DE69021389T2

DE69021389T2 - Verfahren und reagenz zur bestimmung eines analyten auf enzymatischem wege mittels eines eisen-iii-zyan /eisen -iii-verbindungssystems.

Info

Publication number: DE69021389T2
Application number: DE69021389T
Authority: DE
Inventors: Helmut Freitag
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1996-03-07
Anticipated expiration: 2010-03-16
Also published as: EP0496730A1; ATE125871T1; DE69021389D1; EP0496730A4; AU5277890A; EP0496730B1; ES2077061T3; WO1990012487A2; US4929545A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe sowie eine bei diesem Verfahren brauchbare Reagenszusammensetzung. Von besonderem Interesse sind Verfahren und Reagenzien, die bei der Bestimmung von Glucose bzw. Cholesterin brauchbar sind.

HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Das zentrale Anliegen der klinischen Chemie ist die qualitative und quantitative Bestimmung bestimmter Analyten in einer Probe. Von besonderem Interesse ist die Analyse von Körperflüssigkeitsproben wie etwa Blut, Serum, Urin etc.. Die Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge verschiedener Analyten, gefolgt von einem Vergleich mit festgesetzten Parametern, bestimmt die Diagnose von Krankheits- oder anomalen Zuständen.
Die Literatur zur analytischen Bestimmung von Körperflüssigkeitsproben ist enorm, da auf diesem Fachgebiet die Bestimmung z.B. von Glucose, Cholesterin, Kreatin, Sarcosin, Harnstoff und anderen Substanzen in Proben von Blut, Serum, Urin etc. untersucht worden ist.
Die frühe klinische Literatur lehrte verschiedene nicht-enzymometrische Methoden zur Bestimmung von Analyten. Beispielhaft dafür sind die frühen Tests zur Glucose-Bestimmung, gelehrt von Kaplan und Pesce in Clinical Chemistry: Theory, Analysis and Correlation (Mosby, 1984), S. 1032- 1042. Zu diesen Tests gehören die Reduktion von Kupfer- Ionen, die Reaktion von Kupfer mit Molybdat etc.. Diese Methoden sind, worauf in dieser Literaturstelle hingewiesen wird, aufgrund von schlechter Spezifität und Störung durch andere Analyten nicht hinreichend genau. Eine von Kaplan et al. beschriebene Methode ist der alkalische Cyanoferrat(III)-Test. Bei dieser Methode wird eine Glucose enthaltende Lösung in Gegenwart von Cyanoferrat(III) unter alkalischen Bedingungen erhitzt. Die Reaktion
geht mit einer Farbänderung von gelb nach farblos einher. Entweder wird dieser Farbschwund gemessen oder man mißt die Reaktion des farblosen Cyanoferrat(II)-Ions mit Eisen(III)- Ion unter Bildung des intensiv gefärbten Niederschlags Preußisch Blau.
Die Bildung von Preußisch Blau ist ein wesentlicher Teil der hierin beschriebenen Erfindung, so daß auf diesen Test nachstehend noch einmal eingegangen wird.
Als sich die Enzymologie als Wissenschaft mehr und mehr entwickelte, wurden diese frühen Tests vom Typ "Chelatbildung" durch spezifischere Assays ersetzt. Enzyme sind für ihre außerordentliche Spezifität bekannt; so kann ein erfahrener Fachmann durch Verwendung eines geeigneten Enzyms ziemlich leicht bestimmen, ob ein bestimmter Analyt vorhanden ist oder nicht und wieviel davon. Diese enzymatischen Systeme müssen mit Indikatorsystemen kombiniert sein, die in Kombination mit der Enzymreaktion ein erfaßbares Signal ergeben. Kaplan beschreibt ein Glucose/Hexokinase-System sowie ein Glucoseoxidase-System, und diese sind in der Fachwelt recht gut bekannt. Sie werden verwendet in Verbindung mit Indikatorsystemen wie etwa den als Trinder-Reagenzien bekannten "gekoppelten Indikatoren" oder oxidierbaren Indikatoren wie etwa o-Tolidin und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin. Bei diesen Systemen ergibt die Reaktion des Enzyms mit seinem Substrat einen Überschuß an Elektronen, die das Enzym trägt und die durch die Indikatorsysteme abgezogen werden. Darauf folgt eine Farbbildung, die Gegenwart, Abwesenheit oder Menge eines Analyten in der Probe angibt.
