JP3127064B2 - サンプル中の微生物の検出方法 - Google Patents

サンプル中の微生物の検出方法

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  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はサンプル中の微生物の強
化した検出方法およびその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】サンプルの微生物の検出方法は一般に時
間がかかりそして骨の折れる臨床的方法である。普通行
う場合には、少量のサンプル、いわゆる接種材料を微生
物増殖促進培地へ置く。次いでこの系を適当な条件で培
養し、適当な時間経過後に結果を読み取る。
【０００３】プレートを毎日検査しスコアを付ける。微
生物の推測される種類および使用する培地の種類に応じ
て、増殖していないプレートは一般に４〜８日間廃棄さ
れない。非常に高濃度の微生物を有する少量のサンプル
については、上記手段は良好に働く。増殖可能な微生物
が低濃度のためにかなり多量の液状サンプルが必要な場
合にはサンプルを液状培地の数倍量で希釈し、混合物を
培養して増殖を検出する。普通、増殖可能な微生物の存
在を試験する滅菌サンプルたとえば血液サンプルは、増
殖の検出が可能になるまで１〜数日間を要するであろ
う。ビンを毎日詳しく調べる。増殖していないビンは一
般に５〜７日間は廃棄されない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】すなわち、この培養時
間を減らす必然性がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記のことは本発明方法
により実現される。簡単には、本発明方法において、サ
ンプル容器は複数のより小さい領域に分画されており、
微生物の存在について各領域毎に別々にモニターされう
る。サンプルをこの容器へ入れて培養し各領域毎にモニ
ターすると、培養およびモニターを行う個々の領域に含
まれるサンプルの液量はサンプル全体の量よりも少ない
ので検出が迅速になる；なぜなら、微生物検出は濃度依
存性現象であり、モニターする液量が少なければ微生物
汚染の存在を検出しうる濃度まで微生物を培養するため
の時間は短くてすむからである。
【０００６】図１は、格子組式区画部（ｉｎｔｅｒｌｏ
ｃｋｉｎｇ ｄｉｖｉｄｅｒｓ）を用いてサンプルを複
数の区画へ分けるための好ましい装置を表し；（ａ）は
一面を貫通した装置を示し；（ｂ）は側面図であり；そ
して（ｃ）は格子組式区画部の詳細図である。
【０００７】本発明は、サンプルを複数のより小さい領
域に分け、そして各領域毎に別個に分析することにより
微生物の検出を強化して必要な検出時間を短くすること
による、微生物検出を強化する便利な方法を提供するも
のである。検出は検出系における細菌の総数ではなく濃
度に依存するため、サンプルをより小さい領域に分け個
々の領域において微生物の培養、検出を行うことにより
サンプルを区画せずに分析を行うよりも、迅速にそして
全体的に低濃度で細菌の検出をすることができるであろ
う。
【０００８】例として述べれば、ベクトン、ディキンソ
ン アンド カンパニー（Becton，Dickinson and Comp
any) により市販されているＢＡＣＴＥＣ（登録商標）
血液培養分析器システムが陽性結果を得るためにほぼ１
×１０６ＣＦＵ／ｍｌの限界濃度を必要とする。初期接
種材料を培養培地で５０ｍｌまで希釈して５０ｍｌ中に
わずか１ＣＦＵを含む場合（即ち、０.０２ＣＦＵ／ｍ
ｌの場合）、以下に詳しく述べるようにこの限界濃度を
達成するために合計２６世代が必要であろうと計算する
ことができる。即ち、サンプルは総量が５０ｍｌなので
検出限界濃度１×１０６ＣＦＵ／ｍｌに到達するには、
５０×１×１０６＝５×１０7ＣＦＵ（≒２25.6ＣＦ
Ｕ）まで増殖させなければならない。一方、微生物は一
世代毎に１細胞が２細胞に分裂し、１ＣＦＵが２ＣＦＵ
となる。従って、１ＣＦＵの微生物が５×１０7ＣＦＵ
となるためには、約２６世代培養する必要がある。平均
