DE3783532T2

DE3783532T2 - Zusammensetzung und verfahren, die substituierte ortho-chinone als elektronen-transfermittel in analytischen bestimmungen verwenden.

Info

Publication number: DE3783532T2
Application number: DE19873783532
Authority: DE
Inventors: Albert Joseph C O Eastman Mura; Eric Richard C O Eas Schmittou; Robert William C O East Zercie
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1986-07-28
Filing date: 1987-07-27
Publication date: 1993-07-22
Anticipated expiration: 2007-07-28
Also published as: DE3783532D1; EP0255679A2; EP0255679B1; JPH0743370B2; EP0255679A3; JPS63100376A

Description

Diese Erfindung betrifft die klinische Chemie. Ganz speziell betrifft diese Erfindung analytische Zusammensetzungen und Methoden, bei denen bestimmte substituierte Chinon-Elektronenübertragungsmittel zur Bestimmung von Analyten (z. B. lebenden Zellen) in wäßrigen Flüssigkeiten (z. B. biologischen Flüssigkeiten) verwendet werden.
Die chemische Analyse von Flüssigkeiten, z. B. Wasser, Milch sowie biologischen Flüssigkeiten, ist oftmals wünschenswert oder erforderlich für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und im Rahmen von diagnostischen Behandlungen.
Es sind verschiedene Zusammensetzungen und Elemente zur Erleichterung derartiger Analysen bekannt. Derartige Zusammensetzungen und Elemente weisen im allgemeinen eine Reagens- Zusammensetzung für die Bestimmung einer Substanz, die analysiert werden soll, auf, die hier als Analyt bezeichnet wird. Der Analyt kann ein biologischer Organismus sein oder eine chemische Substanz. Diese Reagens-Zusammensetzung liefert bei Reaktion mit dem Analyten eine feststellbare Veränderung (z. B. eine Farbstoffbildung).
In jüngerer Zeit ist viel Arbeit darauf verwendet worden, um Zusammensetzungen und Elemente zu entwickeln, die für eine rasche und hoch quantitative diagnostische oder klinische Analyse von biologischen Flüssigkeiten, z. B. ganzem Blut, Serum, Plasma, Urin und dgl. geeignet sind.
Für die rasche und effektive Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten ist es wünschenswert, so schnell wie möglich Bakterien erkennen zu können, die für die Krankheit verantwortlich sind. Zu den am häufigsten vorkommenden bakteriellen Krankheiten gehören Infektionen des Harnweges; in der Häufigkeit an zweiter Stelle liegen Infektionen der Atemwege. Tatsächlich sind in vielen Krankenhäusern Infektionen der Harnwege die am häufigsten vorkommende Form nach im Krankenhaus entstehenden Infektionen, oftmals gefolgt von der Verwendung von Kathedern und verschiedenen chirurgischen Eingriffen. Die meisten Infektionen der Harnwege (UTI) ergeben sich aus aufsteigenden Infektionen durch Mikroorganismen, die durch die Harnröhre eingeführt werden, wobei sie sich in ihrem Schwierigkeitsgrad von unverdächtigen Infektionen bis hin zu Bedingungen erstrecken, die einer schweren systemischen Krankheit entsprechen. Derartige Infektionen sind normalerweise begleitet von bakteriellen Werten von 100.000 (10&sup5;) oder mehr Organismen pro ml Urin, eine Bedingung, die als schwerwiegende Bacteriuria bezeichnet wird. Unter normalen Bedingungen ist Urin steril, obgleich eine Verschmutzung der externen Genitalien zu bis zu 1000 (10³ Organismen pro ml in geeigneter Weise aufgenommenen und transportierten Proben führen kann.
Eine wesentliche Bacteriuria kann im Falle einer Anzahl von pathalogischen Bedingungen vorliegen, unter mikrobiologischer Invasion eines beliebigen Gewebes der Harnwege oder als Ergebnis einer einfachen bakteriellen Multiplikation im Urin ohne Gewebeinvasion. Die Infektion kann ein einzelnes Organ befallen, z. B. die Harnröhre, die Prostata, die Blase oder die Nieren, obgleich häufig auch mehr als nur ein Organ befallen wird. Eine Infektion, die auf Urin beschränkt ist, kann selbst in Form einer asymptomatischen Bacteriuria in Erscheinung treten, d. h. einem Zustand, der keine offenen Anzeichen oder Symptome einer Infektion manifestiert. Eine frühe Behandlung dieses Zustandes kann die Entwicklung schlimmerer Zustände entwickeln, z. B. der Pyelonephritis (Entzündung der Nieren und des Nierenbeckens). Die rasche Erkennung von Bakterien mittels einer vergleichsweise leicht durchzuführenden Methode würde infolgedessen eine frühe und spezielle Diagnose erleichtern.
Weiterhin sind, um zu gewährleisten, daß ein verschriebenes Antibiotikum tatsächlich effektiv in der Behandlung einer Infektion ist, wiederholte Tests während der Therapie erforderlich. Infolgedessen besteht ganz offensichtlich ein Bedürfnis nach einfachen, rasch durchzuführenden Bacteriuria-Tests. Weiterhin müssen Bacteriuria-Tests im Hinblick auf das häufige, unerwartete asyniptomatische Auftreten von UTI bei Kindern, schwangeren Frauen, Diabetikern und älteren Menschen, deren Diagnose eine Zusammenfassung und Untersuchung von mehreren Proben erfordert, genügend einfach sein sowie ökonomisch, um eine routinemäßige Durchführung zu ermöglichen. Dieses veranschaulicht nochmals das Bedürfnis nach einer rasch durchzuführenden und billigen Bacteriuria- Bestimmungsmethode.
