DE2823916A1 - Verfahren zur selektiven bestimmung von lebensfaehigen soma- und mikroben-zellen - Google Patents

Verfahren zur selektiven bestimmung von lebensfaehigen soma- und mikroben-zellen

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Description

51 500-Dr. T München, den 31. Mai 1978
Anmelder: 1. Seppo Kolehmainen, Ganzenstraat 11,
Zolder, Belgien
2. Veikko Tarkkanen, Breulsweg 1, Wylre, Niederlande
Verfahren zur selektiven Bestimmung "von lebensfähigen Soma- und Hikroben-Zeilen
Die Erfindung betrifft die selektive Bestimmung der Anzahl oder physiologischen Aktivität von verschiedenen Arten von lebensfähigen bzw. lebenden Zellen durch Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln; dieses Verfahren beruht auf der selektiven Freisetzung von Nucleotiden aus verschiedenen Zeil-Typen und der anschließenden Bestimmung der Nukleotide durch Chemo- oder Biolumineszenz.
Die Bestimmung (Messung) von lebensfähigen (lebenden) Mikroben- und Soma-Zellen (Nicht-Mikroben-Zellen) ist in medizinischen Laboratorien, in der Veterinärwissenschaft, in der Nahrungsmittelhygiene, in der Fermentationsindustrie und bei Umweltuntersuchungen von großer Bedeutung. Bakterien, Hefen und Pilze werden bestimmt entweder durch Auszählung der Kolonien in einem Wachstumsmedium oder unter Verwendung von Instrumenten, wie z. B. eines Mikroskops, eines Turbidometers, eines Refraktometers und dergleichen. Soma-Zellen (somatische Zellen bzw. Eörperzellen) werden mit Teilchen-Countern, wie z. B. dem Coulter Counter (von der Firma Coulter Electronics, Ltd.), und mit optischen Apparaturen auf Laserbasis und Fluoreszenz-Apparaturen oder durch indirekte Messungen an Hand der Menge der Stoffwechselprodukte, wie z. B. der-Nukleotide, oder mit dem Mikroskop ausgezählt. Zur Durchführung dieser Verfahren benötigt
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man entweder eine komplizierte, teure Apparatur oder sie sind ungenau aufgrund der Störung durch nicht-zellulare Teilchen oder Nicht-Soma-Zeilen. Außerdem machen die meisten konventionellen Verfahren keinen Unterschied zwischen toten und lebensfähigen (lebenden) Zellen.
Bei den konventionellen Verfahren war es bisher schwierig oder zeitraubend, verschiedene Typen von Zellen, wie z. B. Soma-Zellen und Bakterien, in einer beide Zeil-Typen enthaltenden Probe selektiv zu bestimmen. Außerdem sind die konventionellen Verfahren, insbesondere in der Mikrobiologie, langsam, da die Ergebnisse erst nach einem oder mehreren Tagen erhalten werden. Die Ergebnisse in klinischen Tests sollten jedoch so schnell wie möglich vorliegen, um den Patienten richtig behandeln zu können, und in der Lebensmittelhygiene ist es ebenfalls wichtig, die bakterielle Verunreinigung von Produkten so schnell wie möglich zu bestimmen, so daß das Verderben von Rohmaterialien und von behandelten Lebensmitteln vermieden werden kann. Deshalb ist man seit langem auf der Suche nach schnellen Alternatiwerf ahren zu der konventionellen Auszählung der Kolonien und der Auszählung von Soma-Zellen.
Die Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Bestimmung von Adenosintriphosphat (ATP) (vergleiche die TJS-Pat ent schrift 3 745 090) ist ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Soma- und Bakterienzellen in einer Probe. Bei diesem Verfahren wird die Menge des gemessenen (bestimmten) ATP in die Anzahl der Zellen umgewandelt, da der ATP-Gehalt eines spezifischen Zellentyps relativ konstant ist. In entsprechender Weise kann eine andere Biolumineszenz-Bestimmung, z. B. die Photobakterium-Biolumineszenz-
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Reaktion, zur Bestimmung der Anzahl von lebensfähigen (lebenden) Zellen mit Hilfe von Flavinmononucleotid (FMIT) und der reduzierten Form von Nikotinamindinucliotid (NADH) verwendet werden.
Zur Bestimmung der Anzahl von Bakterien in einem Nahrungsmittel und in Körperflüssigkeiten, wie Milch, Urin, Blut, der zentralen Rückenmarksflüssigkeit, Speichel, müssen das ATP, FMN und NADH in Soma-Zellen, wie Blut-; Muskel- und Epithel-Zellen, eliminiert werden. Auch muß der störende Effekt von Nucleotiden aus Mikroben-Zellen vermieden werden, um Soma-Zellen genau bestimmen (messen) zu können. Die Anwendung von Biolumineszenzverfahren zur Bestimmung von verschiedenen Typen von Zellen war bisher begrenzt wegen des Mangels an geeigneten Probenvorbehandlungsverfahren, welche die getrennte Bestimmung von Nucleotiden, Soma-Zellen und Mikroben-Zellen ermöglichen·
Die selektive Bestimmung von Soma- oder Mikroben-Zellen ist auf vielen Gebieten der Wissenschaft, der Medizin, der Hygienekontrolle und der industriellen Qualitätskontrolle erforderlich. Auf diesen Gebieten liegen die meisten Proben unter den folgenden Meßbedingungen vor:
(1) Bestimmung (Messung) von Soma-Zellen nur in Gegenwart von Mikroben-Zellen;
(2) Bestimmung (Messung) der Gesamtzellen in der Probe;
(3) Bestimmung (Messung) von Mikroben-Zellen in Gegenwart von anderen Zellen.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, diese Bestimmungen bzw. Messungen schnell, einfach und genau
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durchzuführen. Diese verschiedenen Alternativen sind in den weiter unten beschriebenen Beispielen erläutert.