世代時間を３０分とし、増殖開始前に遅れ（ｌａｇ）が
ないと仮定すると、これは検出時間１３時間に換算でき
る 。
【０００９】本発明の好ましい実施態様において、サン
プル５０ｍｌを各々０.５ｍｌの１００個の区画へ分け
る。この場合、各区画の液量は０.５ｍｌなので、１Ｘ
１０６ＣＦＵ／ｍｌの有効濃度に到達するためには、
０.５×１×１０６＝５×１０5ＣＦＵまで増殖すること
を必要とするであろう。これは微生物を含む区画におい
て１９世代（２19≒５×１０5）すなわち（上述のよう
に世代時間が３０分、かつ時間的遅れがないと仮定し
て）約９.５時間で達成され、５０ｍｌのサンプルを分
画せずに培養して検出する場合より３.５時間の短縮と
なる。サンプル５０ｍｌを各々０.０５ｍｌの１０００
個の区画へ分けると、各々の生物が１×１０６ＣＦＵ／
ｍｌ以上に増殖するためにはわずか16世代（２16≒５×
１０4）すなわち８時間しか必要としない。
【００１０】検査される区画の数およびこれら区画の容
積を特定用途にしたがってまたは装置の制限的指令によ
り変化させることができることは容易に認識される。区
画が相互に有効に離れているかぎりは、この分画を達成
するさらに別の手段は重要ではない。
【００１１】図１はこの分画に対する好ましい装置を示
し、これは格子組式区画部により一面を複数の区画に分
けられた培養ビンからなる。これらは別々の区画を平行
六面体形状に形成し、各々は同じ容積である。実際の使
用ではこれら区画部の高さは、使用する場合、培養する
間たとえば振とう器のような攪拌装置中での培養の間に
容量を完全に含むのに十分でなければならない。
【００１２】実際には、接種材料をビンへ入れ、次にこ
のビンを区画部を含む一面上に置きサンプルを別々の区
画へ分ける。次いでビンを培養し、いずれかの都合のよ
い方法で増殖について分析する。好ましい分析方法に
は、比色法、蛍光測定法、放射測定法、比濁法および赤
外線分析法がある。
【００１３】区画の形状および/ または容積は、各区画
について同一形状および容積が好ましいが変更可能なこ
とは認識されるべきである。
【００１４】微生物の迅速な検出に加えてこの方法は先
行技術より有利な2 つの別の主な利点を有する。第一
は、この方法が菌血症または敗血症の定量化を可能にす
る。第二は、この方法が多種微生物とも適合性があるこ
とであり、この方法はほとんどの環境下で生物の初期レ
ベルが低い限りは混合種から単離した培養物を作るであ
ろう。
【００１５】ワムポール ラボラトリーズ(Wampole Lab
oratories)より市販されてるアイソレーター(Isolator)
7.5 ミクロバイアルチューブ(Microbial Tube)は、遠心
分離により血液種から微生物を濃縮するための装置およ
びシステムである。この方法は30分の遠心回転で25工程
を越える手法を含む非常に時間と手間のかかるものであ
る。この方法はこれが元の血液サンプルにおける微生物
の数を推定しうるただ1 つの商業ベースの方法であるの
で、広く受け入れられてきた。ドーン(Dorn)らによるこ
の方法の評価(J．Clin．Micr.，9．p391-396) により、
遠心分離法によってのみもたらされる定量化は機会的感
染と皮膚の不潔とを区別しそして抗生物質療法の効果を
判定するにおいて幾つかの場合有用であることを証明し
た" 、と結論した。スリバン(Sullivan)ら(Pediatric
s，69，699-702) は子供の菌血症の程度は臨床疾患の深
刻さと関連することを示した。
【００１６】本発明方法において、原サンプルにおける
微生物の数の推定は増殖を示した区画の数を数えるのと
同じくらい簡単である。陽性凹部（ｗｅｌｌ）の数が全
凹部の数と比較して少ない場合、この推定は非常に正確
であることが予想されうる。陽性凹部の数が増えると、
推定の正確度および信頼性が悪くなる。しかしながら、
迅速な検出が最も都合のよいほとんどの種類の型たとえ
ば血液は一般に１０ＣＦＵ／ｍｌ未満の微生物数を有す
る。培地で希釈すれば、凹部の１０％未満が陽性になる
であろう。
【００１７】さらに、原サンプルにおける二種以上の微
生物の存在はほとんどのシステムで大きな問題である。