Die Bestimmung von bestimmten Analyten, zu bemerken sind lebende Zellen (wie beispielsweise Bakterien, Hefe usw.), wird am besten durchgeführt unter Verwendung einer reduzierbaren Zusammensetzung, die zu einer bestimmbaren Spezies führt, in Gegenwart eines Elektronenübertragungsmittels (ETA). Das Elektronenübertragungsmittel wird zunächst durch die lebende Zelle reduziert. Das reduzierte ETA reduziert dann die reduzierbare Zusammensetzung unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies, die dann ermittelt wird. Phenazinmethosulfat (PMS) ist ein typisches ETA.
In der EP-A-0190740, eingereicht am 5. Februar 1986, wird eine verbesserte Klasse von ETA-Verbindungen beschrieben. Bedauerlicherweise sind jedoch PMS und strukturell ähnliche ETA-Verbindungen in wäßrigen Lösungen instabil. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um substituierte Benzochinone oder Naphthochinone. Die ETA-Verbindungen jener Erfindung bieten viele Vorteile gegenüber den bisher bekannten ETA- Verbindungen. Es sind jedoch weitere Verbesserungen erwünscht. Ganz speziell hat sich gezeigt, daß die speziellen ETA-Verbindungen in den Beispielen jener Anmeldung eine geringere als die erwünschte Empfindlichkeit aufweisen. Infolgedessen besteht insbesondere ein Bedürfnis nach einer verbesserten Empfindlichkeit.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel für die Bestimmung von Analyten, z. B. Mikroorganismen, bereit, die durch eine verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich zu bekannten analytischen Verfahren gekennzeichnet sind.
Demzufolge umfaßt erfindungsgemäß eine Zusammensetzung für die Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeit:
(a) ein Elektronenübertragungsmittel (ETA), das ein stabiles, in Methanol lösliches 1,2-Benzochinon ist mit Methoxygruppen oder einem ankondensierten 1,4-Dioxanring in den Positionen 4 und 5 oder mit einer substituierten oder unsubstituierten kurzkettigen Alkoxygruppe, ausgenommen einer Methoxygruppe, in der Position 4 und einem ankondensierten 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring in den Positionen 5 und 6,
(b) eine reduzierbare Zusammensetzung mit einer Verbindung, die einer Farbveränderung unterliegt, wenn sie durch das ETA reduziert wird.
Weiterhin wird durch diese Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeit bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Stufen:
A. Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit dem beschriebenen Chinon-Elektronenübertragungsmittel (ETA) und einer reduzierbaren Zusammensetzung, die eine Verbindung umfaßt, die einer Farbveränderung unterliegt, wenn sie durch die ETA-Verbindung reduziert wird, bei einem pH-Wert von 9 oder weniger und
B. Ermittlung oder Bestimmung der Farbveränderung.
Wie oben erwähnt, werden die Vorteile, die bei Durchführung der vorliegenden Erfindung erzielt werden, erreicht aufgrund der Verwendung von speziellen Elektronenübertragungsmitteln (ETAs) im Rahmen der Erfindung. Diese ETAs sind hoch verträglich mit sowohl wäßrigen wie auch oleophilen Umgebungen. Sie weisen einen ausreichend hydrophilen Charakter auf, um in wäßrigen Pufferlösungen löslich zu sein. Gleichzeitig weisen sie einen ausreichenden oleophilen Charakter auf, um eine Reaktion mit Elektronendonoren innerhalb der Zellen zu ermöglichen.
Die ortho-Chinone, die erfindungsgemäß geeignet sind, sind strukturell ähnlich den Chinonen, die in der oben erwähnten EP-A-0190740 (US-Ser.Nr. 699 374) beschrieben werden. Unerwarteterweise jedoch zeigen die vorliegenden Chinone ein verbessertes Ansprechvermögen im Vergleich zu den Beispielen in jener Literaturstelle, wie sich aus den später folgenden Vergleichsbeispielen ergibt.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, daß die ETAs, die im Rahmen dieser Erfindung geeignet sind, ein Reduktionspotential (E1/2) innerhalb des Bereiches von etwa -320 bis etwa +400 mV aufweisen, gemessen in einer wäßrigen Pufferlösung bei einem pH von 7, so daß die Verbindungen als Elektronenübertragungsmittel für Zellen wirken können. Vorzugsweise liegt der E1/2-Wert der ETA-Verbindung im Bereich von etwa -185 bis etwa +400 mV. Der gewünschte E1/2-Wert wird erreicht durch geeignete Substituenten am Chinonkern der Verbindung. Aufgrund der hier offenbarten Lehre ist ein Fachmann auf dem Gebiet der synthetischen Chemie in der Lage, den Chinonkern mit Substituenten zu versehen, um den gewünschten E1/2-Wert zu erhalten. Messungen des Reduktionspotentials können nach üblichen elektrochemischen Methoden durchgeführt werden, entweder unter Verwendung der Differential-Impuls-Polarographie oder der cyclischen Voltametrie (vgl. z. B. Sawyer und Roberts, Jr., Experimental Electrochemistry for Chemists, Verlag John Wiley & Sons, New York, 1974).
Repräsentative Elektronenübertragungsmittel (ETAs), die für diese Erfindung geeignet sind, werden im folgenden veranschaulicht:
