HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der Nachweis von Mikroorganismen in Proben ist im allgemeinen ein zeitraubendes
und mühsames klinisches Verfahren. In der üblichen Praxis wird eine kleine Menge der
Probe, die als Inokulum bezeichnet wird, auf ein Medium gebracht, das förderlich für das
mikrobielle Wachstum ist. Dann wird das System unter geeigneten Bedingungen inkubiert, und
nach einer angemessenen Zeit werden die Ergebnisse abgelesen (siehe beispielsweise die
Systeme, die in US-PS 4053362, WO-A-91 09970 und US-A-3715280 offengelegt worden sind).
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Die Platten werden täglich genau angesehen und bewertet. In Abhängigkeit vom
vermuteten Typ des Organismus' und der Art des eingesetzten Mediums werden Platten ohne
Wachstum im allgemeinen erst nach 4 bis 8 Tage verworfen. Bei Proben von geringem Volumen
mit einer ziemlich hohen Konzentration an Organismen funktioniert das oben genannte
Verfahren gut (siehe GB-A-2106539). Für den Fall, daß auf Grund einer niedrigen
Konzentration an lebendigen Mikroorganismen eine ziemlich große flüssige Probe gebraucht
wird, wird die Probe mit einem vielfach größeren Volumen an flüssigen Medien verdünnt, und
die Mischung wird inkubiert, um Wachstum nachzuweisen. Bei normalerweise sterilen Proben,
wie Blutproben, die auf das Vorhandensein von lebenden Mikroorganismen untersucht werden,
kann es einen bis mehrere Tage dauern, bevor Wachstum nachgewiesen werden kann. Die
Flaschen werden täglich genau nachgesehen. Flaschen ohne Wachstum werden im allgemeinen
nicht vor 5 bis 7 Tagen verworfen.
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Es besteht also eine reale Notwendigkeit, diese Inkubationszeit zu verkürzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die oben genannte Notwendigkeit wird durch das Verfahren dieser Erfindung
verwirklicht.
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Die Erfindung ist ein Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins eines
Mikroorganismus' in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren das Inkubieren der Probe
unter Bedingungen, die das mikrobielle Wachstum fördern, und das Überwachen der Probe auf
mikrobielles Wachstum umfaßt, gekennzeichnet durch das Unterteilen der Probe in eine
Vielzahl von diskreten Zonen vor der Inkubation, wobei das Unterteilen der flüssigen Probe
so erfolgt, daß erwartet werden kann, daß jede diskrete Zone höchstens eine
koloniebildende Einheit je diskreter Zone enthält, und durch das gesonderte Überwachen jeder Zone
auf mikrobielles Wachstum.
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Kurz gesagt, wird beim Verfahren dieser Erfindung der Probenbehälter in eine
Vielzahl von diskreten Zonen unterteilt, von denen jede gesondert auf mikrobielle
Anwesenheit überwacht werden kann. Wenn eine Probe in diesen Behälter gegeben wird, wird
der Nachweis dadurch vereinfacht, daß das überwachte Volumen gering ist (verglichen mit
der Probe); da der mikrobielle Nachweis ein von der Konzentration abhängiges Phänomen ist,
wird die Geschwindigkeit, mit der das Vorhandensein einer mikrobiellen Kontamination
nachgewiesen werden kann, erhöht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 stellt eine bevorzugte Vorrichtung für die Unterteilung der Probe in eine
Vielzahl von Bereichen durch die Verwendung von ineinandergreifenden Teilern dar: (a)
zeigt die Vorrichtung durch eine Fläche hindurch, (b) stellt eine Seitenansicht dar, und
(c) zeigt ein Detail der ineinandergreifenden Teiler.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung stellt eine praktische Form zur Verbesserung des mikrobiellen
Nachweises und dadurch zur Senkung der erforderlichen Nachweiszeit durch das Unterteilen
der Probe in diskrete Bereiche und deren gesonderte Analyse bereit. Da der Nachweis von
der Konzentration der Bakterien im System abhängig ist, ermöglicht die Analyse jedes
einzelnen Bereichs den schnelleren Nachweis der Bakterien in dem System und das bei einer
geringeren Gesamtkonzentration als bei der Analyse des gesamten Gemischs.