Prinzip der selektiven Bestimmung bzw. Messung von Soma- und Mikroben-Zellen
(A) Vorbehandlung^der Probe
Es ist eine bekannte Tatsache, daß oberflächenaktive Mittel zum Auflösen von einzelnen Zellen verwendet worden sind, um ATP von Soma-Zellen zu eliminieren (vergleiche die US-Patentschrift 3 74-5 090), es ist nun aber gelungen, ein Verfahren zur selektiven Freisetzung von Nucleotiden durch die Zellwand von verschiedenen Typen von Zellen mit spezifischen oberflächenaktiven Mitteln zu entwickeln, um die Konzentration der Nucl otide in lebenden Soma- oder Mikroben-Zellen zu bestimmen (messen) oder die Anzahl von lebensfähigen (lebenden) Zellen in der Probe zu bestimmen.
Bei der Untersuchung des Stoffwechsels der Zellen in der Biochemie, in der Medizin und bei Untersuchungen an lebenden Organismen spielen die Nucleotid-Konzentrationen eine wichtige Rolle. Die meisten der bekannten 2000 Enzyme verwenden Nucleotide, wie Adenosin und andere Nucleotidphosphate (ATP, ADP, AMP, GTP, ITP und dergleichen), Flavinmononucle.otide (FMN, FMNH2), Nikotinamidadenindinucleotide (NAD, NADH, NADPH) als Substrat. Bisher war es schwierig, Nucleotide aus Zellen freizusetzen, ohne die Zellen durch die Enzyme zu zerstören oder ohne die Nucleotide durch die Behandlung zu beeinflussen (zu beeinträchtigen). Die bisherigen Verfahren sind sowohl umständlich als auch teuer, langsam, ungenau oder schwierig auf reproduzierbare Weise
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durchzuführen. Häufig wird durch das Trennverfahren die Probe verdünnt, es werden Chemikalien eingeführt, welche die Analyse der Nucleotide stören, oder es werden einfach zusätzliche Fehlerquellen durch die zahlreichen Manipulationen eingeführt. Zu konventionellen Verfahren gehören das Aufbrechen der Zellen auf mechanischem oder chemischem Wege und die Inaktivierung von Enzymen durch Einfrieren, Erhitzen oder auf chemische Weise; und die nachfolgende Abtrennung der Nucleotide von der Probe durch Ausfällung, Flüssigchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Flüssigextraktion mit organischen Lösungsmitteln und andere Verfahren.
Erfindungsgemäß werden die Nucleotide aus einzelnen Zellen oder einer Einzelschicht von Zellen durch die Wände freigesetzt, indem man die Zellwände mit oberflächenaktiven Mitteln durchlässig macht. Nucleotide mit einer geringen Molekülgröße können nach einer Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln die Zellwand durchdringen, Enzyme mit einer großen Molekülgröße durchdringen jedoch nicht die Zellwand und bleiben im Innern der Zelle. Dadurch ist es möglich, Nucleotide in die extrazelluläre Flüssigkeit freizusetzen, ohne die Nucleotide durch zelleigene Enzyme zu zerstören. Rote Blutkörperchen (Erythrocyteen) werden durch die oberflächenaktiven Mittel aufgebrochen, das freigesetzte ATP kann jedoch noch innerhalb einer Minute, vorzugsweise innerhalb von 15 Bekunden nach der Zugabe des oberflächenaktiven Mittels genau bestimmt (gemessen) werden. Die oberflächenaktiven Chemikalien können an Hand ihrer spezifischen Eigenschaften, beispielsweise an Hand der Alkylkettenlänge der Verbindung, des nicht-ionischen und ionischen Charakters, des Alkoxylierungsgrades (des Grades der
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Lipophilie oder Hydrophilie) und der Anwesenheit von speziellen Radikalen bzw. Resten, wie z. B. quaternären Ammoniumsalzen, ausgewählt werden, wodurch die Freisetzung von Nucleotiden aus verschiedenen Typen von Zellen selektiv erfolgen kann. Die Folge davon ist, daß Nucleotide, wie Adenosinphosphate, selektiv aus Soma-Zellen (Nicht-Mikroben-Zellen) mit Hilfe von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln freigesetzt werden können, während ionische oberflächenaktive Mittel zur Freisetzung von Nucleotiden aus allen Typen von Zellen verwendet werden. Diese selektive Freisetzung von Nucleotiden ist ein Vorteil gegenüber den bisher angewendeten Verfahren, bei denen keine selektive Extraktion zwischen verschiedenen Typen von Zellen durchgeführt werden kann. Ein weiterer wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Freisetzung von Nucleotiden aus Einzelzellen schnell, innerhalb von 10 Sekunden, erfolgt. Außerdem wird nur eine Konzentration des oberflächenaktiven Mittels von 0,02 bis 0,1 % benötigt, um die Zellwand durchlässig zu machen und Nucleotide freizusetzen, so daß die Probe nicht durch die Zugabe des Nucleotid-Freisetzungsreagens verdünnt wird. Die oberflächenaktiven Mittel können so gewählt werden, daß ihre Anwesenheit die Analyse der Nucleotide nicht stört.
(B) Messung
Eine bekannte Anwendung der Messung bzw. Bestimmung der Konzentration von Nucleotiden, wie z. B. Adenosintriphosphat (ATP) und Flavinmononucleotid (FMN),ist die Ausnutzung der Biolumineszenz. Mit Hilfe der Biolumineszenz kann eine extrem niedrige Konzentration, z. B. von 10" ^ M Nucleotiden, bestimmt werden (vergleiche die US-Patentschrift 3 74-5 090). Diese hohe Empfindlichkeit ermöglicht die
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Messung "bzw. Bestimmung der Konzentration von Nucleotiden, wie ATP, in einer einzelnen lebenden Zelle. Dieses Analysenprinzip findet zahlreiche Anwendungen bei der Bestimmung bzw. Messung der Anzahl von Zellen in einer Probe. Die Biolumineszenz-Messung erfolgt sehr schnell und empfindlich, so daß dieses Meßverfahren einen attraktiven Weg der schnellen Messung von Bakterien-, Hefe-, Schimmelpilz- und Soma-Zellen in der Hygiene, Lebensmittelindustrie, Mikrobiologie, klinischen Chemie, Virologie, Gewebekultur, Veterinärwissenschaft und allen Gebieten der Lebenswissenschaft darstellt. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, schnell, einfach, reproduzierbar und vollständig Nucleotide aus allen Zellen-Typen freizusetzen, so daß es durch Anwendung der vorliegenden Erfindung möglich ist, Biolumineszenz Messungen schneller, wirksamer und selektiver durchzuführen als dies bisher mit den konventionellen Extraktionsverfahren möglich war.