worin R&sub4; und R&sub5; die Bedeutung von Methoxygruppen haben und R&sub3; und R&sub6; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten kurzkettigen Alkoxygruppen, z. B. Methoxy- oder Ethoxygruppen der substituierten oder unsubstituierten kurzkettigen Alkylgruppen, z. B. Methyl- oder Ethylgruppen oder R&sub4; und R&sub5; gemeinsam einen ankondensierten 1,4-Dioxanring bilden und R&sub3; und R&sub6; die angegebene Bedeutung haben oder R&sub5; und R&sub6; gemeinsam einen ankondensierten 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring darstellen, z. B. einen Phenyl-, Furyl-, Pyridyl-, Thienyl- oder 1,4-Dioxyring und R&sub4; eine substituierte oder unsubstituierte kurzkettige Alkoxygruppe ist, z. B. eine Ethoxy- oder Methoxycarbonylmethoxygruppe und R&sub3; die oben angegebene Bedeutung hat.
Die ortho-Chinone sollten stabil sein. Mit stabil ist gemeint, daß die Verbindung synthetisiert, isoliert und bei etwa 37ºC mindestens während der Bestimmung aufbewahrt werden kann, d. h. mindestens mehrere Stunden lang.
Zu repräsentativen ortho-Chinonen, die sich für die Praxis der vorliegenden Erfindung eignen, gehören:
Verbg.
Wie bemerkt, sollten die ortho-Chinone, die für die Erfindung geeignet sind, in Methanol löslich sein. Unter methanollöslich ist gemeint, daß eine Lösung der Verbindung, die mindestens etwa 0,005 M ist, in Methanol erzeugt werden kann. Eine Vorlösung des ortho-Chinons in einer geringen Menge Methanol erleichtert die Bildung einer wäßrigen Lösung. Andere Lösungsmittel, wie z. B. N,N-Dimethylformamid, eignen sich ebenfalls für die Vorlösung des ortho-Chinons. Verbindungen, die in Methanol löslich sind, sind auch in diesen Lösungsmitteln löslich.
Reduktionspotentiale (gemessen als die Halbwerts-Potentiale E1/2) wurden unter Verwendung eines polarographischen Analysegerätes bestimmt. Das Lösungsmedium bestand aus einem Natriumphosphatpuffer (pH 7,0, Ionenstärke = 0,1). Die Messungen erfolgen gegen eine standard-Kalomel-Elektrode. Die Werte sind angegeben gegenüber der normalen Wasserstoffelektrode.
Die hier beschriebenen ETAs können unter Verwendung von bekannten Ausgangsmaterialien und bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise wird verwiesen auf A. Takuwa und Mitarbeiter, Bull. Chem. Soc. Japan, 59, 2959 (1986) und Y. Itoh und Mitarbeiter, Bull. Chem. Soc. Japan, 52, 2169 (1979).
Die hier beschriebenen ETAs werden in Kombination mit einer reduzierbaren Zusammensetzung verwendet, die eine bestimmbare Spezies zu bilden vermag, wenn sie durch das Elektronenübertragungsmittel reduziert wird. Die bestimmbare oder ermittelbare Spezies kann erhalten werden durch die reduzierbare Verbindung, die einer Veränderung unterliegt und dabei bestimmbar wird. Alternativ kann die bestimmbare Spezies erhalten werden durch Freisetzung von der reduzierbaren Zusammensetzung. Die bestimmbare Spezies kann aus einer Verbindung oder einem Material bestehen, das direkt bestimmbar oder erkennbar ist durch geeignete Mittel, wie auch durch ein Material, das mit anderen Substanzen zu reagieren vermag, z. B. anderen Analyten, Enzymen, Beizmitteln, Metallionen oder anderen Materialien, die eine erkennbare oder bestimmbare Spezies liefern. Zu derartigen Spezies gehören solche, die auf radiometrischem Wege bestimmbar sind, einschließlich Chromogene (z. B. Farbstoffe oder Pigmente), die auf kolorimetrischem Wege bestimmbar sind sowie Fluorogene (z. B. fluoreszierende Farbstoffe oder Sonden), die auf fluorometrischem Wege bestimmt werden können. Zusätzlich kann die bestimmbare oder ermittelbare Spezies eine phosphoreszierende Spezies sein, eine radioaktiv markierte Spezies oder eine chemolumineszierende Spezies oder irgendeine andere bestimmbare Spezies, die dem Fachmann bekannt ist.
Zu geeigneten reduzierbaren Materialien gehören Tetrazoliumsalze, die unter Bildung von kolorimetrischen Farbstoffen reduziert werden können, Dichloroindophenolfarbstoffe, die zu farblosen Verbindungen reduziert werden können und andere Farbstoffe liefernde Materialien, die reduziert werden können.
Beispiele von geeigneten Klassen von Chromogenen sind Azo-, Azomethin-, Nitrophenol-, Indophenol-, Indoanilin- und Triarylmethanfarbstoffe und andere, die bekannt sind, wobei Azofarbstoffe die bevorzugten sind. Beispiele für geeignete Klassen von Fluorogenen sind Coumarin, Fluorescin sowie fluoreszierende Rhodaminfarbstoffe und andere bekannte Fluorogene.
Besonders geeignete Verbindungen oder Reste sind Chromogene und Fluorogene mit einer ersten spektralen Absorptionsbande vor der Freisetzung und einer zweiten spektralen Absorptionsbande, die nach der Freisetzung gemessen wird. Geeignete Zusammensetzungen dieses Typs werden beschrieben in der EP-A-211898 und in der EP-A-87 304 685.2 sowie in der EP-A- 87 304 686.6. In diesen Publikationen werden ganz allgemein reduzierbare intramolekulare nukleophile Verdrängungsverbindungen beschrieben, die als "RIND"-Verbindungen bezeichnet werden. Diese Verbindungen weisen die allgemeine Struktur CAR-(R)n auf, worin n gleich 1 oder 2 ist, CAR- ein substituierter oder unsubstituierter aromatischer oder Chinon-Kern ist und R für einen Rest steht, der eine verschiebbare, bestimmbare Spezies umfaßt. Im Falle bevorzugter Ausführungsformen sind die Verbindungen mit Wasser verträglich und lichtstabil.