Erörterungen derartiger Systeme finden sich in der Patentliteratur zuhauf. Eine Auswahl solcher Patente, die keineswegs erschöpfend ist, umfaßt 4 680 259, 4 212 938, 4 144 129 und 3 925 164 (Cholesterinoxidase) ; 4 672 029, 4 636 464, 4 490 465 und 4 418 037 (Glucoseoxidase), sowie 4 614 714 (L-Glutaminsäureoxidase). All diese enzymatischen Systeme "oxidieren" ihre Substrate (d.h., den fraglichen Analyten) dadurch, daß sie Elektronen daraus abziehen.
Sobald der Analyt seine Elektronen abgegeben hat, spielt er bei der Bestimmungsreaktion keine Rolle mehr. Wie vorstehend angegeben, können die Elektronen in ein farbbildendes System überführt werden, etwa das in US-Patent Nr. 4 291 121 beschriebene Trinder-System oder ein Tetrazolium- System wie es z.B. in US-Patent Nr. 4 576 913 beschrieben ist.
Indikatorsysteme sind jedoch nicht das einzige Hilfsmittel, mit dem die eingefangenen Elektronen gemessen werden können. Freie Elektronen erzeugen einen elektrischen Strom, der als Angabe für den Analyten gemessen werden kann. Derartige Systeme sind beschrieben z.B. von Schläpfer et al., Clin. Chim. Acta 57, 283-289 (1974). Bei diesen Systemen werden Substanzen eingesetzt, die als "Vermittler" geläufig sind und die Elektronen von den Enzymen abziehen. Schließlich geben die Vermittler die Elektronen ebenfalls frei, wodurch als Ergebnis ein meßbarer Strom erzeugt wird. Diese Vermittler können entweder ein oder zwei Elektronen pro Molekül Vermittler absorbieren. Cyanoferrat(III), der im Schläpfer-Zitat beschriebene bevorzugte Vermittler, nimmt ein Elektron pro Molekül Cyanoferrat(III) auf.
Elektronen-Vermittler sind bekannt und werden verwendet in Indikatorsystemen in Zusammenhang mit sogenannten "Farbstoff-Molekülen". Das vorstehend erwähnte Patent 4 576 913 lehrt z.B. den Vermittler Phenazinmethosulfat in Kombination mit einem Tetrazolium-Salz. Letzteres dient als Indikator. Die Verwendung dieser Vermittler ermöglicht eine Vorgehensweise ohne Sauerstoff. Normalerweise ist bei einer Reaktion zur Glucose-Bestimmung Sauerstoff erforderlich, um Elektronen vom reduzierten Enzym abzuziehen. Dadurch entsteht Wasserstoffperoxid:
wobei das Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase an einer Reaktion teilnimmt, die zu einer Farbbildung führt.
Bisweilen ist die Verwendung von Sauerstoff oder aeroben Systemen wegen der verschiedenen, diesen Systemen innewohnenden Probleme nicht erwünscht. Zum Beispiel ist bei diesen Reaktionen die Reaktion vom O&sub2;-Partialdruck in der Atmosphäre abhängig. Da das O&sub2; zudem das gesamte Testmedium durchdringen muß, muß der Aufbau derartiger Medien so angepaßt sein, um dieses Durchdringen zu ermöglichen. Es besteht also ein Interesse an Indikatorsystemen, die anearob sind, etwa diejenigen, bei denen ein Vermittler in Verbindung mit dem Indikator verwendet wird, oder elektrochemische Systeme, bei denen der Vermittler alleine verwendet wird.
Elektrochemische Systeme sind zwar brauchbar, aber gegenwärtig zum häufigen Testen nicht immer praktisch und, was die Anwendung zuhause angeht, sind Personen, die ihre Glucose-Spiegel täglich messen müssen, an Systeme gewöhnt, bei denen eine Farbänderung angewandt wird. Deshalb besteht ein Bedarf an anaeroben Systemen, bei denen Indikatorreaktionen unter Erzeugung eines erfaßbaren Signals wie etwa einer Farbe genutzt werden.
Zwar stehen Indikatorsysteme des oben beschriebenen Typs zur Verfügung, doch gibt es damit Schwierigkeiten insofern als die Indikatormoleküle selbst häufiig instabil sind und keine lange Gebrauchsfähigkeitsdauer aufweisen. Es besteht demzufolge ein Interesse an Systemen, bei denen stabile Moleküle verwendet werden, die ein erfaßbares Signal erzeugen können.
