6中使用不同含量的甘油得到的实时生长曲线对比图；
图9为本发明实施例7中使用不同成分的盐类物质得到的实时生长曲线对比图；
图10为本发明实施例8中使用不同含量的谷氨酸钠得到的实时生长曲线对比图；
图11为本发明实施例9中使用不同抗氧化剂或不使用抗氧化剂得到的实时生长曲线对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，包括以下步骤：
S1制作含有大肠杆菌的菌泥：使用营养肉汤培养增菌获取得到大肠杆菌的菌液，培养增菌方法本领域技术人员选用常规方式，此不属于本发明的重点，在此不做描述。将获取得到的菌液分装为1mL/管，分装完成的菌液依次进行离心和清洗处理。
进行离心处理时，将菌液固定放置后，启动离心机并逐渐提高的速度，经过6秒后当速度达到8000rpm时，使菌液在该速度下保持10分钟。
离心处理过后的菌液使用1×PBS的清洗液进行清洗处理，本发明使用的PBS是市售产品：Sigma-Aldrich，货号：P5493。
清洗处理后去除上清液，再重复一次离心处理和清洗处理并去除上清液。
之后，去除菌液中的培养基和代谢产物，再次经过离心处理得到含有大肠杆菌的菌泥。
S2制作冷冻干燥保护剂：分别量取预定量的水溶性糖、蛋白质、表面活性剂、无机盐和抗氧化剂，将上述组分分别加入无菌水中混合均匀得到水溶液作为冷冻干燥保护剂待用；
其中，所述冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2-5％的海藻糖、5-8％的脱脂奶粉、2-3％的甘油、4-5％的无机盐、0.05-0.1％的抗氧化剂，其余为无菌水。
其中，所述无机盐为谷氨酸钠、氯化钠、硫酸钠、氯化钾、氯化铵、碳酸钙中的任意一种。所述抗氧化剂为维生素C、维生素E、亚硫酸钠中的任意一种。
优选地，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2-5％的海藻糖、5-8％的脱脂奶粉、2-3％的甘油、4-5％的谷氨酸钠、0.05-0.1％的维生素E，其余为无菌水。
S3混合：向步骤S1的菌泥中添加步骤S2制作的冷冻干燥保护剂，其中冷冻干燥保护剂：菌泥的体积比为1:10，本发明中，使用100μL的冷冻干燥保护剂加入每个管中，混合均匀得到混合液。
S4冷冻和干燥：将步骤S3制得的混合液在-80℃的环境下冷冻5小时，经过该冷冻处理后，转入冷冻干燥机至少干燥24小时，彻底干燥后得到大肠杆菌的质控小球保存。
质控小球要求在4℃的环境下密闭保存。
本发明制得的质控小球使用时，通过添加生理盐水或其他对大肠杆菌活性无损的溶液进行重悬后，用于不同检测设备或检测方法的质控，通过绘制标准曲线对其中的大肠杆菌含量进行准确定量。使用本发明的质控小球的可以保证检测样本统一，确保检测结果准确，可对比性强。
实施例1
本实施例中，一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，包括以下步骤：
S1制作含有大肠杆菌的菌泥：使用营养肉汤培养增菌获取得到大肠杆菌的菌液，将获取得到的菌液分装为1mL/管，分装完成的菌液按照前述步骤依次进行多次离心和清洗处理之后，得到含有大肠杆菌的菌泥。
S2制作冷冻干燥保护剂：分别量取预定量的水溶性糖、蛋白质、表面活性剂、无机盐和抗氧化剂，将上述组分分别加入无菌水中混合均匀得到水溶液作为冷冻干燥保护剂待用；
其中，所述冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2％的海藻糖、8％的脱脂奶粉、2％的甘油、5％的谷氨酸钠、0.05％的维生素E，其余为无菌水。
S3混合：向步骤S1的菌泥中添加步骤S2制作的冷冻干燥保护剂，本实施例中，每个管中添加100μL的冷冻干燥保护剂，混合均匀得到混合液；
S4冷冻和干燥：将步骤S3制得的混合液在-80℃的环境下冷冻5小时，经过该冷冻处理后，转入冷冻干燥机彻底干燥后得到质控小球。
使用时，将制得的质控小球经1mL生理盐水重悬后，分别用生理盐水稀释至不同浓度梯度，随后转移至5mL大肠杆菌培养基中，培养基中含有0.075g的4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷，大肠杆菌分泌的糖醛酸苷酶作用于4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷，使其发出荧光，用于实时监测微生物生长曲线。记录荧光达到阈值的时间以确定大肠杆菌浓度与达到阈值时间的对数线性相关关系，以此为标准曲线可进一步对实际样品中的大肠杆菌数量进行定量分析。