Besonders bevorzugte Reagenzien sind die Cobalt(III) enthaltenden Reagenzien, die in der EP-A-198286 beschrieben werden. In dieser Publikation wird eine reduzierbare Zusammensetzung für die Bestimmung von Reduktantien beschrieben, die einen in Wasser löslichen Cobalt(III)-Komplex und einen in Wasser löslichen metallisierbaren Farbstoff aufweist. Das der Zusammensetzung gegebenenfalls zugesetzte Elektronenübertragungsmittel kann ein ortho-Chinon-Elektronenübertragungsmittel wie beschrieben sein.
Viele andere Redox-Reagenzien sind bekannt, wie beispielsweise die Zusammensetzungen, die NAD enthalten, einen Elektronenträger und ein Tetrazoliumsalz, wie in der US-PS 4 351 899 beschrieben; die Zusammensetzungen, die ein polyvalentes Metallionenchelat enthalten, sowie einen Indikator, der dazu befähigt ist, mit dem Metallion zu reagieren und ein Puffermittel, wie in der US-PS 4 303 409 beschrieben; und Zusammensetzungen, die ganz verschiedene reduzierbare Verbindungen enthalten, wie sie in den US-PS 3 331 752; 3 711 252; 4 101 381; 4 116 774; 4 224 034 und 3 954 412 beschrieben werden.
Wie erwähnt, sind die zum gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugten reduzierbaren Zusammensetzungen oder Redox-Reagenzien Cobalt(III)-Komplexe enthaltende Reagenzien. Cobalt(III) ist ein trivalentes Metall, das in typischer Weise eine Koordinationszahl von 6 aufweist. Eine extrem große Anzahl von Liganden ist bekannt, daß sie sich zu einer Koordination mit Cobalt(III) eignet. Werden die Liganden so ausgewählt, daß sie eine negative Ladung aufweisen, so kann eine Valenz durch den Liganden abgesättigt werden. Ist andererseits der Ligand elektrisch neutral, so muß die Valenz durch ein nicht-koordiniertes Gegenion abgesättigt werden, wobei ein Salz gebildet wird. Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden in Wasser lösliche Komplexe benötigt. Die Cobalt(III)-Komplexsalze, die mehr wasserlöslich sind, sind die bevorzugten.
Zu den geeigneten neutralen Liganden für die Bildung von Co(III)-Komplexen gehören: Ammoniak; aliphatische Amine, z. B. Ethylendiamin, Propylendiamin, Diethylentriamin; substituierte oder unsubstituierte aromatische Amine, z. B. Anilin, 2-Aminoethylanilin, 2,2'-Bisanilin; substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Amine, z. B. Pyridin, 2,2'-Bipyridin; 2-(Aminomethyl)pyridin, 4,4'-Dimethyl-2,2'- bipyridin, 2,2',2''-Terpyridin, Morpholin, Pyrimidin, Pyridazin, 2,2'-Bipyrazin, Chinolin, Isochinolin, Acridin, Thiazol, Imidazol, Triazin, 1,10-Phenanthrolin, 5-Nitrophenanthrolin, 2,2'-Bipyrimidin, 2,2'-Diimidazol sowie Sauerstoff-Donor-Liganden, z. B. Amide, wie z. B. N,N- Dimethylformamid und Wasser. Irgendein Anion kann als Gegenion vorhanden sein. Aus Zweckmäßigkeitsgründen sind Halogenidionen die bevorzugten Ionen, wie beispielsweise Chlorid, Bromid und Iodid. Zu anderen geeigneten Gegenanionen gehören beispielsweise Azid-, Thiocyanat-, Tetrafluoroborat-, Nitrat-, Perchlorat-, Hexafluorophosphat-, Sulfat-, Carbonat-, Sulfonat- und Carboxylationen.
Anionische Liganden können ebenfalls mit Cobalt(III) koordinieren, vorausgesetzt, die Ladung am Cobalt(III) ist nicht vollständig durch die Liganden neutralisiert, so daß der Komplex ein Salz ist und infolgedessen in Wasser löslich. Zu geeigneten anionischen Liganden gehören Halogenide, d. h. Chlorid-, Bromid-, Iodid- oder Fluorid-, Azid-, Thiocyanat-, Nitrit-, Carbonat-, Carboxylat-, Sulfonat-, Oxalat- und 2,4- Pentandionationen.
Der zum gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte Cobaltkomplex ist [Co(ethylendiamin)&sub2;(2,2'bipyridin)]Cl&sub3;.
Die andere Komponente, die in der Cobalt(III) enthaltenden reduzierbaren Zusammensetzung oder dem Redoxreagens verwendet wird und sich für die vorliegende Erfindung eignet, ist ein in Wasser löslicher metallisierbarer Farbstoff. Eine Vielzahl von Farbstoffen, die zu einer Koordination mit einem Cobalt(II)- und -(III)-Ion befähigt sind, sind geeignet. Die Farbstoffe müssen in Wasser löslich sein. Viele der speziellen Farbstoffe, die in den unten aufgeführten Literaturstellen angegeben sind, sind nicht in Wasser löslich, lassen sich jedoch leicht wasserlöslich machen, durch Einverleiben einer geeigneten löslichmachenden Gruppe in das Farbstoffmolekül, wozu übliche bekannte Methoden angewandt werden können. Übliche löslichmachende Gruppen, wie beispielsweise Carbonsäure-, Sulfonsäure- und Sulfatgruppen sind geeignet.
Bevorzugte Farbstoffe sind ebenfalls Tridentatliganden für Cobalt. Tridentatliganden bilden stabilere Komplexe und können infolgedessen Liganden von dem Cobalt(II)-Komplex leichter verdrängen.
Unter Berücksichtigung dieser Kriterien werden geeignete Farbstoffe und Farbstoffklassen in den US-PS 4 396 546; 4 273 708; 4 272 434; 4 024 993; 4 147 544 und 4 419 435 beschrieben.
Die bevorzugten Farbstoffe sind: 2-[(3-Methyl-2- pyridyl)azo]-1-naphthol-4-sulfonsäure, Monoammoniumsalz; 2- [(5-Carboxy-2-pyridyl)azo]-1-naphthol-4-sulfonsäure, Diammoniumsalz; und 2-[(3-Ethyl-5-sulfo-2-pyridyl)azo]-1- naphthol-4-sulfonsäure, Diammoniumsalz.