Man wird sich erinnern, daß Kaplan die Bildung von Preußisch Blau bei der Glucose-Bestimmung lehrte, sie aber wegen des Mangels an Spezifität als tragbare Alternative verwarf. Davon abgesehen sind die strengen Bedingungen, unter denen die Reaktion der Lehre gemäß vonstatten gehen soll, für enzymatische Assays völlig ungeeignet. Die von Kaplan gelehrte Reaktion erfordert Kochen der Lösung. Enzyme sind Proteinmoleküle, und eine Inaktivierung infolge Denaturierung ist charakteristisch für das, was eintritt, wenn man Proteine kocht. Mit den Wärmeparametern von Kaplan vor Augen würde ein erfahrener Fachmann diese Lehre für enzymatische Assays umgehen.
Eine Erwähnung des Preußisch-Blau-Systems findet sich in dem vorgenannten US-Patent Nr. 4 576 913. Dieses Patent lehrt eine Glycerindehydrogenase, die insofern in ähnlicher Weise wie 0xidasen arbeitet als dort die Entfernung von zwei Elektronen aus ihrem Substratmolekül gelehrt wird. In Spalte 5 des Patents wird das Preußisch-Blau-System (das als "Berliner Blau" bezeichnet wird) als Indikator angegeben.
Dieses Patent muß jedoch als Ganzes gelesen werden, insbesondere seine Lehre zur Funktionsfähigkeit des Enzyms. Enzyme sind extrem pH-empfindlich, und das Enzym des Adachi-Patents soll in einem pH-Bereich von 6,0 bis 10,0 arbeiten, optimalerweise bei 7,0 bis 8,5. Deshalb würden diese Lehren einen Fachmann daran denken lassen, daß aufgrund dessen, daß die Glycerindehydrogenase bei alkalischen pHs arbeitet, die Anpassung des Preußisch-Blau-Systems an einen enzymatischen Nachweis bei alkalischen pHs erfolgen würde. Eisensalze werden jedoch bei alkalischen pHs gefällt, wodurch sie von der Teilnahme an einer Reaktion ausgeschlossen würden, bei der unter den von Adachi als erforderlich beschriebenen Bedingungen Preußisch Blau gebildet wird.
Recht überraschend hat der Erfinder nun gefunden, daß sich enzymatische Assays unter Anwendung der Preußisch-Blau-Bildung durchführen lassen. Bei diesen Assays werden keine Parameter angewandt, mit denen eine Inaktivierung des Enzyms riskiert wird, etwa starke Hitze. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß nach Zugabe einer Probe zu einer Reagenzienkombination, enthaltend ein Enzym wie etwa Glucoseoxidase oder Cholesterinoxidase, ein Cyanoferrat(III)- Salz und ein Eisen(III)-Salz, gepuffert bei einem pH, unterhalb dessen eine Inaktivierung des Enzyms zu erwarten ist, die Enzymreaktion trotzdem vonstatten geht und der Puffer die Reaktion von Cyanoferrat(III) und Fe³&spplus; nicht stört.
Daher ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Reagenszusammensetzung bereit zustellen, die brauchbar ist zur anaeroben Bestimmung eines Analyten in einer Probe und die ein für den zu bestimmenden Analyten spezifisches Enzym, eine Cyanoferrat(III)-Verbindung und eine lösliche Eisen(III)-Verbindung umfaßt, wobei die Reagenszusammensetzung einen pH unter 7 aufweist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung wie etwa Teststreifen bereitzustellen, die zur Bestimmung eines Analyten verwendet werden können und die die vorstehend beschriebene Reagenszusammensetzung in Reagensträger einbringen.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten bereit zustellen, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe mit der vorstehend beschriebenen Reagenszusammensetzung und Messen der Bildung von Preußisch Blau, d.h., des Komplexes aus Cyanoferrat(II) und Eisen(III)-Ionen als ein Maß für den betreffenden Analyten.
Wie bereits beschrieben, beruht diese Erfindung auf dem unerwarteten Befund, daß das Cyanoferrat(III) /Eisen(III)- Salz-System bei saurem pH funktionsfähig ist und unter Bedingungen, bei denen das verwendete Enzym normalerweise inaktiv wäre.
Aus der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen wird ersichtlich, wie die obenerwähnten Aufgaben dieser Erfindung erfüllt werden.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