Beispiel für eine selektive Messung bzw. Bestimmung von Soma- und Mikroben-Zellen
Die Auszählung von lebenden Soma-Zellen ist in vielen biologischen Flüssigkeiten, wie Blutproben (Erythrocyten, Leucocyten und Plättchen) und Milch (Leucocyten für die Mastitis-Bestimmung) wichtig. Normalerweise erfolgt die Auszählung mittels elektrischer Teilchen-Counter, z. B. mit Instrumenten, die auf der Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des Mediums basieren, wenn Zellen eine schmale Öffnung passieren, durch direkte mikroskopische Auszählung oder durch Anwendung der Ausfällung von Nucleotiden oder
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durch Messung der Nucleotid-Extinktion (California Mastitis Test und DNA-Extinktion für Leucocyten). Diese Verfahren sind entweder subjektiv, zu ihrer Durchführung benötigt man teure Apparaturen oder sie sind mit Fehlern behaftet aufgrund von anderen Teilchen als Zellen. Die Bestimmung bzw. Messung von Soma-Zellen in biologischen Flüssigkeiten durch die Biolumineszenz ist sowohl empfindlich als auch schnell und genau. Für die Auflösung von Soma-Zellen zur Eliminierung des nicht-bakteriellen ATP durch ein Enzym, Apyrase genannt, wurde da3 nicht-ionische oberflächenaktive Detergens Triton X-100 (eingetragenes Warenzeichen der Firma Rohm und Haas Co., Philadelphia, Pensylvania/USA) vorgeschlagen C vergleiche die US-Patentschrift 3 7*5 09Ql Triton X-100 wurde jedoch bisher nicht vorgeschlagen für die Verwendung zur Freisetzung von ATP zur Bestimmung des ATP-Gehaltes in Soma-Zellen. Außerdem senkt Triton X-100 in einer Konzentration von 0,1 % die Lichterzeugung der Biolumineszenzreaktion um etwa 27 % und Triton X-100 setzt aus einigen grampositiven Bakterien kein ATP frei. Es ist nun gelungen, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem spezifische oberflächenaktive Mittel verwendet werden, um quantitativ und selektiv ATP aus Soma-Zellen freizusetzen, ohne daß die Biolumineszenz-Reaktion gehemmt (inhibiert) wird, um den ATP-Gehalt in Soma-Zellen zu bestimmen (zu messen). Zu solchen nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln gehören Chemikalien, wie äthoxylierte Alkylphenole, Octylphenole, welche die chemische Formel haben
und Fettsäurepolyglykoläther mit der chemischen Formel
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-C-C-O- (CH2CH2O)xH
worin R eine Alkylgruppe oder eine Fettsäure und χ 2 bis 30 Moleküle Äthylenoxid bedeuten. Mikrobielles ATP stört die Messung nicht, da nicht-ionische oberflächenaktive Mittel so gewählt werden können, daß sie kein ATP aus Mikroben-Zellen freisetzen. Die selektive Freisetzung von Nucleotiden, wie ATP, aus Soma-Zellen wird durchgeführt durch Zugabe eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels zu der Probe in einer Konzentration von 0,01 bis 2 %, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 % des Probenvolumens. Diese Konzentration an nicht-ionischem oberflächenaktivem Mittel, wie äthoxylierten Alkoholen und Phenolen, welche die Eiolumineszenz-Reaktion nicht stört, setzt aus Soma-Zellen Nucleotide in die extrazelluläre Flüssigkeit, wie z. B. Wasser, einen Puffer oder eine Salzlösung,frei innerhalb von 10 Sekunden nach dem Mischen des oberflächenaktiven Mittels mit der Probe. Die Nucleotide sind in der extrazellulären Flüssigkeit ausreichend stabil, wenn die Freisetzung von Enzymen vermieden wird. Die Nucleotid-Konzentration kann sofort oder nach ein paar Minuten nach der Zugabe des oberflächenaktiven Mittels bestimmt (gemessen) werden, da jedoch einige Nucleotide, wie z. B. Adenosinphosphate, autoxidiert oder durch Bakterien in der Probe aufgebrochen werden können, ist es besser, die Konzentration der Nucleotide innerhalb von 5 Minuten nach der Zugabe des oberflächenaktiven Mittels zu bestimmen (zu messen). Nachdem die Zellwand mit einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel durchlässig gemacht worden ist, wandern die kleinen Moleküle in Richtung des niedrigeren Konzentrationsgradienten, ATP und andere Substrate diffundieren aus den Zellen heraus, bis die Konzentration innerhalb und außerhalb der Zellen gleich
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ist, was zu einer praktisch, vollständigen Freisetzung von
ATP (> 99 °/o) führt, wenn das Zellvolumen weniger als 1 %
des Gesamtvolumens der Probe beträgt. Nachdem die kleinen
Moleküle freigesetzt worden sind, beginnen die zelleigenen Enzyme die Substrate, die im Innern der Zellen verblieben
sind, zu verbrauchen. Wenn man die Proben mehr als 5 Minuten lang vor der Messung stehen läßt, beginnt die Konzentration der Substrate, wie ATP, im Innern der Zellen abzunehmen und die Substrate, die aus den Zellen freigesetzt
worden sind, beginnen wieder in die Zellen zurückzudiffundieren (in Richtung des niedrigeren Konzentrationsgradienten). Dadurch kann die Gesamtkonzentration innerhalb von Minuten um 10 bis 40 % verringert werden. Deshalb sollte
die Messung innerhalb von 5 Minuten nach Anwendung des
oberflächenaktiven Mittels durchgeführt werden. Die Konzentration der Zellen darf nicht mehr als 10 Millionen,vorzugsweise nicht weniger als 1 Million Zellen pro ml betragen, um eine vollständige und sofortige Freisetzung der
Substrate aus den Soma-Zellen zu gewährleisten.
Bestimmung bzw. Messung von ATP in Leucocyten in Milch.