Das Elektronenübertragungsmittel und die reduzierbare Zusammensetzung können mit einer Pufferlösung kombiniert werden. Zu geeigneten Puffern gehören solche, die den pH-Wert der Zusammensetzung bei 9 oder darunter halten, vorzugsweise bei etwa 6,5 bis etwa 8. Zu repräsentativen Puffern gehören Phosphate, Borate, N-2-Hydroxy-ethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure und andere Puffer, die bekannt sind, z. B. solche, die beschrieben werden von Good und anderen in Biochem., 5, Seite 467 (1966) und Anal. Biochem. 104, 300 (1980).
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung sind geeignet für analytische Bestimmungen (d. h. quantitative, halbquantitative oder qualitative Bestimmungen) von wäßrigen oder nicht wäßrigen Flüssigkeiten, z. B. biologischen Flüssigkeiten, Herstellungsverfahren, Abwässern, Nahrungsmitteln und dgl.. Untersuchungen lassen sich durchführen mit verschiedenen Analyten, einschließlich lebenden Zellen (z. B. Bakterien, Hefe, Pilzen und dgl.), Enzymen (z. B. Lipase, Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Creatinkinase, α-Glycerophosphatoxidase, Lactatdehydrogenase, Alaninaminotransferase, Aspartataminotransferase und im Falle von anderen Bestimmungen auf NADH- Basis oder Peroxidase-Basis, wozu Dehydrogenase- oder Reduktaseenzyme gehören, biologische oder chemische Reduktantien oder andere lebende Zellen, die das Elektronenübertragungsmittel reduzieren, z. B. Ascorbat, Cystein, Glutathion usw.), metabilisierbare Substanzen (z. B. Glucose, Milchsäure, Triglyceride, Cholesterin usw.), Immunoreagenzien (z. B. Antigene, Antikörper, Haptene usw.) sowie andere Bestimmungen, die über eine einzelne Reaktion oder eine Folge von Reaktionen erfolgen, wobei eine Reduktion der reduzierbaren Verbindung erfolgt und die Freisetzung einer bestimmbaren Spezies.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders geeignet für die Erkennung oder Quantifizierung von lebenden Zellen in biologischen Proben. Obgleich eine beliebige biologische Probe, von der erwartet wird, daß sie lebende Zellen enthält, (z. B. ein Nahrungsmittel, Gewebe, Grundwasser, Kühlwasser, pharmazeutische Produkte, Abwasser usw.) auf Bakterien, Hefe, Pilze usw. erfindungsgemäß analysiert werden kann, eignet sich die Erfindung besonders für eine Bestimmung von Bakterien in wäßrigen Flüssigkeiten, wie beispielsweise menschlichen und tierischen Flüssigkeiten (z. B. Urin, cerebraler spinaler Flüssigkeit, Blut und dgl., wie auch Stuhlsekretionen) sowie Suspensionen von menschlichem oder tierischem Gewebe. Die Praxis dieser Erfindung ist von besonderer Bedeutung für die Bestimmung von Harnwegsinfektionen im Urin (verdünnt oder unverdünnt).
Die Bestimmung von lebenden Zellen, und insbesondere von Bakterienzellen, erfolgt oftmals in Gegenwart eines Nährmittels für diese Zellen, obwohl das Vorhandensein des Nährmittels nicht wesentlich ist. Ein beliebiges Nährmittelmedium kann verwendet werden, das geeignete Kohlenstoff- und gegebenenfalls Stickstoff-Lieferanten enthält. Konventionelle Nährmittelmedien mit geeigneten Komponenten und pH-Werten sind allgemein bekannt. Besonders geeignete Nährmittel und Nährmedien sind leicht metabolisierbare Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise einfache Zucker (Glucose, Sucrose, Raffinose, Maltose, Lactose, Galactose, Fructose usw.), Glycole (z. B. Glycerin, Sorbitol usw.), Carbonsäuren (z. B. Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure usw. oder Salze hiervon), Stärke, Tryptose und dgl.. Besonders geeignete Nährmittel sind Glucose oder Tryptose, allein oder in Kombination miteinander.
Die vorliegende Erfindung ist anpaßbar an Bestimmungsmethoden in Lösung oder mit trockenen Elementen. Im Falle von Lösungsbestimmungen kann eine analytische Zusammensetzung mit einer reduzierbaren Zusammensetzung (z. B. Cobalt(III) enthaltende Reagenzien), die eine bestimmbare Spezies liefert und mit einem Elektronenübertragungsmittel hergestellt und mit einer flüssigen Testprobe vermischt werden, welche die lebenden Zellen der den zu bestimmenden Analyten enthält. Das Elektronenübertragungsmittel kann auch in der Testprobe vor dem Vermischen mit der reduzierbaren Zusammensetzung vorhanden sein. Im allgemeinen wird die analytische Zusammensetzung mit der Testprobe in einem geeigneten Gefäß vermischt (z. B. einem Teströhrchen, einer Petrischale, einem Becher, einer Küvette usw.). Die erhaltene Lösung (oder Dispersion) wird dann vorsichtig gemischt und eine relativ kurze Zeitspanne lang inkubiert (z. B. bis zu etwa 30 min) bei einer Temperatur bis zu etwa 40ºC, im allgemeinen von etwa 20 bis etwa 40ºC. Die Testprobe wird dann untersucht durch Messen der bestimmbaren Spezies (z. B. Chromogen oder Fluorogen), die durch Reduktion der reduzierbaren Zusammensetzung freigesetzt wurde. Eine solche Bestimmung kann mittels einer geeigneten Bestimmungsvorrichtung durchgeführt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine zu testende Urinprobe zunächst filtriert. Die reduzierbare Zusammensetzung wird dann zugegeben und das Auftreten einer Farbveränderung wird bestimmt. Ist es erwünscht, den Typ der Infektion, die vorliegen kann, zu bestimmen, so können zwei Urinproben untersucht werden. Eine unbehandelte Probe wird dazu verwendet, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Zellen irgendeines Typs zu ermitteln. Eine zweite Probe wird zunächst mit einem anionischen oberflächenaktiven Mittel behandelt, wie es beschrieben wird in der US-PS 4 525 435 vom 25. Juni 1985.