In ihrer einfachsten Form ist die Erfindug eine Reagenszusammensetzung zur Bestimmung eines Analyten, umfassend ein Enzym, das mit dem zu bestimmenden Analyten spezifisch reagiert, eine lösliche Cyanoferrat(III)-Ionen enthaltende Verbindung, die in Gegenwart eines freien Elektrons zu einer Cyanoferrat(II)-Ionen enthaltenden Verbindung reduziert wird, eine lösliche Eisen(III)-Ionen enthaltende Verbindung, die mit der Cyanoferrat(II)-Ionen enthaltenden Verbindung reagiert, um ein Reaktionsprodukt zu bilden, sowie einen Puffer, der die Reaktion zwischen den Cyanoferrat(II)- und den Eisen(III)-Ionen nicht unterbindet, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 3,0 bis etwa 6,0 aufweist. Besonders bevorzugt ist ein pH von etwa 3,9 bis etwa 4,6.
Bei einem Enzym, "das mit einem zu bestimmenden Analyten spezifisch reagiert", erkennt der erfahrene Fachmann, daß das Enzym mit dem zu bestimmenden Analyten unter Ausschluß anderer reagiert. Zum Beispiel reagiert Glucoseoxidase spezifisch mit Glucose.
Eine "lösliche Cyanoferrat(III) enthaltende Verbindung" bezeichnet eine Verbindung, die in der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe löslich ist und die das wohlbekannte Cyanoferrat(III)-Ion enthält. Beim Lösen in der Probe wird das Cyanoferrat(III)-Ion für die Reduktion durch ein freies Elektron verfügbar, unter Bildung von Cyanoferrat(II)- Ionen.
In ähnlicher Weise bedeutet "lösliche Eisen(III)-Verbindung" eine Verbindung, die sich in der Probe löst, unter Freisetzung von Eisen(III)-Ionen. Diese Ionen reagieren dann mit den vorstehend erwähnten Cyanoferrat(II)-Ionen unter Bildung eines Reaktionsprodukts.
Der Puffer "unterbindet nicht" die Reaktion zwischen Cyanoferrat(II)- und Eisen(III)-Ionen bedeutet, daß, obwohl dieser tatsächlich in Reaktionen mit diesen konkurrieren kann, diese Konkurrenz nicht ausreichend ist, um die Bildung des vorstehend bezeichneten Reaktionsprodukts zu unterbinden.
Wird ein quantitativer Test gewünscht, so sollte die Cyanoferrat(III) enthaltende Verbindung wenigstens in einer Menge vorhanden sein, die ausreicht, um alle Elektronen aufzunehmen, die von einem Substrat/Analyt-Molekül bei dessen Reaktion mit dem spezifischen Enzym abgegeben werden. Die meisten Analyten, z.B in biologischen Proben, sind in einem definierten Bereich vorhanden. Die Kenntnis dieses Bereichs läßt sich sicherstellen z.B. mit Hilfe des Merck Manual oder des Diagnostic Tests Handbook oder irgendeiner der dem Fachmann zur Verfügung stehenden Literaturstellen zur klinischen Chemie. Man verwendet eine Menge an Cyanoferrat(III), welche die Menge übersteigt, die notwendig ist, um mit dem gesamten speziellen Analyten an der Obergrenze des Maximalbereichs in einer gegebenen Probe zu reagieren. Auch läßt sich die Menge an Eisen(III)-Verbindung, die vorhanden sein soll, ziemlich einfach berechnen, da die Eisen(III) - und Cyanoferrat(II)-Ionen grundsätzlich 1: 1-molar reagieren. Genaue Mengen an Reagenzien sind jedoch nicht erforderlich, wenn ein Assay zur Bestimmung eines allgemeinen Analytenbereichs oder ein "Ja/Nein"-Test durchgeführt wird.