An Hand der Bestimmung von ATP in Leucocyten in Frischmilch, wurden die Wirkungsgrade von verschiedenen Nucleotid-Extraktionsverfahren miteinander verglichen. Die Ergebnisse
zeigten, daß die Verwendung eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels (von äthoxyliertem Phenol) bessere Ergebnisse (Tabelle I) als die konventionellen Verfahren ergab: Perchlorsäure-Extraktion (1,0 N) und 1,5 bis 10 Minuten langes Kochen in 20 mM Tris(Trishydroxymethylaminomethan) - 2 mM EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure)-Puffer.
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Die Freisetzung von ATP war vollständig und die Verwendung von äthoxyliertem Alkohol in einer Konzentration von 0,1 % des Gesamtvolumens der Probe störte die Biolumineszenz-Reaktion nicht. Die ATP-Konzentration wurde unter Verwendung eines Lumineszenz-Analysators mittels des Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagens bestimmt (gemessen).
Tabelle I
Intensität von durch ATP und durch die Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reaktion in 1-ml-Proben Frischmilch, die lebende Leucocyten enthielt, emittiertem Biolumineszenz-Idclit :
(A) Mit 0,1 ml M Perchlorsäure und neutralisiert mit 0,1 ml 1M KOH
(B) Mit 9 ml siedendem 0,02 M Tris - 0,002 M EDTA-Puffer, pH 7,4 und
(C) Mit 1 ml 0,2 %igem äthoxyliertem Alkohol.
In jedem Falle wurden drei 0,1 ml-Anteile der Proben gemessen.
ABC
Perchlorsäure- Tris-EDTA- nicht-ionisches Extraktion Extraktion oberflächenaktives Mittel (äthoxyliert e s Alky !phenol)
Relative Lichteinheiten
1480
36200
55300
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Bei einer Untersuchung von verschiedenen Extraktionsverfahren für ATP aus Blutzellen (P. Tarkkanen, R. Driesch und H. Greiling, "A rapid enzymatic micromethod for the determination of intracellular and extracellular ATP and its clinical-chemical applications" in "Analytische Chemie", 290 (2), 180, 1978) wurde das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel (NRS*, ein Nucleotid-Freisetzungsreagens für Soma-Zellen) mit dem siedenden Tris-Verfahren und mit einer Äthanol-EDTA (0,1 M) (9:1)-Mischung verglichen. Die Extraktion von ATP mit NRS war schnell, quantitativ (96,8 bis 102,2 °/o) und ergab ATP-Werte, die mit denjenigen der konventionellen Verfahren (r = 0,92 bis 0,93) gut übereinstimmten. NRS war einfacher, schneller und reproduzierbarer. Das dabei erhaltene Ergebnis ist auf der beiliegenden Zeichnung (Pig, 1) dargestellt.
Ein großer Vorteil der Verwendung von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln ist der, daß einige von ihnen die enzymatisch^ Aktivität des die Biolumineszenz katalysierenden Enzyms Luciferase nicht stören, so daß diese nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel mit den Biolumineszenz-Reagentien gemischt werden können. Es ist dadurch möglich, alle Chemikalien, die für die Freisetzung von ATP aus Zellen (nicht-ionische oberflächenaktive Mittel) und für die "erzeugung der Biolumineszenz-Lichtreaktion (Luciferase Substrate, Ensymaktivetoren und Stabilisatoren, Mg-SaIc und Iuffer) erforderlich sind, alle in einen einzigen Reagens γι vereinigen. Erfindungsgemäß find die Herstellung bzw. Vorbehandlung der Probe und die Bestimmung (Messung) extrem einfach und leicht a-utomatieierbar. ßoma-Zellen können »it einem manuellen Ine tr 1Jm ent innerhalb von weniger als
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30 Sekunden gemessen werden einschließlich der Pipettierung der Probe, des Einsetzens der Probe in den Photometer, des Zugebens des Reagens und des Erhaltes des relativen Lichtwertes.
( 2 ) Mgssung_von_Proben_mit_einerJ)bεχζahl_von_Mikroben-Zellen
Proben, die hauptsächlich Hikroben-Zeilen enthalten, wie z. B. aktivierter Schlamm und Mikroben-Kulturen, können ohne vorherige Eliminierung des ATP von Nicht-Mikroben-Zellen gemessen werden. Die Zellwand der Bakterien enthält ein Polymeres, Peptidoglycan genannt, welches die Zellwand gegen äußere Chemikalien und physikalische Störungen sehr beständig macht. Deshalb ist es schwieriger, die Bakterienzellwand durchlässig zu machen, als bei Soma-Zellen. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Zellwand von Bakterien so zu beeinflussen, daß sie für Substanzen mit einer verhältnismäßig kleinen Molekülgröße, wie Nucleotide, durchlässig wird. Diese Durchlässigkeit wird erzielt durch Behandlung der Bakterien mit ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wobei die besten Typen solche sind, die quaternäre Ammoniumsalze und eine Fettsäure mit einer Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen enthalten, es kann aber auch Jede beliebige Kettenlänge von Kohlenstoffatomen zwischen 4· und 22 verwendet werden.
Ithoxylierte Amine, äthoxylierte Diamine, Polyäthylenglykolester von Fettsäuren, äthoxylierte Alkohole mit der folgenden chemischen Struktur
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[CH2CH2O)xH
EN
(CH2CH2O) H, oder
(CH2CH2O)2H
/
R-F -CHp - CHp- CHpN
(CH2CH2O) H, oder
II /
RCN
(CH) oder
RCO —(CH2CH2O)xH
worin R eine von Fettsäuren mit 1 "bis 18 Kohlenstoffatomen abgeleitete Fettalkylgruppe und x, y und ζ die Anzahl der Äthylenoxidgruppen innerhalb des Bereiches von 2 biß 50 bedeuten,
und quaternäre Salze von äthoxylierten Aminen mit der chemischen Formel
R
R1 N - (CH2CH2O)xH + y
R2
worin R, R1 und R2 Alkyl-, äthoxylierte Alkohol-, Alkylaryl-, äthoxylierte Amin-, Alkylarylalkyl-, Äthoxyalkyl- oder Hydroxyalkylgruppen und R, eine Methyl- oder Äthylgruppe, χ eine Zahl von 2 bis 15 und y beispielsweise
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Halogen, Sulfat, Sulfit oder Phosphat "bedeuten.