これは血液培養において重要で、しばしば発生する。多
種微生物菌血症が化膿性エピソードの18% 程の多さで報
告されそしてより高い死亡率に結びつく。全サンプルを
一つのビンへ入れるような場合、迅速に増殖する微生物
たとえば大腸菌に対し非常に容易で、他の存在する生物
が失われる。他の生物は検出されないかまたは同定およ
び感受性試験のために単離したコロニーを増殖するのに
さらに18〜24時間を必要とする。
【００１８】本発明方法において、少数の生物が存在す
る場合、各生物が別々の凹部へ入る可能性が高い。数種
が存在する場合、したがって各陽性凹部は一つの生物の
結果であり、したがって純粋な培養物であることが予想
されうる。もし一種( たとえば大腸菌) が原サンプル中
で主流の場合、ほとんどの陽性凹部に培養物があること
が期待される; しかし残りの陽性凹部における別の種の
増殖に影響を及ぼしたり妨げたりするものではない。す
なわち、複数の微生物の検出が非常に簡易化される。
【００１９】さらに、微生物の世代時間が長い、たとえ
ばミコバクテリアたとえば結核と関連するものの場合、
検出時間が非常に少なくなる。これにより診断がより速
くなり、そして治療をより早期に開始することができ
る。
【００２０】
【実施例】以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施
態様を提供するものであるが、全ての実施態様の例示で
あることを意図するものではない。
【００２１】実施例１ 本発明方法の利点を説明するために、血液サンプルの８
ｍｌアリコートを培養培地中８０ｍｌまで希釈したサン
プルが、１Ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌの限界濃度に到達する
のに必要な時間を測定するために、世代時間が２０分、
３０分または１２時間であり、かつ、増殖開始前にそれ
ぞれ３０分、３０分および１日の遅れ（ラグ）があると
仮定して一連の計算を行った。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】 表１ 世代時間 総ＣＦＵ 限界値までの時間 短縮した時間 ８ml血液中 （分） ａ−ｂ (CFU/ml) ａ ｂ ２０分 １（０．１２５） ５６０ ４２０ １４０ 分 ２（０．２５０） ５４０ ４２０ １２０ 分 ８（１．０） ５００ ４２０ ８０ 分 １６（２．０） ４８０ ４２０ ６０ 分 ３２（４．０） ４６０ ４２０ ４０ 分 ３０分 １（０．１２５） ８２５ ６１５ ２１０ 分 ２（０．２５０） ７９５ ６１５ １８０ 分 ８（１．０） ７３５ ６１５ １２０ 分 １６（２．０） ７０５ ６１５ ９０ 分 ３２（４．０） ６７５ ６１５ ６０ 分 日数 日数 １２時間 １（０．１２５） １４．２５ １０．７５ ３．５日 ＋１日の ２（０．２５０） １３．７５ １０．７５ ３日 遅れ ８（１．０） １２．７５ １０．７５ ２日 １６（２．０） １２．２５ １０．７５ １．５日 ３２（４．０） １１．７５ １０．７５ １日 注 ａ．サンプルを分画しない通常のシステムで測定し
た場合、測定１回 ｂ．各々０.６６６ｍｌの区画部を１２０個を有する本
発明装置で測定した場合明らかなように、本発明のシス
テムは特に生物の初期濃度が薄いか、または世代時間が
長い場合に時間が著しく短縮する。
【００２３】実施例２ 市販の細菌検出システムと本発明方法の比較スピードを
評価するために、このシステムを微量滴定トレーを用い
て再現する。使用する三つのシステムを以下に記載す
る。
【００２４】蛍光微量滴定トレー（本発明）： トレーの製造；蛍光化合物トリス４，７−ジフェニル−
１，１０−フェナントロリン ルテニウム（II) クロリ
ド (Ｒｕ（ＤＰＰ）3 Ｃｌ2 ）を、ワッツ（Watts)およ
びクロスビィ(Crosby)の方法（J．Am．Chem．Soc.，9
3，3184(1971)) を用いて合成した。総量３．６mgの化
合物を２．０mlジメチルスルホキシド(D-5879，シグマ
ケミカル社, ミズリー州, セントルイス) に溶かし、次
いで得られた溶液を攪拌しながら、１３００mlシリコー