Die Lösungsbestimmung kann auch durch Kontaktieren eines porösen, absorbierenden Materials, z. B. eines Papierstreifens, der die Testprobe enthält, mit der analytischen Zusammensetzung erfolgen. Der Analyt in der Testprobe kann von dem porösen Material in die Zusammensetzung wandern, unter Einleitung der analytischen Reaktion, die für die Bestimmung erforderlich ist.
Teststreifen können als geeignetes Mittel dazu verwendet werden, um abgemessene Mengen an analytischer Zusammensetzung in die Testlösung einzuführen. Der Teststreifen wird in eine Lösung eingeführt, die bereits die Zellen, die bestimmt werden sollen, enthält. Die Reagenzien lösen sich aus dem Teststreifen und gelangen in die Lösung, unter Erzeugung der Reaktionslösung. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Teststreifen der Erfindung werden die Reagenzien von einem in Wasser löslichen Bindemittel getragen. Wird der Teststreifen in die Lösung eingetaucht, so löst sich das Bindemittel unter Freisetzung der Reagenzien. Aus bisher noch nicht geklärten Gründen führt diese Art der Zuführung von Cobalt(III) enthaltenden Reagenzien zu einer verbesserten Empfindlichkeit im Vergleich zur Verwendung von frisch bereiteten Lösungen der Reagenzien. Zu geeigneten, in Wasser löslichen Polymeren, gehören N-Vinylpyrrolidonpolymere wie Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon)homopolymere wie auch Copolymere, z. B. Copolymere mit Acrylamide, z. B. Poly(acrylamid-co-N- vinyl-2-pyrrolidon) Gew.-Verhältnis 90:10.
Im allgemeinen ist im Falle einer Lösungsuntersuchung die Menge an reduzierbarer Verbindung in der reduzierbaren Zusammensetzung etwa 0,001 bis etwa 10 und vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 1 millimolar. Das Elektronenübertragungsmittel liegt im allgemeinen in einer Konzentration vor, die etwa 0,001 bis etwa 2 und vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 1 millimolar ist. Andere Reagenzien können in Mengen vorhanden sein, die vom Fachmann leicht ermittelt werden können.
In alternativer Weise kann die Erfindung im Rahmen eines "trockenen" Bestimmungsverfahrens durchgeführt werden, bei dem ein trockenes analytisches Element verwendet wird. Ein solches Element kann ein einfaches absorbierendes Trägermaterial sein, d. h. ein dünnes Blatt oder Streifen aus einem selbsttragenden absorbierenden der saugfähigen Material sein, z. B. Filterpapier oder Filterstreifen, worin die reduzierbare Zusammensetzung und das Elektronenübertragungsmittel enthalten sind oder ein getrockneter Rückstand derselben. Derartige Elemente sind bekannt als Teststreifen, diagnostische Elemente, Tauchstreifen, diagnostische Mittel und dgl..
Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung weist ein Element für die Bestimmung von Mikroorganismen (z. B. Hefe, Pilzen, Bakterien usw.) in einer wäßrigen Flüssigkeit eine absorbierende Ausbreitzone auf, die ein Elektronenübertragungsmittel enthält sowie Cobalt(III) enthaltende Reagenzien, wie sie beide im vorstehenden beschrieben wurden. Es ist wünschenswert, daß diese Elemente auch ein Nährmittel oder Nährmedium für die lebenden Zellen enthalten und einen Puffer, welcher einen physiologischen pH-Wert unter Verwendungsbedingungen aufrechterhält (d. h. wenn das Element mit einer Flüssigkeitsprobe von 1 bis 100 ul in Kontakt gebracht wird). Ein solches Element kann dazu verwendet werden, um Bakterien zu ermitteln, beispielsweise in einer Urinprobe (vorbehandelt zur Eliminierung von störenden reduktiv wirkenden Komponenten) durch physikalisches Inkontaktbringen der Probe und des Elementes in geeigneter Weise und Bestimmung des Farbstoffes, der aus den Cobalt(III) zu Reagenzien gebildet wird.
In dem unten folgenden Beispiel 1 wird die Verbindung 4,5- Dimethoxy-1,2-benzochinon verwendet. Dies ist die oben mit "A" bezeichnete Verbindung. Diese Verbindung wurde hergestellt nach der Methode von Y. Itoh und anderen, Bull. Chem. Soc. Japan. 52, 2169 (1979) wie folgt:
Eine Mischung von Natriumiodat (20 g, 0,1 mol) und Brenzkatechin (5,5 g, 0,05 mol) in trockenem Methanol (500 ml) wurde 20 h lang auf 60ºC erhitzt. Die Mischung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, worauf das Filtrat auf 50 ml konzentriert wurde. Die verbleibende Lösung wurde abgekühlt und die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert und an der Luft getrocknet. Die feste Masse wurde in Methylenchlorid gelöst und filtriert und die erhaltene feste Masse, die beim Eindampfen des Filtrates erhalten wurde, wurde aus Isopropylalkohol umkristallisiert. Die Kristalle wurden in einer Mischung von Ethylacetat und Acetonitril gelöst und durch einen Kegel aus Silicagel geführt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurden 2,75 g (33%) des gewünschten Produktes mit einem Fp. von 227-228ºC erhalten. Andere ortho-Chinone, die in den Beispielen verwendet wurden, wurden in entsprechender Weise hergestellt.