Die Auswahl der dem Fachmann zur Verfügung stehenden Cyanoferrat(III)- und Eisen(III) -Verbindungen ist umfangreich, wobei die einzige Einschränkung die ist, daß sie in der Testprobe löslich sind. Beispiele für Salze, die verwendet werden können, sind Kaliumcyanoferrat (III) und Eisen(III)chlorid, obwohl auch andere dem Fachmann bekannt sein werden, wobei die einzigen Einschränkungen für die Auswahl die vorstehend beschriebenen sind. Der oben angeführte pH-Bereich kann z.B. durch Verwendung eines geeigneten Puffers aufrechterhalten werden. Der bevorzugte Puffer ist 4-Aminobuttersäure, obwohl auch jeder Puffer geeignet ist, solange er im angegebenen Bereich arbeitet und das Eisen(III)-Ion nicht in einem Maße cheliert, daß die Reaktion mit Cyanoferrat(II) gehemmt wird.
Die Wahl des Enzyms richtet sich natürlich nach dem nachzuweisenden Analyten. Von besonderem Interesse sind Tests für die Glucose-Bestimmung, in denen das verwendete Enzym Glucoseoxidase ist. Andere Enzymsysteme können ebenfalls verwendet werden, und es liegt wohl im Bereich der Facherfahrung zu bestimmen, ob diese tatsächlich innerhalb des angegebenen pH-Bereichs funktionsfähig sind.
Die Reagenszusammensetzung kann z.B. in Form einer Lösung verwendet werden oder als Lyophilisat, als Tablette usw.. Des weiteren kann das Reagens in Form eines Kits verwendet werden, wobei die einzelnen Komponenten in getrennten Behältern bleiben, um kurz vor Gebrauch vereinigt zu werden.
Die Reagenszusammensetzung kann auch auf Produkte wie etwa Teststreifen angewandt werden. Dabei werden die Reagenzien in Trägermaterialien wie etwa Vliese, Folien etc. imprägniert oder eingearbeitet. Diese sollen hier nicht ausführlich aufgelistet werden, da der Fachwelt die Literatur zu Testträgern und die vielen verfügbaren Optionen recht gut bekannt sind.
Der Cyanoferrat(II)/Eisen(III)-Ion-Komplex, wie vorstehend beschrieben, ist eine schwere, intensiv gefärbte Substanz, die aus Lösungen ausfällt. In Anbetracht dessen ist es wünschenswert, wenn auch nicht notwendig, Komponenten wie etwa oberflächenaktive Substanzen in die Reagenzien und Testträger einzubringen, die den Niederschlag in Lösung halten, oder Additive, die die Farbe etwas abändern, um ihre Intensität abzuschwächen. Besonders bevorzugt dafür ist das inerte weiße Pigment TiO&sub2;.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist recht einfach. Die Testprobe Blut, Serum, Urin etc. wird mit dem Reagens gemischt, ungeachtet dessen Form, und man beobachtet die Bildung des Cyanoferrat(II)/Eisen(III) -Komplexes oder dessen Ausbleiben.
Die folgenden Beispiele demonstrieren die Funktionsfähigkeit der Erfindung und sind nicht in irgendeiner Weise beschränkend für die hierin enthaltene breitgefaßte Offenbarung aufzufassen.