ンゴム形成溶液（水性エマルジョン＃3-5024, ダウコー
ニング社、ミシガン州ミットランド) へゆっくり加え
た。次いで混合物の３５μl アリコートを９６個の凹部
を有する平らな底面の白色微量滴定トレー（#011-010-7
901、ダイナテック社(Dynatech)、バージニア州シャン
ティリー) の各凹部へ分散させ、このシステムを続いて
一晩低湿度( ２５％ＲＨ未満）、６０℃の培養器中で硬
化した。硬化後、このトレーを以下の試薬の各々を用い
て、各凹部を数回浸漬または充填することにより洗浄
し、そして空にする；（ａ）無水エタノール、（ｂ）
０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２、（ｃ）加熱蒸留水
（約４５℃）および（ｄ）雰囲気温度蒸留水。
【００２５】バキュテイナー（Vacutainer) ＲＴＳＢ３
０mlに生物懸濁液５mlを接種した。次いで、ブロス懸濁
液を複数の２５０μl 凹部を有する蛍光トレーへピペッ
トで入れた。このトレーを蓋で覆い、湿った３５℃培養
器へ入れた。蛍光レベルを測定するために、トレーをフ
ルオロスカン（Fluoroskan)II 蛍光光度計(480-490帯域
瀘波励起フィルター/570 カットオン発光フィルター)
へ入れた。もし96箇所の凹部の平均について５０以上の
蛍光度（fluorescent counts)を有する場合、凹部は陽
性であると考える。各陽性凹部から１００μl を除き、
希釈しそしてＴＳＡ皿へ入れて生物同定を証明した。陰
性凹部を試験して何らの生物も存在しないことを証明し
た。
【００２６】放射分析用（14Ｃ）ＢＡＣＴＥＣＲのヒツ
ジ血液を含まない６Ｂ血液培養ビン 注射器を用いて、14Ｃ培地を含むビンに生物懸濁液５ml
を接種した。ビンを振とう器中で３７℃にて培養し、Ｂ
ＡＣＴＥＣＲ460 読み取り器を用いて時々読み取った。
ビンがもし14Ｃ０2 ０．００７５μCi以上を有する場
合、陽性と考えられた。この放射レベルは増殖指数（Gr
owth Index Number)３０に相当する。ＢＡＣＴＥＣＲビ
ンを、増殖指数が３０以上であるかまたは二つの連続し
た読み取り値の間の変化が１０以上になるまで読み取っ
た。１００μl のサンプルを各ビンから取り出し、生物
同定を証明するために薄くプレーティングした。生物を
有しない対照ビンもまた培養しそして試験品とした。
【００２７】放射分析用(14 Ｃ）ＢＡＣＴＥＣＲのヒツ
ジ血液を有する６Ｂ血液培養ビン 注射器を用いて、脱フィブリン化ヒツジ血液５mlを上記
のように同じＢＡＣＴＥＣＲビンへ加えそして混合し
た。次いで培地／血液混合物５mlを除き、生物懸濁液５
mlをビンへ加えた。ビンを振とう器中で３７℃にて培養
し、ＢＡＣＴＥＣＲ460 読み取り器を用いて時々読み取
った。増殖指数が３０以上になるかまたは二つの連続し
た読み取り値の変化が１０より大きくなるまでＢＡＣＴ
ＥＣＲビンを読み取った。サンプルを各ビンから除き、
プレーティングして、生物同定を証明した。生物を有し
ない対照ビンもまた培養しそして試験品とした。
【００２８】二つの異なった生物、大腸菌 ATCC 25922
およびシュードモナス マルトフィラ（Pseudomonas ma
ltophila）ＢＢＬ#7301(アミカシン８μg/ml含有) を用
いて各系を検査した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】 表２ 大腸菌 ATCC #25922 ＢＡＣＴＥＣＲ ＢＡＣＴＥＣＲ 微量滴定凹部 ビン ビン w/o S.B. w/S.B. ＃陽性試験 １１ ５ ２ 平均検出時間 ８．２５ １２ １３ (時間) 微量滴定凹部の検出時間 １００％ １４５％ １５８％ （パーセントとして） シュードモナス マルトフィラ BBL #7301 （８μｇ／ｍｌアミカシン） ＢＡＣＴＥＣＲ ＢＡＣＴＥＣＲ 微量滴定凹部 ビン ビン w/o S.B. w/S.B. ＃陽性試験 ２ ４ ４ 平均検出時間 １２ ４１．０ ４０．０ （時間） 微量滴定凹部の 検出時間 １００％ ３４２％ ２０８％ （パーセントとして） 大腸菌 次の実験において、全ての陽性微量滴定凹部（限界値は