Beispiel 1

Dies Beispiel vergleicht die Bestimmung von 1·1&sup5; Escherichia coli pro ml mit dem Elektronenübertragungsmittel 2,3-Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzochinon, einem para-Chinon- Elektronenübertragungsmittel gemäß EP-A-190740 sowie 4,5-Dimethoxy-1,2-benzochinon, einem ortho-Chinon-Elektronenübertragungsmittel, wie im vorstehenden beschrieben.
Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt (es wurde destilliertes Leitungswasser verwendet):
A. Phosphatpuffer: Durch Vermischen der geeigneten Mengen von Lösung X und Y, wie unten angegeben, und Verdünnen auf ein Gesamtvolumen von 500 ml wurde ein 0,05 M Phosphatpuffer des erforderlichen pH-Wertes hergestellt:
X: 0,1 M monobasisches Kaliumphosphat,
Y: 0,1 N dibasisches Kaliumphosphat,
pH 6,80; 112,5 ml X und 137,5 ml Y,
pH 7,50; 40 ml X und 210 ml Y,
ph 7,80; 21,25 ml X und 228,75 ml Y.
B. Zellensuspension: Escherichia coli-Zellen (American Type Culture Collection Nr. 25922) wurden in einem Gehirn-Herz-Infusionsmedium (Difco Labs) bei 37ºC ohne zu schütteln gezüchtet. 40 ml der Zellen, die über Nacht gezüchtet worden waren, wurden durch Zentrifugieren unter Bildung eines Pellets der Zellen geerntet.
Die Pellets wurden in 25 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 7,5) resuspendiert, worauf die erhaltene Suspension rezentrifugiert wurde. Das gewaschene Pellet wurde in 25 ml Puffer suspendiert, worauf ein Aliquot mit dem gleichen Puffer verdünnt wurde, um eine Absorption von 0,833 bei 620 nm, gemessen gegenüber dem reinen Puffer, zu erhalten. Eine Absorption von 0,833 wurde bestimmt, entsprechend einer Zellenkonzentration von 5·10&sup8; Zellen/ml. Diese Lösung wurde dann im Verhältnis 1 zu 100 verdünnt, wodurch eine Vorratssuspension erhalten wurde mit 5·10&sup6; E. coli/ml.
C. Glucoselösung: 10 Gew.-% Glucose in filtriertem destilliertem Wasser.
D. Cobaltlösung: 41,44 mg [Co(ethylendiamin)&sub2;(2,2'- bipyridin)]Cl&sub3; wurden in 10 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers und einem pH von 7,80 gelöst.
E. Farbstofflösung: 30,5 mg 2-[(5-Carboxy-2-pyridyl)azo]- 1-naphthol-4-sulfonsäure, Diammoniumsalz, wurden in 10 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers mit einem pH von 7,80 gelöst.
F. Elektronenübertragungsmittel-(ETA)Lösung: 0,01 M 2,3- Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzchinon in Methanol. (Vergleich para-Chinon ETA)
G. Elektronenübertragungsmittellösung: 0,008 M 4, 5-Dimethoxy-1,2-benzochinon in Methanol (ein ortho-Chinon-Elektronenübertragungsmittel, das erfindungsgemäß geeignet ist).
Das Bestimmungsprotokoll verwendete eine Mischung von 2,34 ml Phosphatpuffer mit einem pH von 6,8, 25 ul Vorratslösung C, 50 ul Vorratslösung E, 500 ul Vorratslösung D, 25 ul entweder ETA-Lösung F oder G und schließlich 60 ul Suspension E. Die Endkonzentration an E. coli lag bei 1·10&sup5; Zellen/ml. Die Mischung wurde geschüttelt und auf thermischem Wege auf ein Gleichgewicht bei 37ºC eingestellt. Der Reaktionsverlauf wurde über einen Zeitraum von 30 min beobachtet, wobei das Auftreten von Farbstoff bei 610 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers untersucht wurde. Zu Vergleichszwecken wurde ein Vergleichstest durchgeführt, der sämtliche der angegebenen Komponenten enthielt, mit Ausnahme der E. coli-Zellen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt in Form des Unterschiedes der optischen Dichte (Δ0D nach 30 min) minus Hintergrund.

Tabelle 1

Δoptische Dichte nach 30 min

ortho-Chinon 0,350
para-Chinon (Vergleich) 0,075
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eindeutig die Überlegenheit des ortho-Chinons im Vergleich zum para-Chinon.

Beispiele 2 und 3

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme jedoch, daß die End-Zellenkonzentration bei 1·10&sup6; Zellen/ml lag, daß die Farbstofflösung 35,7 mg von 2-[(3-Methyl-5-sulfo-2- pyridyl)azo]-1-naphthol-4-sulfonsäure, Diammoniumsalz, gelöst in 10 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers mit einem pH von 7,80, enthielt und zwei verschiedene Elektronenübertragungsmittel gemäß der Erfindung verwendet wurden. Die Elektronenübertragungsmittel waren:
Der Δ0D-Wert wurde in jedem Falle ermittelt, wie in Beispiel 1, wie folgt:

Tabelle 2

ortho-Chinon B 30 min 1,725
para-Chinon C 18 min 1,077

Beispiel 4

Dies Beispiel veranschaulicht die Bestimmung von Escherichia coli-Zellen mit dem Elektronenübertragungsmittel Trimethyl- 1,4-benzochinon, einem para-Chinon-Elektronenübertragungsmittel, das in der US-Patentanmeldung mit der Serial Nr. 699 374 beschrieben wird und 4,5-Dimethoxy-1,2-benzochinon, ortho-Chinon-Elektronenübertragungsmittel, wie hier beschrieben. Anstelle der Cobaltreagenzien wurde eine RIND- Verbindung verwendet.
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt (es wurde destilliertes Leitungswasser verwendet):
A. Puffer: HEPES-Puffer ([N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N'-2- ethansulfonsäure]), 0,05 M, pH 7,8, filtriert durch ein 0,2 u Filter.
B. RIND-Verbindung: Eine Lösung enthaltend eine RIND- Verbindung, gelöst in 250 ul N,N-Dimethylformamid (DMF) wurde hergestellt. Das DMF wurde mit 0,1% Schwefelsäure angesäuert. Dies RIND-Lösung wurde zu 25 ml des HEPES- Puffer zugegeben unter Bildung der RIND-Dispersion. Die RIND-Verbindung hatte die folgende Struktur:
C. Glucoselösung: wie im Falle des Beispieles 1.
D. Zellensuspension: wie im Falle des Beispieles 1 (5·10&sup8; Zellen/ml Vorratslösung).
E. Elektronenübertragungsmittellösung: Entsprach der Lösung F des Beispieles 1. Dies ist ein Vergleichs- Elektronenübertragungsmittel, wie oben angegeben.
F. Elektronenübertragungsmittellösung: Gleiche Lösung wie im Falle der Lösung G des Beispieles 1 mit der Ausnahme, daß die Konzentration 0,01 M war. Hierbei handelt es sich um ein Elektronenübertragungsmittel im Sinne der Erfindung.
Eine Reagenzlösung wurde hergestellt durch Vermischen von 500 ul von jeweils der Glucoselösung C, der RIND-Dispersion B und einer der beiden ETA-Lösungen E oder F. Zu den zwei erhaltenen Reagenslösungen wurden 1380 ul des HEPES-Puffers zugegeben sowie 120 ul der Zellensuspension, so daß die Endkonzentration an Zellen bei 2·10&sup7; Zellen/ml lag. Vergleichsproben wurden hergestellt, die sämtliche Komponenten mit Ausnahme der Zellen enthielten. Die optischen Dichten wurden bei 540 nm gemessen und die Veränderung der optischen Dichte nach 30 min, auf den Hintergrund korrigiert, wurde bestimmt (Δ0D). Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten folgenden Tabelle 3 zusammengestellt:

Tabelle 3

Δoptische Dichte nach 30 min

ortho-Chinon 0,800
para-Chinon (Vergleich) 0,646
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Überlegenheit des ortho-Chinons im Vergleich zum para-Chinon, bei Verwendung der RIND-Verbindung.