Beispiel 1

Eine gepufferte Lösung wurde hergestellt durch Lösen von 60 mmol 4-Aminobuttersäure zusammen mit 1,8 mmol Eisen(III)-sulfat in 50 ml Wasser. Der pH wurde mit 1N H&sub2;SO&sub4; auf 4,0 eingestellt.
Es wurden 30 kE Glucoseoxidase zusammen mit 20 mmol K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] und Wasser zugesetzt, um ein Endvolumen von 100 ml zu ergeben. Diese Lösung wird im folgenden als Lösung A" bezeichnet.
Jeweils 1 ml Lösung A wurde dann mit je 50 ul (i) destilliertem Wasser, (ii) 6 mM Glucose-Lösung oder (iii) 600 mM Glucose-Lösung vereinigt. Die Farbbildung wurde dann wie folgt beobachtet: TABELLE 1 Testlösung Lösung A Wasser Glucose nichts leichte Blaufärbung intensive Blaufärbung

Beispiel 2

Es wurde die Auswirkung des pH auf die erfindungsgemäßen Testsysteme untersucht. Zu diesem Zweck wurden Lösungen hergestellt, die 200 mM 4-Aminobuttersäure, 20 mM Eisen(III)-sulfat, 80 mM K&sub3;[Fe(CN)&sub6;] und 450 E Glucoseoxidase/ml enthielten. Der pH der Lösungen wurde wie angegeben eingestellt, wobei entweder 4N H&sub2;SO&sub4; oder 4N KOH verwendet wurde.
Zur Prüfung der pH-Wirkung wurde jeder Lösung mit unterschiedlichem pH eine Glucose-Lösung zugesetzt um eine Endkonzentration von 7,1 mg/dl Glucose zu ergeben, und die Farbbildung wurde nach 1 Minute beobachtet. Dies wurde mit einer Kontrolle verglichen, die nach 15 Minuten abgelesen wurde. Der Grad der Farbbildung wird in der folgenden Tabelle 2 durch die Anzahl Pluszeichen angegeben. TABELLE 2 Kontrolle Probe
Dieses Experiment zeigt, daß die Erfindung über einen pH- Bereich von etwa 3,0 bis etwa 6,0 arbeitet. Der bevorzugte Bereich ist ein pH von etwa 3,3 bis etwa 4,5. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird ein pH von etwa 3,9 bis etwa 4,0 bevorzugt.
Die ausgezeichneten Ergebnisse, die bei den niedrigen pHs erhalten werden, sind recht überraschend in Anbetracht der fachlichen Lehre bezüglich der Funktionsfähigkeit von Enzymen bei verschiedenen pHs. Zum Beispiel lehrt Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, Vol. VI, S. 180, daß der optimale pH für Glucoseoxidase 5,6 ist.