平均を越える５０蛍光度と等しい）は大腸菌の純粋培養
物を含むことがわかった。様々な陰性凹部からのサンプ
リングの結果、生物が無かった。陽性ＢＡＣＴＥＣＲビ
ンはまた純粋培養物を有していた。
【００３０】明らかなように、微量滴定凹部に対する検
出時間はＢＡＣＴＥＣＲビンよりも約４５〜５８％早
い。
【００３１】シュードモナス マルトフィラ 次の実験において、全ての陽性微量滴定凹部（限界値は
平均を越える５０蛍光度と等しい）はシュードモナスの
純粋培養物を含むことがわかった。様々な陰性凹部から
のサンプリングの結果、生物が存在しなかった。陽性Ｂ
ＡＣＴＥＣＲビンはまた純粋培養物を有していた。
【００３２】明らかなように、検出のためのＢＡＣＴＥ
ＣＲビン時間は、本発明の時間の２００％を越えた。
【００３３】上記で説明した本発明の多くの修正および
変法がその精神および範囲を逸脱することなくおこなわ
れうることは明らかである。記載された明細書の実施態
様は実施例のためのみに与えられており、本発明は特許
請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａは、本発明装置の一例を示す一面透視平面図
である。ｂは、ａの装置の側面図である。ｃは、ａの装
置の格子組式区画部を示す拡大斜視図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 ジェームズ・エフ・モンソニー アメリカ合衆国メリーランド州21209, ボルティモア，ベイリーフ・コート 2310 (72)発明者 デヴィッド・ティー・スティット アメリカ合衆国メリーランド州21053, フリーランド，ゴア・ミル・ロード 20050 (72)発明者 デニス・ハーディー・バロウズ アメリカ合衆国メリーランド州21207, ボルティモア，ウッドグリーン・サーク ル 6555 (56)参考文献 英国公開2106539（ＧＢ，Ａ) 「改訂５版 細菌学実習提要」丸善, （昭和55年４月20日）ｐ550 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/04 C12M 1/24 C12M 1/34

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微生物の増殖を助ける条件下で液状サン
    プルを培養し、前記サンプルを微生物増殖についてモニ
    ターすることを含む液状サンプルにおける微生物の存在
    を確認する方法において、その中に含まれる微生物数が
    下記領域数よりも少ないサンプルを用い、該サンプルを
    多数の独立した領域へ分けて培養を行い、そして微生物
    増殖について各々の領域を別々にモニターすることから
    なる、上記領域の分割をしないで培養した場合よりも、
    迅速にサンプル中の微生物の存在を確認する方法。
  2. 【請求項２】 微生物の増殖を比色法または蛍光分析法
    によりモニターする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 サンプルを物理的境界により複数の別々
    の領域へ分ける請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 サンプルをマイクロタイタープレート上
    の複数の別々の領域へ分ける請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 サンプルを格子組式区画部により複数の
    別々の領域へ分ける請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 サンプルが血液である、請求項１−５に
    いずれか１項に記載の方法。
JP05236715A 1992-09-22 1993-09-22 サンプル中の微生物の検出方法 Expired - Fee Related JP3127064B2 (ja)

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