如图1a和图1b中，图1a为不同浓度的大肠杆菌在荧光光电生物传感器(FORBID)上得到的实时生长曲线，其中横坐标为生长时间，纵坐标为荧光信号强度，大肠杆菌数量为平板计数所得活体菌株数量；图1b为图1a统计后得到的标准曲线，其中横坐标为菌株数量，纵坐标为图1a荧光强度达到一定数值时对应的时间，该曲线用于后续质控小球中有活性的大肠杆菌的计数。不同菌株浓度的菌液样品在荧光光电生物传感器(FORBID)上的实时扩增曲线以及菌株浓度与荧光信号达到监测点的时间的对数线性相关关系。
图2a为大肠杆菌质控小球在重悬并稀释至不同浓度后于FORBID仪器下得到的实时生长曲线，横坐标为生长时间，纵坐标为荧光信号强度，大肠杆菌数量为理论计算所得活体菌株数量；图2b为图2a统计后得到的标准曲线，其中横坐标为菌株数量，纵坐标为图2a荧光强度达到一定数值时对应的时间。从上面两个图中可以得到质控小球重悬并稀释至不同浓度后在荧光光电生物传感器(FORBID)上的实时扩增曲线以及菌株浓度与荧光信号达到监测点的时间的对数线性相关关系。用质控小球取得的生长曲线与标准曲线与正常菌株的生长曲线与标准曲线高度一致，表明制得的质控小球能够用于FORBID仪器及其他以大肠杆菌为检测目标的方法与仪器的质控。
图3是质控小球中的理论菌株数量与根据标准曲线测出的菌株数量的一致性分析。途中横坐标为质控小球重悬并稀释后的理论活体大肠杆菌数目，纵坐标为通过FORBID仪器用图1b的标准曲线进行计算后的实际活体大肠杆菌数目。理论计算出的数目与实际检测到的数目高度一致，说明本发明制得的质控小球可用于检测方法与检测仪器的质控。此外，六个不同质控小球测得的数据一致性好，说明本方法制得的质控小球中大肠杆菌活性损失率基本可控，进一步表明该制备方法制备出的质控小球具有用于质控的价值。
本发明中，重点在于确定了最恰当的冷冻干燥保护剂组分及含量用于制备质控小球，以确保大肠杆菌的高活性和制备过程中活性损失的可计算性。因此，后续实施例及对比例与实施例1的主要区别在于冷冻干燥保护剂的组分和含量，故仅列出主要区别，其他条件和制作过程相同，不再做描述。
实施例2
本实施例中进行了多组数据对比，与实施例1的区别在于：在10％脱脂奶粉中分别含有6％海藻糖、6％蔗糖、6％乳糖、6％麦芽糖或者6％葡萄糖。对照组为离心并冲洗但未冷冻菌株。
对上述制得的质控小球进行检测得到的结果见图4。由图中可知，在使用6％的海藻糖时，得到的大肠杆菌活体菌株数量多于其他糖类。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在10％脱脂奶粉中分别含有1％、2％、4％、6％、8％或者10％海藻糖。对上述制得的质控小球进行检测得到的结果见图5，其结果表明，10％脱脂奶粉+2％海藻糖对菌株活性保存效果最好。。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在2％海藻糖中分别含有8％、10％、12％、14％、16％、18％或者20％脱脂奶粉。对上述制得的质控小球进行检测结果见图6，其结果表明，8％脱脂奶粉+2％海藻糖对菌株活性保存效果最好。
实施例5
本实施例中与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在10％脱脂奶粉、1％海藻糖中分别含有或者不含有1％甘油。对上述制得的质控小球进行检测结果见图7，其结果表明，含有1％甘油对菌株活性保存效果更好。
实施例6本实施例中与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在10％脱脂奶粉、2％海藻糖中分别含有或者不含有0％、1％、2％、3％、4％或者5％甘油。对上述制得的质控小球进行检测结果参见图8，其结果表明，10％脱脂奶粉+2％海藻糖+2％甘油对菌株活性保存效果最好。
实施例7