Beispiel 3

Es wurden Teststreifen hergestellt und verwendet, um die Anwendung der Erfindung in Reflexionsassays zu zeigen.
Es wurde eine Beschichtungsmasse hergestellt, die 30 g 4-Aminobuttersäure, 3,9 g Eisen(III)-sulfat, 36 g Cyanoferrat(III)-Salz und 1000 kE Glucoseoxidase pro kg Beschichtungsmasse enthielt. Zu den nichtreaktiven Bestandteilen, die den Rest der Masse ausmachten, gehörten TiO&sub2; als weißes Pigment, TWEEN -20 (nichtionisches Tensid), PROPIOFAN-70D (Filmbildner) und NATROSOL (Quellmittel). Der pH dieser Masse betrug 4,1.
Die Masse wurde auf eine klare, 100 um dicke Polyester-Folie aufbeschichtet und wurde zur Bildung einer Beschichtung belassen. Die Dicke der Beschichtung betrug 150 um.
Es wurden Glucose-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen auf die Filme aufgebracht, die eine Minute danach in einem Reflexionsphotometer (Macbeth) bewertet wurden in Anlehnung an Standardvorschriften, die der Fachwelt wohl bekannt sind. Das prozentuale Reflexionsvermögen wurde für jede Lösung bei 660 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt: TABELLE 3 Glucose-Konzentration (mg/dl) % Reflexion
Die erhaltenen Werte zeigen, daß das prozentuale Reflexionsvermögen mit steigender Konzentration des gemessenen Analyten (Glucose) zunimmt. Das System ist als solches in Form von Teststreifen unter Anwendung der Reflexionsphotometrie funktionsfähig.

Beispiel 4

Es wurden Experimente durchgeführt, um die Erfindung in Verbindung mit dem Enzym Cholesterinoxidase zu testen.
Es wurde eine Testlösung hergestellt, die 50 mM K&sub3;[Fe(CN)&sub6;], 2,5 mM FeCl&sub3; und 50 mM 4-Aminobuttersäure pro Liter enthielt und einen pH von 4,0 aufwies.
Dann wurde Cholesterinoxidase einer Kontrollprobe und einer Probe der obigen Testlösung zugesetzt, die auch 100 mg/dl Cholesterin enthielt. Die Cholesterinoxidase war in einer Konzentration von 2 ug/ml je Probe vorhanden.
Die Proben wurden dann in einem Photometer ausgewertet, um festzustellen, ob eine Extinktionsänderung auftrat und wenn, um wieviel. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 4 dargestellt. TABELLE 4 Cholesterin-Konzentration (mg/dl) Extinktionsänderung nach 1 Minute
Wie der erfahrene Fachmann erkennt, wird der Kontrollwert zur Kalibrierung des Assays verwendet. Die Anderung der Extinktion mit der Cholesterin-Konzentration zeigt, daß die Erfindung mit Cholesterinoxidase angewandt werden kann.
Die vorhergehenden Beispiele zeigen die Funktion der Erfindung bei unterschiedlichen pHs und Reagenszubereitungen unter Verwendung diverser Enzyme. Es wurde gezeigt, daß zur Durchführung der Erfindung Zubereitungen verwendet werden können, zu denen Lösungen und Teststreifen zählen. Der erfahrene Fachmann wird die leichte Anpassungsfähigkeit des Systems erkennen, so daß dieses z.B. pulverförmige Zubereitungen oder Zubereitungen einschließen kann, bei denen z.B. das Enzym auf einem inerten Kügelchen oder einem andersartigen Träger immobilisiert ist und mit den übrigen Komponenten der Reagenszusammensetzung in Kontakt ist.
Ebenso wird der erfahrene Fachmann erkennen, daß sich auch Zubereitungen wie etwa Reagens-Kits herstellen lassen. Reagens-Kits enthalten die erfindungsgemäßen Komponenten, z.B. das Enzym, das Cyanoferrat(III)- und das Eisen(III)-Salz und den Puffer, in getrennten Behältern. Diese Behälter sind wiederum von einem Behältnis umschlossen, das all diese aufnimmt, etwa eine Box oder ein Gestell. Die getrennten Komponenten können als Lösungen, Pulver, Lyophilisate, imprägniert auf Trägern usw. angeboten werden oder als irgendeine der anderen, von der Fachwelt anerkannten Reagenszubereitungen.
In der Praxis wird die Erfindung natürlich durch Zusammenbringen einer Flüssigkeitsprobe wie etwa Blut, Serum, Urin etc. mit der Reagenszusammensetzung angewandt. Die Bildung des Preußisch-Blau-Komplexes wird gemessen als Angabe für den analysierten Analyten. Diese Methodik ändert sich nicht, ganz gleich welche Form die Zusammensetzung auch annehmen mag, einschließlich ihrer Zubereitung als analytisches Element oder Teststreifen, wie hierin beschrieben.