Ein solches oberflächenaktives Mittel kann auch ein fluorierter Kohlenwasserstoff oder Ilynminchlorid ' sein.
Ein quaternäres Ammoniumsalz ist nicht erforderlich, da kationische äthoxylierte Amine auch aus Bakterienzellen Nucleotide freisetzen, quaternäre Ammoniumsalze von äthoxylierten Aminen mit einer Kohlenstoffkettenlänge von 12 arbeiten jedoch schneller und werden durch Puffer, den pH-Wert und andere Agentien, die möglicherweise in den Mikroben-Proben vorliegen, weniger beeinflußt. Eine Mischung aus 5 bis 95 % eines kationischen äthoxylierten Amins und 5 "bis 95 % eines quaternären polyäthoxylierten Amins kann zur Erzielung einer schnellen Nucleotid-Freisetzung aus Zellen verwendet werden, ohne daß dadurch die in den Biolumineszenzsystemen verwendeten Luciferase-Enzyme gestört oder inaktiviert werden.
Die Geschwindigkeit der Luminesζens-Lichtreaktion kann bei Verwendung von Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-ßeagentien geändert werden durch Änderung des Verhältnisses zwischen dem äthosylierten Amin mit einer Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen TJiiö äem qiiateruären ätiaoiijliertsn Amin mit einer Eettealäiige tgta 12 Kohlenstoffatomen* Die Freisetzung von AEP VSL& die Eioliminoss$ns~Eesj£tio;a sit ätiioxyliartem Amin allein laufen l^ngssts s.b. Bei Ysrwenüusig eiiier Kischüng &us qtiaterrilrem ätlxcsylier-trss Aein vjiä ätliosqflierten Amin ist die· Fr-eisetsTEag mäSig loaigsaiE oder mäßig schnell, ^e n-ack dsE Hsngensnteil ä&? l>B±üm\ cberfläciianek-ciTen Kittel in ÜQ-j- Mi seating (Figo 'I)* -Je mehr quaternär« s äthosyliertes
30SS49/G978
Amin vorhanden ist, um so schneller erfolgt die Freisetzung, um so höher ist die Enzym-Kinetik und um so schneller läuft die Lichtreaktion ab. Eine Mischung aus 70 % äthoxyliertem Amin und 30 % quaternärem äthoxyliertem Amin ergibt eine mittlere Reaktionsgeschwindigkeit und eine um das 1,2- bis 2,0-fach erhöhte relative Lichtablesung in der Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Reaktion im Vergleich zu der gleichen Konzentration an ATP in Wasser ohne das oberflächenaktive Mittel-Gemisch bei der Messung mit einer 10 Sekunden-Integration. Es scheint, daß durch diese Mischung die Umsatzrate des Luciferase-Enzyms erhöht wird, wodurch möglicherweise die hydrophilen Zentren des Enzyms beeinflußt werden. Mehr als 50 % quaternäres Salz von äthoxyliertem Amin verringern die Aktivität des Luciferase-Enzyms, so daß gsin Mengenanteil in Relation zu dem äthoxylierten Amin gesteuert (kontrolliert) werden muß.
Messung_von_Mikroben-Zellen
Wenn eine Probe, beispielsweise eine reine Bakterienkultur oder eine gemischte Bakterienkultur, nur Bakterien oder tausendmal mehr Bakterien als andere Zellen enthält, erfolgt die Messung der Bakterien-Nucleotide durch einfache Zugabe von 0,01 bis 2 %, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 % an ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie äthoxylierten Aminen, vorzugsweise mit einem quaternären Ammoniumsalz als Teil davon, durch Mischen derselben mit der Probe zur Freisetzung von Nucleotiden durch die Zellwand. Dann kann die Probe in ein Instrument zur Messung der Nucleotid-Konzentration mit beispielsweise "ATP unter Anwendung der Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Reaktion eingesetzt werden. Die durch die Reaktion in der Probe erzeugte Lichtintensität steht in
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direkter Beziehung zu der ATP-Konzentration oder der Anzahl der lebensfähigen (lebenden) Bakterien der Probe, wie die folgende Tabelle II zeigt.
Tabelle II
Relative Lichtintensität, erzeugt durch ATP, das aus einer verschiedenen Anzahl von Bakterienzellen durch das äthoxylierte Amin/quaternäre äthoxylierte Amin in einer Konzentration von 0,1 % freigesetzt iirorden war. Die Bakterien wurden in 0,5 ffil einer physiologischen ITaCl-Lösung (0,9 %) suspendiert und unter Anwendung des Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Verfahrens bestimmt (gemessen):
Anzahl der Bakterien in der Relative Lichteinheiten, ge-Probe messen mit einem Photometer
150000 1480
500000 4600
1000000 9580
2000000 18900
Der Extraktionswirkungsgrad der Mischung aus äthoxyliertem Amin und quaternärem Salz von äthoxyliertem Amin in einem Verhältnis von 70:30 in einer Konzentration von 0,1 % des Volumens der Probe wurde verglichen mit dem Tr is (0,02 M)-EDTA (0,002 M) pH 7,75-Siedeverfahren und mit der Perchlorsäureextraktion ähnlich wie in Tabelle I. Die Ergebnisse von drei wiederholten Tests sind nachfolgend angegeben.
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Il
0,1 % athoxylier- coli (Suspension 100 % Perchlor 7 % Tris-EDTA-
tes Amin und qua- von 1Ob Zellen) säure 0,1 M, siedender
ternäi'es Salz von Chlorella sp. 100 % neutrali Puffer
äthoxyliertem alga siert mit 3 %
Amin in einem KOH
Verhältnis von —
70:30
Gesamtblut 100 % 80 %
Escherichia
95 %
100 %
Die Freisetzung von ATP aus Hefezellen und Pilzen mit der Mischung aus äthoxyliertem Amin und seinem quaternären Salz erfolgte langsamer als die Freisetzung von ATP aus Bakterien. Aus Bakterien war die Freisetzung innerhalb von weniger als 15 Sekunden beendet, während aus Hefe- und Pilzzellen die quantitative Freisetzung innerhalb von 30 bis 60 Sekunden erfolgte. Für die quantitative Freisetzung darf das Volumen der Zellen nicht mehr als 1 % des Gesamtvolumens der Probe ausmachen. Die Freisetzung war bei dicken Gewebeabschnitteii und dicken Ausflockungen von Proben (über 1 nmr) nicht vollständig, da das Reagens die Mikroben-Zellen nicht zerbrach, sondern kleine Moleküle durch die Zellwand freisetzte.