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Um ein Beispiel zu nennen, das BACTEC®-Blutkultur-Analysesystem, das von der
Becton, Dickinson and Company auf den Markt gebracht wird, braucht eine ungefähre
Schwellenkonzentration von 1 · 10&sup6; Organismen/ml, um ein positives Ergebnis zu erbringen.
Wenn ein anfängliches Inokulum, das mit Kulturmedien auf 50 ml verdünnt worden ist, nur
1 CFU (CFU = koloniebildende Einheit) (0,02 CFU/ml) enthalten würde, kann errechnet
werden, daß insgesamt 26 Generationen erforderlich wären, um diese Schwellenkonzentration
zu erreichen. Ein Organismus müßte sich zu mehr als 5 · 10&sup7; Organismen vermehren. Bei
einer durchschnittlichen Verdopplungszeit von 30 Minuten ergibt das eine Nachweiszeit von
13 Stunden (wenn man keinen Zeitverzug vor Beginn des Wachstums annimmt).
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Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel dieser Erfindung wird die 50 ml-Probe
in 100 Bereiche zu je 0,5 ml unterteilt. Um eine effektive Konzentration von 1 · 10&sup6;
CFU/ml zu erreichen, müßte ein solcher Bereich eine tatsächliche Konzentration von 5 · 10&sup6;
CFU/ml haben. Das würde durch 19 Generationen in der den Organismus enthaltenden Zelle
oder in etwa 9,5 Stunden erreicht (wenn man, wie oben, dieselbe Verdopplungszeit und
keinen Zeitverzug annimmt), was einer Einsparung von 3,5 Stunden entspricht. Wenn die 50
ml-Probe in 1000 Bereiche zu je 0,05 ml unterteilt würde, dann wären nur 16 Generationen
oder 8 Stunden erforderlich, um eine Vermehrung jedes Organismus' auf mehr als 1 · 10&sup6;
CFU/ml zu erreichen.
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Es ist leicht erkennbar, daß die Anzahl der untersuchten Bereiche und das Volumen
dieser Bereiche entsprechend den besonderen Anwendungen oder den durch die Ausrüstung
diktierten Beschränkungen variiert werden können. Außerdem sind die Mittel zum Erreichen
dieser Unterteilung unwesentlich, solange die Bereiche wirksam gegeneinander isoliert
sind.
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Fig. 1 zeigt eine bevorzugte Vorrichtung für diese Unterteilung, die eine
Kulturflasche umfaßt, die auf einer Fläche durch ineinandergreifende Teiler in eine
Vielzahl von Bereiche unterteilt ist. Diese bilden diskrete Bereiche in Form von
Parallelepipeden, die jeweils ein identisches Volumen haben. Bei der tatsächlichen
Anwendung muß die Höhe dieser Teiler ausreichend groß sein, um das Volumen während der
Inkubation vollständig aufnehmen zu können, einschließlich einer Inkubation auf einer
Rührvorrichtung, beispielsweise einer Schüttelvorrichtung, sofern eine solche eingesetzt
wird.
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In der Praxis wird das Inokulum in die Flasche eingeführt, die dann auf die Fläche
gelegt wird, die den Teiler enthält, um die Unterteilung der Probe in gesonderte Bereiche
zu erreichen. Dann wird die Flasche inkubiert und mit geeigneten Mitteln auf Wachstum
analysiert. Zu den bevorzugten Analyseverfahren gehören die kolorimetrische,
fluorometrische, radiometrische, nephelometrische und Infrarotanalyse.
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Es muß festgestellt werden, daß die Form und/oder das Volumen der Bereiche variiert
werden können, bevorzugt aber werden eine identische Form und Volumen für die einzelnen
Bereiche.
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Neben dem schnellen Nachweis der Mikroorganismen hat dieses Verfahren zwei weitere
wesentliche Vorteile gegenüber dem bekannten technischen Stand. Der erste besteht darin,
daß dieses Verfahren die Quantitation der Bakteriämie oder Septikämie erlaubt. Der zweite
besteht darin, daß das Verfahren zum einen mit polymikrobiellen Proben kompatibel ist und
das Verfahren zum anderen unter den meisten Umständen aus gemischten Proben stammende,
isolierte Kulturen ergibt, solange der Anfangspegel der Organismen niedrig ist.
