DE3788239T2

DE3788239T2 - Kontrollierte Farbton-Vorrichtung.

Info

Publication number: DE3788239T2
Application number: DE87104428T
Authority: DE
Inventors: James P Albarella; Steven C Charlton; James W Reinsch; Mary Ellen Warchal
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1986-04-04
Filing date: 1987-03-25
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2007-03-26
Also published as: IE870865L; NO175217C; NO175217B; JPH0464593B2; US4898813A; AU7103487A; JPS62239055A; AU579277B2; NO871221L; EP0240849A3; ATE97740T1; FI871449L; EP0240849A2; FI871449A0; DK171687D0; FI871449A7; DE3788239D1; IE60896B1; ZA871362B; CA1296243C

Description

I. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Testzusammensetzungen und Testvorrichtungen, die befähigt sind, bei verschiedenen Analytkonzentrationen verschiedene Farbtöne zu erzeugen. Visuelle Tests für klinische Analyte sind der Mittelpunkt der Erfindung.

II. Nutzen

Kolorimetrische Tests werden in geeigneter Weise als visuelle Tests verwendet, mit denen verhältnismäßig ungeübtes Personal Ergebnisse durch einfachen Vergleich mit einer geeigneten Farbskala routinemäßig erhalten kann. Visuelle Tests sind preiswert und günstig, da sie keine Geräteausrüstung erfordern. Gegenwärtig werden visuelle Tests für die Routineüberprüfung von Urinproben für eine Anzahl diagnostisch wichtiger Analyte verwendet, die von Diabetikern als Heimtest für Urin- oder Blutglucose und auf anderen Gebieten, z. B. der Wasseruntersuchung auf Eisengehalt verwendet werden.
Jedoch bringen die gängigen, verfügbaren visuellen Tests die Intensität einer bestimmten Farbe mit der Konzentration des Analyten in Verbindung. Z.B. kann sich eine Testvorrichtung von farblos über hellblau zu dunkleren Blauschattierungen mit zunehmender Glucosekonzentration ändern. Größere, visuelle Unterscheidung und damit größere Genauigkeit ist möglich, wenn ein Bereich von Farben, anstelle unterschiedlicher Schattierungen einer einzigen Farbe bereitgestellt wird. Daher würde eine Testzusammensetzung, die verschiedene Farben (oder Farbtöne) zeigt, leichter zu verwenden sein und genauere, visuelle Ergebnisse bereitstellen.
Um eine visuelle Unterscheidung von höheren Glucosekonzentrationen zu erlauben, greifen viele gegenwärtig verfügbaren Produkte auf die Verwendung von zwei Reagentienauflagen zurück, von denen eine eine bessere Farbunterscheidung in dem höheren Konzentrationsbereich zur Verfügung stellt. Sonst zeigen solche Produkte nur sehr gering verschiedene Schattierungen von dunkelblau (oder dunkelgrün) oberhalb von 150 mg/dl Glucose. Im Gegensatz dazu kann eine Testvorrichtung dieser Erfindung gewaltige Farbänderungen, von blau nach seegrün, nach hellgelb, nach rot über einen Bereich von 0 bis 800 mg/dl Glucose produzieren.
Diese Erfindung stellt Zusammensetzungen zur Verfügung, die die Kontrolle der Erzeugung eines Bereichs von Farbtönen, besonders für klinisch bedeutend& Analyte erlauben.

III. Informationsoffenbarung

US-Patent Nr. 4 490 465 offenbart ein Testsystem für den Nachweis von Glucose mit einem ausgedehnten Meßbereich. Das System enthält wenigstens eine Pyridin-gebundene Dehydrogenase und eine nicht-Pyridin-gebundene Dehydrogenase. Jedoch scheinen sich die produzierten Indikatoren im Gleichgewicht zu befinden. Daher konnte ihre Reaktion und eine folgende Farbänderung nicht unabhängig voneinander kontrolliert werden.
DE 32 11 167 beansprucht wenigstens zwei Enzymsysteme, von denen jedes unabhängig voneinander befähigt ist, die direkte oder indirekte Umwandlung eines Substrats zu katalysieren. Die Beschreibung definiert "unabhängig voneinander" in der Bedeutung, daß in dem gleichzeitigen Vorhandensein der Systeme, die mit dem Substrat reagieren, die Reaktion durch das zweite System erst stattfindet, nachdem das Coenzym des ersten Systems weitgehend verbraucht ist.
DE 32 47 894 offenbart ein Testsystem für den Nachweis von NAD(P)H oder Substraten oder Enzymen, die unter der Bildung oder dem Verbrauch von NAD(P)H reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß es ein einziges Enzymsystem enthält, das mit mehreren Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen in Gegenwart von NAD(P)H reagieren kann. Die Farbbildung wird durch die elektrochemischen Potentiale der verwendeten Substanzen kontrolliert, und das System kann nicht geändert werden, um verschiedene Farben bei verschiedenen Analytkonzentrationen zu produzieren, außer durch Auffinden von Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen. Besondere Beispiele von Elektronenacceptoren umfassen Dichlorphenolindophenol und INT, (2-(4-Iodphenyl)- 3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid). Die Beschreibung stellt fest, daß absorbierende Stoffe mit dem Testsystem getränkt werden-können. Ein gelber Bestandteil wird zu der durch die Aufnahme eines Hintergrundfarbstoffs, Titangelb, zu sehenden Farbe hinzugefügt.
Die japanische Patentanmeldung 59-106299 wurde am 19. Juni 1984 veröffentlicht. Die Anmeldung offenbart ein Verfahren zur Schätzung von NAD(P)H mit oxidiertem Glutathion in Gegenwart von Glutathion-Reductase und einem Farbbildner. Beispiele für Farbbildner sind 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure); N-(1-Anilinonaphthyl-4)maleinimid; β-Hydroxyethyl-2,4-dinitrophenyldisulfid; 2,2-Dithiopyridin; und Benzimidazolylmaleinimid.
Die europäische Patentanmeldung 0 153 872 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der reduzierten Form von Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat, das die Reaktion von NAD(P)H mit (1) Peroxidase oder Thioloxid-Reductase und (2) Diaphorase oder einem Elektronenträger in Gegenwart eines Chromogens und den Nachweis des so gebildeten Pigments einschließt. Diese beiden Reaktionen wirken nicht auf ein gemeinsames Substrat.
Keine dieser Offenbarungen stellt aus zwei unabhängigen, katalytischen Systemen zusammengesetzte Testzusammensetzungen zur Verfügung, die befähigt sind, unabhängig voneinander Änderungen im Farbton zu erzeugen.