Claims

1. Zusammensetzung, anwendbar zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend:

a) ein Enzym, das spezifisch mit dem Analyten reagiert;

b) eine lösliche Cyanoferrat(III)-Verbindung, die in Gegenwart eines Elektrons reduzierbar ist unter Bildung einer Cyanoferrat(II)-Verbindung;

c) eine lösliche Eisen(III)-Verbindung, die mit einer Cyanoferrat(II)-Verbindung unter Bildung eines Reaktionsproduktes reagiert; und

d) einen Puffer, der die Bildung dieses Reaktionsprodukts nicht unterbindet, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 3,0 bis etwa 6,0 aufweist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Enzym Glucoseoxidase ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Enzym Cholesterinoxidase ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Puffer 4-Aminobuttersäure ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 3,9 bis etwa 4,6 aufweist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 3,9 bis etwa 4,2 aufweist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Form einer Lösung, die des weiteren destilliertes Wasser umfaßt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Form eines Pulvers.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die lösliche Cyanoferrat(III)-Verbindung Kaliumcyanoferrat(III) ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die lösliche Eisen(III)-Verbindung Eisen(III)-chlorid oder Eisen(III)-sulfat ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die auf einen Träger imprägniert ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 1 in lyophilisierter Form.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Form eines Kits, umfassend getrennte Behälter für jeweils das Enzym, die lösliche Cyanoferrat(III)-Verbindung, die lösliche Eisen(III)-Verbindung und den Puffer, sowie ein Aufnahmemittel zuin Festhalten der getrennten Behälter.

14. Analytisches Element, anwendbar zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend:

a) ein Trägermaterial;

b) eine Reagensschicht, die auf das Trägermaterial aufgebracht ist, wobei die Reagensschicht umfaßt:

(i) einen inerten Film, (ii) ein Enzym, das spezifisch mit dem Analyten reagiert, (iii) eine lösliche Cyanoferrat(III)-Verbindung, die in Gegenwart eines Elektrons zu einer Cyanoferrat(II)-Verbindung reduziert wird, (iv) eine lösliche Eisen(III)-Verbindung, die mit der Cyanoferrat(II)-Verbindung unter Bildung eines Reaktionsproduktes reagiert, und (v) einen Puffer, der die Bildung dieses Reaktionsprodukts nicht unterbindet, wobei die Reagensschicht einen pH von etwa 3,0 bis etwa 6,0 aufweist.

15. Analytisches Element nach Anspruch 14, des weiteren umfassend ein nichtionisches Detergens.

16. Analytisches Element nach Anspruch 14, des weiteren umfassend ein inertes Pigment.

17. Analytisches Element nach Anspruch 14 mit einem pH von etwa 3,9 bis etwa 4,6.

18. Analytisches Element nach Anspruch 14 mit einem pH von etwa 3,9 bis etwa 4,2.

19. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, umfassend das Zusammenbringen einer Flüssigkeitsprobe mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 und Bestimmen der Bildung des Reaktionsprodukts als ein Maß für den Analyten.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Probe eine Körperflüssigkeitsprobe ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Analyt Glucose ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Analyt Cholesterin ist.