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Das Isolator 7,5 Microbial Tube, das von den Wampole Laboratories auf den Markt
gebracht wird, ist eine Vorrichtung und ein System zur Konzentration von Mikroorganismen
aus Blutproben durch Zentrifugieren. Das Verfahren ist sehr Zeit- und arbeitsintensiv, es
schließt ein aus 25 Schritten bestehendes Verfahren und 30 Minuten Schleuderzeit der
Zentrifuge ein. Dieses Verfahren hat breite Anwendung gefunden, zum Teil auch deshalb,
weil es das einzige kommerzielle Verfahren ist, mit dem es möglich ist, die Anzahl der
Organismen in der ursprünglichen Blutprobe zu schätzen. Eine Bewertung dieses Verfahrens
durch Dorn et al. (J. Clin. Micro., 9. S. 391-396) gelangt zu der Schlußfolgerung. Die
Quantitation, die sich nur aus dem Zentrifugationsverfahren ergibt, erwies sich bei
verschiedenen Gelegenheiten als nützlich bei der Unterscheidung zwischen einer
opportunistischen Infektion in Bezug auf einen Hautkontaminanten und bei der Beurteilung
der Wirksamkeit der antimikrobiellen Therapie.", Sullivan et al. (Pediatrics. 69. 699-702)
haben nachgewiesen, daß die Größenordnung der Bakteriämie bei Kindern mit der Schwere der
klinischen Erkrankung im Zusammenhang steht.
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Bei dem Verfahren dieser Erfindung ist die Schätzung der Anzahl der Mikroorganismen
in der ursprünglichen Probe so einfach wie das Zählen der Anzahl der Bereiche, in denen
Wachstum sichtbar geworden ist. Wenn die Anzahl der positiven Vertiefungen im Verhältnis
zur Gesamtzahl der Vertiefungen gering ist, dann kann erwartet werden, daß diese Schätzung
sehr genau ist. Wenn sich die Anzahl der positiven Vertiefungen erhöht, werden die
Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Schätzung schlechter. Die meisten Probentypen aber,
bei denen der größte Vorteil aus einem schnellen Nachweis gezogen werden kann,
beispielsweise Blut, weisen im allgemeinen Mikroorganismen-Zählungen von weniger als 10
CFU/ml auf. Nach der Verdünnung mit einem Medium wären weniger als 10% der Vertiefungen
positiv.
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Außerdem stellt bei den meisten Systemen das Vorhandensein von mehr als einem Typ
von Mikroorganismus' in der ursprünglichen Probe ein großes Problem dar. Das ist in
Blutkulturen ein wichtiges und häufiges Ereignis. Bei bis zu 18% der septischen Ereignisse
wurde über eine polymikrobielle Bakteriämie berichtet und mit einer höheren Sterblichkeit
in Verbindung gebracht. In dem Fall, daß die gesamte Probe in eine Flasche gegeben wird,
überwuchern schnell wachsende Organismen, wie E. coli, schon sehr früh jedwede anderen
vorhandenen Organismen. Der (die) andere(n) Organismus (Organismen) wird (werden) entweder
nicht nachgewiesen, oder es sind zusätzliche 18 bis 24 Stunden notwendig, um isolierte
Kolonien zur Identifizierung und Suszeptibilitätsprüfung zu vermehren.
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Bei den Verfahren dieser Erfindung ist es, wenn eine geringe Anzahl von Organismen
vorhanden sind, sehr wahrscheinlich, daß jeder Organismus in eine gesonderte Vertiefung
gelangt. Wenn mehrere Spezies vorhanden sind, kann daher erwartet werden, daß jede
positive Vertiefung das Ergebnis eines einzelnen Organismus' und folglich eine reine
Kultur ist. Wenn eine Spezies (wie E. coli) die ursprüngliche Probe dominiert, könnte
erwartet werden, daß sie die Kultur in den meisten positiven Vertiefungen bildet; sie
würde jedoch nicht das Wachstum der anderen Spezies in den verbleibenden positiven
Vertiefungen beeinträchtigen oder maskieren. Folglich wird der Nachweis von mehreren
Mikroorganismen stark vereinfacht.
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Außerdem wird in den Fällen, in denen die Verdopplungszeit für den Mikroorganismus
lang ist, z. B. bei Mycobakterien, wie den in Verbindung mit Tuberculose vorkommenden, die
Nachweiszeit stark verkürzt. Das ermöglicht eine schnellere Diagnose und erlaubt einen
früheren Behandlungsbeginn.