(3) i?essung_von_Mikroben-Zellen_in_Gegenwart einer großen Anzahl_von_Soma-Zellen
Wenn die Bakterienprobe, in der Nucleotide,wie ATP oder FMN, gemessen (bestimmt) werden sollen, Nicht-Mikroben-Zellen
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enthält, müssen die Nucleotide der Nicht-Bakterien-Zellen entfernt werden, bevor die Bakterien-Nucleotide bestimmt (gernessen)werden können. Bei den bisherigen Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Verfahren erfolgte dies durch Auflösung der Nicht-Bakterien-Zellen mittels des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels Triton X-100 und Zugabe eines ATP-ase-Enzyms, wie Apyrase, zu der Probe, um das nicht-bakterielle ATP zu zerstören. Danach wurde das bakterielle ATP gemessen bzw. bestimmt durch Extrahieren von ATP und Inaktivieren von Apyrase durch den siedenden Tris-EDTA-Puffer, organische Lösungsmittel, Basen, Säuren und andere konventionelle Verfahren (vergleiche die US-P at ent schrift 3 74-5 090).
Das obige Verfahren hat einige Nachteile: Triton X-IOO extrahiert ATP nicht quantitativ aus allen Typen von Nicht-Bakterien-Zellen. Außerdem setzt Triton X-100 ATP aus grampositiven Bakterien frei und vermindert die Biolumineszenz-Lichtreaktion. Das obengenannte Verfahren kann zu Ungenauigkeiten bei der Messung bzw. Bestimmung der Bakterien in Körperflüssigkeiten und in Lebensmitteln führen. Wenn die Probe mit dem siedenden Tris-EDTA-Puffer behandelt wird, um Apyrase zu inaktivieren und ATP aus Bakterien-Zellen freizusetzen (vergleiche die US-Patentschrift 3 74-5 090), wird sie stark verdünnt, wodurch die Empfindlichkeit des Verfahrens herabgesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf vier verbesserte Verfahren zur Eliminierung von nicht-bakteriellem ATP aus Bakterien-Proben:
Das erste Verfahren ist das folgende: Nicht-bakterielle Nucleotide, wie ATP, werden durch ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel oder ein anderes oberflächenaktives
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Mittel, welches die Durchlässigkeit der Bakterien-Zellwand nicht beeinflußt, freigesetzt und die Probe (50 All bis 100 ml, vorzugsweise 50 bis 1000/ul) wird durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,1 bis 2/um, vorzugsweise von 0,2 bis 0,4-5/um, filtriert. Das nicht-bakterielle ATP passiert das Filter und wird so eliminiert, während die intakten Bakterien auf dem Filter zurückbleiben. Das Filter wird anschließend mit dem Puffer, einer physiologischen Salzlösung oder destilliertem Wasser gespült und in eine transparente Meßphiole eingeführt und ein ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z. B. eine Mischung aus äthoxyliertem Amin und quaternärem äthoxyliertem Amin, wird in einer Konzentration von 0,05 bis 2 % zugegeben, um das bakterielle ATP freizusetzen, und anschließend wird es unter Anwendung der Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Eeaktion bestimmt (gemessen). Bei diesem Verfahren sind die Manipulationen einfach und schnell und es werden auch mögliche störende Substanzen neben dem nicht-bakteriellen ATP, wie z. B. Salze, gefärbte Substanzen, Enzyminhibitoren und dergleichen, entfernt. Außerdem wird die Probe nicht verdünnt, sondern sogar konzentriert, wodurch die Empfindlichkeit der Analysen erhöht wird. Wenn eine Meßphiole mit einem ebenen Boden und ein Filter mit eineci kleineren Durchmesser als der Innendurchmesser der Phiole verwendet wix'd, kann die Filtermembran auf den Boden der Phiole gelegt werden und die Folge davon ist, daß der Filter das Licht zwischen der flüssigen Probe und dem Lichtdetektor nicht abfängt.
Das zweite Verfahren ist das folgende: Die Probe 0,1 bis 100 ml, vorzugsweise 0,5 bis 10 ml, wird durch ein 0,1 bis 0,4-5 /um Membranfilter so lange filtriert, bis ein dünner Film der Flüssigkeit auf der Oberseite des Filters
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zurückbleibt. Das Filter sollte nicht trocken werden, da dies die Mikroben belastet und ihren ATP-Gehalt gegenüber dem Normalwert vermindert. Ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, z. B. eine 0,01 bis 1 %ige, vorzugsweise 0,1 bis 0,2%ige Lösung von äthoxylierten Phenolen wird in einem Volumen von 0,01 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 ml, auf das Filter gegeben. Nach 10 bis 60 Sekunden wird die Flüssigkeit filtriert, jedoch, ohne daß das Filter trokken wird. Das Filter wird 1- bis 3-mal mit 0,1 bis 10 ml sterilem Wasser, einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem geeigneten Puffer gespült, um das gesamte nicht-bakterielle ATP von dem Filter, dem Zellenrückstand und den Wänden des Filterhalters zu entfernen, während des Filtrierens der Spüllösung darf das Filter jedoch nicht trocken werden. Nach dem Spülen wird das Filter mit 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 10 ml einer 0,01 bis 1 %igen, vorzugsweise 0,05 bis 0,2-%igen Lösung von ionischen oberflächenaktiven Mitteln, vorzugsweise mit einer Mischung aus einem äthosylierten Amin und einem quaternären Ammoniumsalz des äthoxylierten Amins in einem Verhältnis von 95:5 bis 5:95» vorzugsweise von 70:30?bedeckt. Eine Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen ist in dem äthoxylierten Amin bevorzugt. Man läßt dieses Reagens 10 bis 30 Sekunden lang auf die Mikroben-Zellen auf dem Filter einwirken und man filtriert die das aus den Mikroben-Zellen freigesetzte ATP enthaltende Lösung in ein Teströhrchen oder direkt in eine Meßküvette. Das Filter und der Filterhalter werden mit 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise mit 0,1 bis 0,5 ml destilliertem Wasser in den gleichen Behälter wie die Lösung des ionischen oberflächenaktiven Mittels mit ATP gespült. Nun ist die Probe fertig für die Messung.