IV. Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt eine Testzusammensetzung für den visuellen Nachweis der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe bereit, umfassend
(a) ein gemeinsames Substrat erzeugendes System, das in Gegenwart eines in einer flüssigen Probe befindlichen Analyten ein gemeinsames Substrat erzeugt, das aus einer Gruppe-, die aus-Adenosintriphosphat, reduziertem Flavinadenindinucleotid, Wasserstoffperoxid, Glycerin und Glucose besteht, ausgewählt ist;
(b) ein erstes, unabhängiges katalytisches System, das befähigt ist, eine Veränderung im Farbton eines ersten Indikatorbestandteils durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen; und
(c) ein zweites, unabhängiges katalytisches System, das befähigt ist, eine Veränderung im Farbton eines zweiten Indikatorbestandteils durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen;
wobei das Erzeugen der Veränderung in den Farbtönen der ersten und zweiten Indikatorbestandteile kontrolliert werden kann, um verschiedene Farbtöne bei verschiedenen Analytkonzentrationen bereitzustellen, insbesondere Endfarbtöne, die von der Testzusammensetzung in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten gebildet werden.
Die Zusammensetzung kann gelöst werden, um eine Testlösung bereitzustellen oder in eine Trägermatrix aufgenommen werden, um eine Testvorrichtungsausführung bereitzustellen. Die Verwendung einer Unterteilung in Teilräume, um eine Testvorrichtung herzustellen, ist bevorzugt.