Beispiel 5

Dies Beispiel vergleicht die Bestimmung von 1·10&sup6; E. coli pro ml mit 2,3-Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzochinon, einem para-Chinon gemäß US-Patentanmeldung Serial Nr. 699 374 und somit einer Vergleichsverbindung; 4,5-Diemthoxy-1,2- benzochinon, einem bevorzugten Benzochinon gemäß der vorliegenden Erfindung; und 4,5-Diethoxy-1,2-benzochinon, dem nächsten benachbarten Homologen der Dimethoxyverbindung. Die Diethoxyverbindung liegt nicht innerhalb des Erfindungsbereiches. Die Versuche dieses Beispieles wurden wie im Falle des Beispieles 1 durchgeführt.
Die in Tabelle 4 zusammengestellten Daten zeigen den Unterschied in der optischen Dichte nach 30 min minus der Hintergrunddichte im Falle der drei getesteten Verbindungen. Im Falle der Dimethoxyverbindung der Erfindung ergibt sich der Unterschied in der optischen Dichte nach nur 18 min. Zu diesem Zeitpunkt war der Farbstoff erschöpft. Im Falle der anderen Verbindungen handelt es sich um Daten nach 30 min.

Tabelle 4

ETA Δ0D
para-Chinon (Vergleich) 1,144 (30 min)
Dimethoxy-ortho-Chinon 1,314 (18 min)
Diethoxy-ortho-Chinon (Vergleich) 0,496 (30 min)
Die Daten zeigen, daß die Verbindung der Erfindung dem para- Chinon überlegen ist. Eine nächst benachbarte homologe Verbindung eines bevorzugten Verbindung der Erfindung führt ebenfalls zu schlechteren Ergebnissen.

Claims

1. Zusammensetzung für die Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeit mit:

(a) einem Elektronen-Übertragungsmittel (ETA), bei dem es sich um ein stabiles, in Methanol lösliches 1,2- Benzochinon handelt mit Methoxygruppen oder einem ankondensierten 1,4-Dioxanring in den Positionen 4 und 5 oder mit einer substituierten oder unsubstituierten kurzkettigen Alkoxygruppe, ausgenommen einer Methoxygruppe, in der Position 4 und einem ankondensierten 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring in den Positionen 5 und 6,

(b) einer reduzierbaren Zusammensetzung mit einer Verbindung, die bei Reduktion durch das ETA-Mittel einer Farbveränderung unterliegt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Chinon der folgenden Strukturformel entspricht:

worin bedeuten: R&sub4; und R&sub5; Methoxy und R&sub3; und R&sub6; unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes kurzkettiges Alkoxy oder substituiertes oder unsubstituiertes kurzkettiges Alkyl oder R&sub4; und R&sub5; gemeinsam einen ankondensierten 1,4-Dioxanring und R&sub3; und R&sub6; haben die oben angegebene Bedeutung oder R&sub5; und R&sub6; gemeinsam einen ankondensierten 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring, R&sub4; substituiertes oder unsubstituiertes kurzkettiges Alkoxy, ausgenommen Methoxy und R&sub3; hat die oben angegebene Bedeutung.

3. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in der das Chinon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 4,5-Dimethoxy-1,2-Benzochinon und 4-Methoxycarbonylmethoxy-1,2-naphthochinon.

4. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in der die reduzierbare Zusammensetzung einen in Wasser löslichen Cobalt(III)komplex umfaßt und einen in Wasser metallisierbaren Farbstoff.

5. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Kohlenstofflieferanten enthält.

6. Zusammensetzung nach einem dar vorstehenden Ansprüche mit:

1) 4,5-Dimethoxy-1,2-benzochinon

2) [Co(ethylendiamin)&sub2;(2,2'bipyridin)]Cl&sub3;

3) 2-([5-Carboxy-2-pyridyl)azo]-1-naphthol-4-sulfonsäure, Diammoniumsalz.

7. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Flüssigkeit mit den Stufen:

A. Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit bei einem pH-Wert von 9 oder weniger mit einer Zusammensetzung mit

(a) einem Elektronen-Übertragungsmittel (ETA), bei dem es sich um ein stabiles, in Methanol lösliches 1,2-Benzochinon handelt mit Methoxygruppen oder einem ankondensierten 1,4-Dioxanring in Positionen 4 und 5 oder mit einer substituierten oder unsubstituierten kurzkettigen Alkoxygruppe, ausgenommen einer Methoxygruppe, in Position 4 und einem ankondensierten 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring in den Positionen 5 und 6,

(b) einer reduzierbaren Zusammensetzung mit einer Verbindung, die bei der Reduktion mit ETA einer Farbveränderung unterliegt und

B. Bestimmung der Farbveränderung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Flüssigkeit Urin ist, und der Analyt aus Zellen besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, in dem das Chinon die folgende Strukturformel aufweist:

worin bedeuten: R&sub4; und R&sub5; Methoxy und R&sub3; und R&sub6; unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes kurzkettiges Alkoxy oder substituiertes oder unsubstituiertes kurzkettiges Alkyl oder R&sub4; und R&sub5; gemeinsam einen ankondensierten 1,4-Dioxanring und R&sub3; und R&sub6; wie oben angegeben, oder R&sub5; und R&sub6; gemeinsam einen ankondensierten 5- oder 6-gliedrigen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring, R&sub4; ein substituiertes oder unsubstituiertes kurzkettiges Alkoxy, ausgenommen Methoxy und R&sub3; ein Rest wie oben angegeben.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, bei dem das Chinon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 4,5- Dimethoxy-1,2-benzochinon und 4-Methoxycarbonylmethoxy- 1,2-naphthochinon.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, in dem die reduzierbare Zusammensetzung einen in Wasser löslichen Cobalt(III)komplex enthält und einen in Wasser löslichen metallisierbaren Farbstoff.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, weiter gekennzeichnet durch einen Kohlenstofflieferanten.

13. Verfahren nach Anspruch 7, in dem die Zusammensetzung aufweist:

1) 4,5-Dimethoxy-1,2-benzochinon

2) [Co(ethylendiamin)&sub2;(2,2'bipyridin)]Cl&sub3;

3) 2-[(5-Carboxy-2-pyridyl)azo]-1-naphthol-4-sulfonsäure, Diammoniumsalz.