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Ein drittes Verfahren zum Eliminieren von nicht-bakteriellen Nucleotiden ist die Zentrifugierung. Nucleotide aus Soma-Zellen werden durch, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z. B. äthoxylierte Phenole, freigesetzt und die Bakterien werden durch 1 bis 20-minütiges Zentrifugieren mit 3000 bis 20000 g sedimentiert. Die überstehende Flüssigkeit mit den freigesetzten nicht-bakteriellen Nucleotiden wird verworfen und die Bakterien werden wieder in einem geringen Volumen Wasser, Kochsalzlösung oder Puffer suspendiert und +) durch Zugabe von ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie äthoxylierten Aminen, in einer Konzentration von 0,05 bis 2 % des Gesamtvolumens freigesetzt. Unmittelbar nach dem Konzentrieren können die bakteriellen Nucleotide unter Anwendung eines BüLumineszenz-Verfahrens gemessen (bestimmt) werden. Hohe Blindwerte (nicht-bakterielles ATP) können durch zusätzliches Waschen mit Wasser, Puffern oder einer Kochsalzlösung und anschließendes Zentrifugieren vor der Zugabe des ionischen oberflächenaktiven Mittels und Messung der bakteriellen Nucleotide gesenkt werden.
In dem vierten Verfahren wird ein ATP-ase-Enzym, z. B. Apyrase in immobilisierter Form verwendet. Das angewendete Verfahren ist das folgende: Eine Probe von 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 1 ml,oder eine Filtermembran, die sowohl Soma- als auch Mikroben-Zellen enthält, wird mit 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 1 ml^eines 0,01- bis 2 %±- gen, vorzugsweise 0,05-bis 0,2 %igen nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, wie äthoxylierten Phenolen, welche die Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Eeaktion nicht stören, behandelt. Bei dieser Behandlung wird das ATP innerhalb von wenigen Sekunden aus der Soma-Zelle freigesetzt.
bakterielle Nucleotide werden
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Immobilisiertes ATP in einer Menge von 0,1 bis 10 Einheiten, vorzugsweise von 1 bis 5 Einheiten, wird in Form von Glasperlen, eines Kunststoffstabes, in Form von Cellulose- oder anderen Fasern, Metallperlen, Latex- oder anderen makromolekularen Perlen zugegeben, oder Apyrase kann auf den Wänden des Probenröhrchens immobilisiert werden. Die Probe wird 0,5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 1 bis 10 Minuten lang bei Temperaturen von 20 bis 37°C roi* oder ohne Rühren inkubiert, um die Apyrase das somatische ATP aufbrechen zu lassen. Nach dem Inkubieren wird ein Anteil von 0,01 bis 10 ml, vorzugsweise von 0,05 bis 1 ml der Probe mit 0,1 bis 10 ml, vorzugsweise mit 0,05 bis 1 ml, eines 0,01- bis 1-%igen, vorzugsweise 0,05- bis 0,2-%igen ionischen oberflächenaktiven Mittels, wie äthoxyliertem Amin, vorzugsweise einer Mischung aus äthoxyliertem Amin und äthoxyliertem Amin mit einem quaternären Ammoniumsalz in einem Verhältnis von 5:95 % "bis 95:5 %■> vorzugsweise in einem Verhältnis von 70:30 %, behandelt. Dadurch wird innerhalb von wenigen Sekunden Mikroben-ATP freigesetzt, und zwar aus Bakterien innerhalb von 10 bis 15 Sekunden und aus Hefen und Pilzen innerhalb von 20 bis 60 Sekunden, und zwar quantitati\r bei Bakterien, wenn die Anzahl der Zellen weniger als 10 pro ml beträgt, und bei Hefen und Pilzen, wenn sie weniger als 10^ pro ml beträgt. Die Konzentration von mikrobiellem ATP kann dann unter Anwendung des Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Reagens bestimmt (gemessen) werden. Die ATP-Konzentration wird in die Anzahl von Bakterienzellen umgewandelt unter Verwendung von vorgegebenen ATP-Werten pro Zelle für bekannte Arten oder 0,3 bis 2 Femtogramm (0,4 χ 10" ■* g) pro Zelle bei einer unbekannten gemischten Population von Bakterien, von I30 bis I70 Femtogramm pro
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Zelle bei Brauereihefe, wie in der Literatur angegeben' (vgl. A.J. D'Eustachio, D.R. Johnson und G.V. Levin, "Rapid assay of bacteria populations" in "Bacteriol. Proc", 21, 23 ff., 1968,und A. Thore, S.Ansehn, A. Lundin und S. Bergmann, "Detection of bacteriuria by luciferase assay of adenosine triphosphate" in "J. Clin. Microbiol" 1, 1-8, 1975,und US-Patentschrift 3 745 090).
Dieses zuletzt genannte Alternativverfahren ist mit den bereits vorhandenen Probenentrahme-und Abgabeeinheiten leicht automatisierbar. Die Verwendung des Apyraseenzyms ist in der Literatur und in der US-Patentschrift 3 745 090 angegeben, es war bisher jedoch nicht bekannt, es in der immobilisierten Form zu verwenden. Durch die Verwendung von immobilisierter Apyrase ist es nicht mehr erforderlich, Apyrase durch Erhitzen oder auf chemischem Wege zu inaktivieren und dadurch ist es möglich, ionische oberflächenaktive Mittel, wie z.B. äthoxylierte Amine, für die Freisetzung von ATP aus Bakterien zu verwenden. Dieses Verfahren ist leicht automatisierbar sowohl unter Anwendung von Durchflußverfahren als auch von Einzelprobenröhrchensystemen. Die immobilisierte Apyrase kann mehrere Wochen lang immer wieder verwendet werden, wenn sie mit einem Puffer gewaschen und in einem Puffer bei +4 C aufbewahrt wird.