BEISPIELE
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Die folgenden Beispiele stellen bestimmte bevorzugte Ausführungsbeispiele dieser
Erfindung dar, sind aber nicht als illustrativ für alle Ausführungsbeispiele zu
betrachten.
BEISPIEL 1
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Um die Vorteile des Verfahrens dieser Erfindung zu veranschaulichen, wurde eine
Reihe von Berechnungen durchgeführt, um die Zeit zu bestimmen, die zum Erreichen einer
Schwellenkonzentration von 1 · 10&sup6; CFU/ml für eine 8 ml-Aliquote gebraucht wird, die in
Kulturmedien auf 80 ml verdünnt worden ist, wobei eine Verdopplungszeit von 20 oder 30
Minuten und ein Zeitverzug von 30 Minuten (1 Tag im Fall von 12 Stunden) angenommen
werden. Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt.
TABELLE I
ANMERKUNGEN
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a. Konventionelles System. Einzelmessung
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b. Erfindungsgemäßes System unter Verwendung einer Vorrichtung mit einhundertundzwanzig
(120) Unterteilungen zu 0,666 ml
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Wie gezeigt wird, erbringt das System dieser Erfindung signifikante
Zeiteinsparungen, besonders dann, wenn die anfängliche Organismenkonzentration verdünnt
ist oder wenn die Verdopplungszeit lang ist.
BEISPIEL 2
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Um die Schnelligkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu
kommerziellen bakteriellen Nachweissystem bestimmen zu können, wurde das System unter
Verwendung einer Mikrotiter-Schale reproduziert. Die drei eingesetzten Systeme werden
unten beschrieben.
FLUORESZENZ-MIKROTITER-SCHALE (ERFINDUNG)
VORBEREITUNG DER SCHALE:
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Die Fluoreszenzverbindung tris-4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolinruthenium-(II)-
chlorid (Ru(DPP)&sub3;Cl&sub2;) wurde unter Anwendung des Verfahrens von Watts und Crosby (J. Am.
Chem. Soc., 93. 3184 (1971)) synthetisiert. Eine Gesamtmenge von 3.6 mg der Verbindung
wurde in 2,0 ml Dimethylsulfoxid (D-5879, Sigma Chemical, St. Louis. MO) aufgelöst, und
die resultierenden Lösungen wurden dann langsam, unter Rühren, 1300 ml einer
silikongummibildenden Lösung (Water Based Emulsion #3-5024. Dow Corning, Midland. MI) zugesetzt.
Anschließend wurde eine 35 ul-Aliquote des Gemischs in jede Vertiefung einer 96
Vertiefungen umfassenden, weißen Mikrotiter-Schale mit flachem Boden (#011-010-7901,
Dynatech, Chantilly, VA) dissertiert, und die Systeme wurden anschließend über Nacht in
einem Inkubator mit geringer Feuchtigkeit (weniger als 25% relative Feuchtigkeit) bei 60ºC
geheilt. Nach dem Heilen wurden die Schalen entweder durch Tränken oder Füllen und Leeren
jeder Vertiefung mit jedem der folgenden Reagentien mehrmals gewaschen: a) absolutem
Ethanol, b) 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2, c) heißem destilliertem Wasser (etwa 45ºC)
und destilliertem Wasser bei Umgebungstemperatur.
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Dreißig Milliliter Vacutainer®-TSB wurden mit 5 ml der Organismussuspension
geimpft. Die Bouillonsuspension wurde dann in eine Fluoreszenz-Schale mit einer Vielzahl
von 250 ul-Vertiefungen pipettiert. Die Schale wurde mit einem Deckel bedeckt und in einen
befeuchteten, 35ºC warmen Inkubator gegeben. Um die Fluoreszenzpegel zu messen, wurde die
Schale in ein Fluoresenzmeßgerät Fluoroskan II (480-490 Bandpaßfilter/570 Kanten-
Emissionsfilter) gegeben. Eine Vertiefung wurde als positiv betrachtet, wenn sie um mehr
als 50 Fluoreszenz-Zähler über dem Mittel der 96 Vertiefungen lag. Aus jeder positiven
Vertiefung wurden 100 ul entnommen, verdünnt und auf TSA-Platten plattiert, um die
Identifikation der Organismen zu verifizieren. Aus den negativen Vertiefungen wurden
Proben genommen, um zu bestätigen, daß keine Organismen vorhanden waren.