本实施例中与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在10％脱脂奶粉、1％海藻糖中分别含有或者不含有1％氯化钠、1％谷氨酸钠、1％硫酸钠、1％氯化钾、1％氯化铵、1％碳酸钙或者不含有盐类物质。对上述制得的质控小球进行检测结果见图9，其结果表明，10％脱脂奶粉+1％海藻糖+1％谷氨酸钠对菌株活性保存效果最好。
实施例8
本实施例中与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在10％脱脂奶粉、2％海藻糖中分别含有或者不含有1％、2％、3％、4％、5％、6％或者不含有谷氨酸钠。对上述制得的质控小球进行检测结果见图10，其结果表明，10％脱脂奶粉+2％海藻糖+5％谷氨酸钠对菌株活性保存效果最好。
实施例9
本实施例中与实施例1的区别在于，冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数中，在10％脱脂奶粉、1％海藻糖中分别含有或者不含有0.1％维生素E、0.1％亚硫酸钠或者不含抗氧化剂。对上述制得的质控小球进行检测结果见图11，其结果表明，抗氧化剂对菌株活性保存效果影响不明显。但由于抗氧化剂有利于菌株的长期保存，故选用维生素E作为抗氧化剂添加至保护剂中，此外，1％维生素E会影响菌株形态，0.05％则不会，故最终选择0.05％维生素E添加至保护剂中。
本发明中，筛选了合适的冷冻干燥保护剂的组分与含量用于大肠杆菌的活性无损的保存。
Claims (9)
1.一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于包括一下步骤：
S1制作含有大肠杆菌的菌泥：使用营养肉汤培养增菌获取得到大肠杆菌的菌液，分装后制成菌泥待用；
S2制作冷冻干燥保护剂：分别量取预定量的水溶性糖、蛋白质、表面活性剂、无机盐和抗氧化剂，将上述组分分别加入无菌水中震荡混合均匀得到水溶液作为冷冻干燥保护剂待用；
S3混合：向步骤S1的菌泥中添加步骤S2制作的冷冻干燥保护剂，其中冷冻干燥保护剂:菌泥的体积比为1:10，混合均匀得到混合液；
S4冷冻和干燥：将步骤S3制得的混合液经过冷冻处理后，转入冷冻干燥机彻底干燥，得到质控小球保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于步骤S1包括：
S11将获取得到的菌液分装为1mL/管；
S12分装完成的菌液依次进行离心处理，去掉上清液；
S13加入1×PBS作为清洗液，重复离心处理，去掉上清液；
S14去除其中的培养基和代谢产物，再次进行离心处理得到菌泥。
3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于：S12、S13和S14中进行离心处理时，菌液在8000rpm下保持10分钟。
4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于：S4中，冷冻处理为将混合液在-80℃的环境下冷冻5小时。
5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2-5％的海藻糖、5-8％的脱脂奶粉、2-3％的甘油、4-5％的无机盐、0.05-0.1％的抗氧化剂，其余为无菌水。
6.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥保护剂中各组分的质量浓度分数为：2％的海藻糖、8％的脱脂奶粉、2％的甘油、5％的无机盐、0.05％的抗氧化剂，其余为无菌水。
7.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于：所述无机盐为谷氨酸钠、氯化钠、硫酸钠、氯化钾、氯化铵、碳酸钙中的任意一种。
8.根据权利要求5所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于：所述抗氧化剂为维生素C、维生素E、亚硫酸钠中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌冷冻干燥的质控小球的制备方法，其特征在于：所述质控小球通过添加生理盐水或其他对大肠杆菌活性无损的溶液进行重悬后，用于不同检测设备或检测方法的质控。
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