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Zusammenfassend kann man sagen, daß das erfindungsgsnäße Verfahren im Vergleich zu konventionellen Verfahren der Extraktion von Nukleotiden, wie ATP, für biochemische Nachweise (Aissays), insbesondere für den BiolumineszenE-Assay von ATP mit dem Leuchtkäfer-Luciferin-Juciferase-System Einsparungen an Zeit erlaubt. Außerdem kann die Bestimmung bzw. Messung von ATP selektiv für Soma- oder Mikroben-Zellen durchgeführt werden. Die Herstellung bzw. Vorbehandlung der Probe erfolgt schnell, wirksam und reproduzierbar und die oberflächenaktiven Mittel können so gev/ählt werden, daß sie die Luciferin-Luciferase-Biolumineszenzreaktion nicht stören und auch die Stabilität der Nukleotide, wie ATP, nicht beeinflussen.
Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird. Dies gilt insbesondere für die hier genannten Beispiele von oberflächenaktiven Mitteln, für die angewendeten Arbeitsweisen und die angegebenen Anwendungsgebiete sowie für die vorstehend genannten speziellen Anwendungsformen.
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3° . Leerseite

Claims (5)

  1. 2823316
    500-Dr. T. München, den 31. Mai 1978
    Anmelder: 1„ Seppo Kolehmainen, Ganzenstraat 11,
    Zolder, Belgien
  2. 2. Veikko Tarkkanen, BreuIsweg 1,
    Wylre, Niederlande
    Patentansprüche
    1. Verfahren zur selektiven Bestimmung von Metaboliten wie ATP in Soma- oder Mikrobenzellen, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man mit Hilfe von oberflächenaktiven Mitteln Metabolite durch die Zellwand freisetzt
    und die Konzentration der Metabolite mit Lumineszenzsystemen, ζ. B. durch Leuchtkäfer- oder Phosphorbakterium-Biolumineszenzjbestimmt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die selektive Freisetzung von ATP aus Soma- und
    Nicht-Mikroben-Zellen bewirkt mit Hilfe von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie z. B., jedoch
    nicht ausschließlich, athoxylierten Alkylphenolen, vorzugsweise athoxylierten Nonyl- und Octyl-Phenolen,in
    einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 %·> und daß man die ATP-Konzentration mit Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Eeagentien in einem Photometer bestimmt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Freisetzung von ATP aus Mikroben-Zellen in Abwesenheit von Nicht-Mikroben-Zellen mit Hilfe von ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie z. B., jedoch
    nicht ausschließlich, athoxylierten Aminen und einer Mischung aus athoxylierten Aminen und dem quaternären
    809849/0978
    Ammoniumsalζ von äthoxylierten Aminen mit 12 Kohlenstoff atomen in der Ketteln Konzentrationen von 0,02 bis 0,5 % bewirkt und die ATP-Konzentration mit dem Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagens bestimmt.
  4. 4-, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Freisetzung von ATP aus Mikroben-Zellen in Gegenwart von Nicht-Mikroben-Zellen dadurch bewirkt, daß man
    (<a) die Probe mit nicht-ionischen oberflächenaktiven
    Mitteln, wie z. B. äthoxylierten Alkylphenolen, in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 % behandelt, um nicht-mikrobielles ATP selektiv freizusetzen, und
    (b) 1 bis 5 Einheiten ATPase-Enzym, wie z. B. Kartoffelapyrase, in immobilisierter Form der Probe zugibt
    und
    (c) die Probe 1 bis 10 Minuten lang bei 20 bis 37°G inkubiert, wobei während dieser Zeit die Apyrase das nicht-mikrobielle ATP hydrolysiert, und
    (d) die immobilisierte Apyrase aus der Probe entfernt
    oder einen aliquoten Anteil der Probe entnimmt und
    (e) den ATP-Gehalt mit den Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagentien in einem Photometer bestimmt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Freisetzung von ATP aus Mikroben-Zellen in Gegenwart von Nicht-Mikroben-Zellen dadurch bewirkt, daß man
    (a) die Probe mit nicht-ionischen oberflächenaktiven
    Mitteln, wie z. B. äthoxylierten Alkylphenolen,
    809849/0976
    vorzugsweise äthoxylierten Nonyl- und Octylphenolen, in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 % behandelt, um nicht-mikrobielles ATP selektiv freizusetzen, und
    (b) die Probe nach einer Wartezeit von 10 bis 60 Sekunden filtriert, um das freigesetzte nicht-mikrobielle ATP zu eliminieren, und
    (c) die Probe und die Gütereinheit mit sterilem Wasser, einem Puffer oder einer Kochsalzlösung wäscht zur Entfernung von Spuren von nicht-bakteriellem ATP, und
    (d^) die Eiltermembran auf den Boden einer Meßküvette legt und nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z. B. äthoxylierte Amine und eine Mischung aus äthoxylierten Aminen und dem quaternären Salz von äthoxylierten Aminen mit 12 Kohlenstoffatomen in der Kette,in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 % zugibt zur Freisetzung von ATP aus Mikroben-Zellen, oder
    alternativ die Filtermembran nach dem Waschen des nicht-mikrobiellen ATP mit nicht-ionischem oberflächenaktivem Mittel, wie z. B. äthoxylierten Aminen und einer Mischung aus äthoxylierten Aminen und dem quaternären Salz von äthoxylierten Aminen mit 12 Kohlenstoffatomen in der Kette,in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5 % bedeckt, um das mikrobielle ATP freizusetzen, und nach einer Wartezeit von 10 bis 60 Sekunden die Lösung auf dem Filter in die Meßküvette oder in einen anderen Behälter filtriert, aus dem sie in eine Küvette pipettiert werden kann, und anschließend
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    (e) in der in der Stufe d^ oder d2 behandelten Probe
    dann die ATP-Konzentration mit den Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Keagentien in einem Photometer bestimmt.
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