RADIOMETRISCHE (¹&sup4;C) BLUTKULTURFLASCHE BACTEC® OHNE SCHAFSBLUT
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Unter Verwendung einer Spritze wurde die Flasche, die ¹&sup4;C-Medium enthielt, mit 5
ml der Organismussuspension geimpft. Die Flasche wurde bei 37ºC auf einem Rüttler
inkubiert und in Intervallen unter Verwendung eines BACTEC®-460-Ablesegeräts abgelesen.
Eine Flasche wurde als positiv betrachtet, wenn mehr als 0,0075 Mikrocurie an ¹4CO&sub2;
vorhanden waren. Dieser radiometrische Pegel entspricht einer Wachstumsindexzahl von 30.
Die BACTEC®-Flaschen wurden so lange abgelesen, bis die Wachstumsindexzahl über 30 lag
oder die Änderung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ablesungen mehr als 10 betrug. Aus
jeder Flasche wurden Proben zu 100 ul entnommen und plattiert, um die Identifikation der
Organismen zu verifizieren. Außerdem wurden auch Kontrollflaschen ohne Organismen
inkubiert und Proben aus diesen entnommen.
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RADIOMETRISCHE (¹&sup4;C) BLUTKULTURFLASCHE BACTEC® MIT SCHAFSBLUT
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Unter Verwendung einer Spritze wurden derselben BACTEC®-Flasche wie oben 5 ml
defibriniertes Schafsblut zugesetzt und gemischt. Dann wurden 5 ml des Medium-Blut-
Gemischs entnommen und der Flasche 5 ml der Organismussuspension zugesetzt. Die Flasche
wurde bei 37ºC auf einem Rüttler inkubiert und in Intervallen unter Verwendung eines
BACTEC®-460-Ablesegeräts abgelesen. Die BACTEC®-Flaschen wurden so lange abgelesen, bis
die Wachstumsindexzahl über 30 lag oder die Änderung zwischen zwei aufeinanderfolgenden
Ablesungen mehr als 10 betrug. Aus jeder Flasche wurden Proben entnommen und plattiert,
um die Identifikation der Organismen zu verifizieren. Außerdem wurden auch
Kontrollflaschen ohne Organismen inkubiert und Proben aus diesen entnommen.
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Jedes System wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen Organismen, Escherichia
coli ATCC #25922 und Pseudomonas maltophila BBL #7301 (die 8 ul/ml Amikacin enthielten),
untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle II dargestellt.
TABELLE II
Pseudomonas maltophila BBL #7301
mit 8 ug/ml Amikacin
E. coli
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Bei der anschließenden Untersuchung wurde festgestellt, daß alle positiven
Mikrotiter-Vertiefungen (Schwellenwert gleich 50 Fluoreszenz-Zähler über dem Mittel) reine
Kulturen von E. coli enthielten. Die Probennahme aus verschiedenen negativen Vertiefungen
ergab keine Organismen. Auch die positiven BACTEC®-Flaschen enthielten reine Kulturen.
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Wie gezeigt wird, ist die Zeit bis zum Nachweis für die Mikrotiter-Vertiefungen
um etwa 45 bis 58% kürzer als die bei den BACTEC®-Flaschen.
Pseudomanas maltophila
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Bei der anschließenden Untersuchung wurde festgestellt, daß alle positiven
Mikrotiter-Vertiefungen (Schwellenwert gleich 50 Fluoreszenz-Zähler über dem Mittel) reine
Kulturen von Pseudomanas enthielten. Die Probennahme aus verschiedenen negativen
Vertiefungen ergab keine Organismen. Auch die positive BACTEC®-Flasche enthielt reine
Kulturen.
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Wie gezeigt wird, beträgt die Zeit bis zum Nachweis bei den BACTEC®-Flaschen mehr
als 200% der Zeit die bei der Erfindung gebraucht wird.
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Es ist offensichtlich, daß viele Modifikationen und Veränderungen dieser Erfindung,
wie sie oben ausgeführt worden ist, vorgenommen werden können. Die beschriebenen
speziellen Ausführungsbeispiele werden nur als Beispiele gegeben.