V. Beschreibung der Erfindung

Visuelles Farbvergleichen ist geeignet und kann einen annehmbar genauen Nachweis einer Analytkonzentration ohne die Notwendigkeit einer kostspieligen Geräteausrüstung bereitstellen. Farbe kann unterteilt werden, wie z. B. in Sättigung, Helligkeit und Farbton. Farbton betrifft im allgemeinen die "Farbe" z. B. ob etwas blau, rot oder gelb "aussieht". In der Beschreibung wird die Bezeichnung "Farbton" verwendet.
Im allgemeinen ist ein Farbton mit einer Form eines einzigen Indikators verbunden. Daher ist, um einen Bereich an Farbtönen zu erzeugen, eine Anzahl verschiedener Indikatormoleküle erforderlich. Die möglichen Änderungen eines Farbtons sind zahlreich. Ein Indikator kann von einem Farbton zum anderen wechseln, ein Farbton zu farblos oder von farblos zu einem Farbton. Es ist sogar möglich, daß sich der Indikator selbst nicht ändert, aber daß die Ausführung einer die Testzusammensetzung enthaltenden Vorrichtung so ist, daß eine sichtbare Farbtonänderung der Vorrichtung vorhanden ist, wenn sie mit einer den Analyten enthaltenden Testprobe in Berührung gebracht wird. Z.B. konnte der Farbton des Indikators vor der Reaktion der Testzusammensetzung mit dem Analyten nicht gesehen werden, aber sichtbar werden, nachdem die Reaktion stattgefunden hat. Da es wünschenswert ist, daß die Änderung des Endfarbtons, die durch die Testvorrichtung gezeigt wird, von einer Analytkonzentration zu einer andern für den Anwender so deutlich wie möglich sein soll, wurden Änderungen von farblos zu einem Farbton und einem Farbton zu farblos, bevorzugt. Werden zwei oder mehrere Indikatoren verwendet, ändert sich wenigstens ein Indikatorbestandteil vorzugsweise von einem Farbton zu farblos. Anderenfalls würde der Endfarbton der Testzusammensetzung oder Vorrichtung sich auf schwarz zubewegen, da mehr Farbtöne produziert werden. Obwohl eine Zusammensetzung mit zwei Indikatorbestandteilen verwendet werden kann, hat sich die Verwendung von drei Indikatorbestandteilen als vorteilhaft erwiesen.
Es ist besonders wünscheswert, die Produktion und/oder das Verschwinden von Indikatoren zu kontrollieren, die in einer Form einen der Hauptfarbtöne zeigen: rot, gelb, blau.
Z.B. betrachte man eine Testzusammensetzung, die Indikatoren enthält, die die folgenden Farbtonänderungen in der gezeigten Reihenfolge enthalten.
Indikator 1) blau nach farblos
Indikator 2) farblos nach gelb
Indikator 3) farblos nach rot
Wenn die Indikatoren der Reihe nach reagieren, wäre der sichtbare Endfarbton der Testzusammensetzung von blau nach farblos, nach orange (gelb + rot).
Wenn jedoch Indikator 2 den Farbton gleichzeitig mit Indikator 1 änderte, mit einer später auftretenden Änderung des Indikators 3, wäre der sichtbare Endfarbton der Testzusammensetzung von blau nach grün (blau + gelb), nach gelb, nach orange (gelb + rot), nach rot.
Ein ähnliches Beispiel ist:
Indikator 1) rot nach farblos
Indikator 2) farblos nach gelb
Indikator 3) farblos nach blau
Wenn die Indikatoren der Reihe nach reagieren würden, wäre der sichtbare Endfarbton der Testzusammensetzung von rot nach farblos, nach gelb, nach grün (blau + gelb). Wenn die Indikatoren wie oben beschrieben ist, reagieren würden, wobei zwei Indikatoränderungen gleichzeitig produziert werden und die dritte Änderung verzögert ist, wäre der sichtbare Farbton der Testzusammensetzung von rot nach orange (rot + gelb), nach gelb, nach grün (gelb + blau), nach blau.
Beide dieser Schemata, die gleichzeitige Farbtonänderungen enthalten, könnten ein volles Regenbogenspektrum produzieren. Solch ein Regenbogen wäre wünschenswert, da er den breitesten für das Auge sichtbaren Farbtonbereich zur Verfügung stellen würde.
Das Problem ist zweifach: 1) Indikatoren auszuwählen, mit unabhängig voneinander induzierten Farbtonänderungen, um die maximale Farbtonänderung zu geben; und 2) zu gewährleisten, daß diese Indikatoren der Reihe nach reagieren, nur in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten.
Es ist gefunden worden, daß ein kontrollierter Bereich von Farbtönen durch Verwenden von zwei unabhängigen Katalysatorsystemen produziert werden kann, von denen jedes mit einem gemeinsamen Substrat reagieren kann, um Farbtonänderungen von einem oder mehreren Indikatorbestandteilen zu produzieren. Die Systeme sind so ausgewählt, daß der (die) Indikator(en) in dem einen System mit dem (den) Indikator(en) des anderen Systems während der Zeit des Assays nicht im Gleichgewicht steht (stehen). Daher kann der Endfarbton, der durch die Testzusammensetzung durch das In-Berührung-bringen mit einer besonderen Analytkonzentration produziert wird, durch die Aktivitäten der unabhängigen katalytischen Systeme kontrolliert werden. Der produzierte Endfarbton kann durch die relative Zu- oder Abnahme der Konzentrationen der Bestandteile und Katalysatoren in der Testzusammensetzung kontrolliert werden.
Jedes unabhängige, katalytische System ist ein System, das befähigt ist, eine oder mehrere Farbtonänderungen oder Änderungen zu einem sichtbaren Farbton zu erzeugen. Jedes System reagiert mit einem gemeinsamen Substrat. Das gemeinsame Substrat ist im allgemeinen irgendein Schlüsselsubstrat, das an vielen katalytischen Reaktionen teilnimmt. Z.B. kann das gemeinsame Substrat reduziertes Nicotinamidadenin-dinucleotid, NADH; Adenosintriphosphat, ATP; Wasserstoffperoxid, H&sub2;O&sub2;; Glycerin; oder irgendeine andere Einheit sein, die von dem interessierenden Analyten produziert werden kann und an zwei unabhängigen Reaktionen teilnehmen kann, um Änderungen im Farbton zu produzieren.
Die Bezeichnungen Katalysator und katalytisch werden hier in ihrem herkömmlichen Sinn verwendet. Eine "katalytische" Reaktion ist eine Reaktion, bei der die Geschwindigkeit durch das Hinzufügen eines "Katalysators" geändert wird, aber der Katalysator selbst unverändert bleibt. Die katalytischen Reaktionen, auf die hier Bezug genommen wird, sind im allgemeinen enzymatisch, können jedoch auch nicht enzymatische Reaktionen, wie z. B. solche, die von Phenazinmethosulfat katalysiert werden, einschließen. Die Bezeichnung "unabhängig" bedeutet, daß die Indikatorbestandteile, die eine Farbtonänderung in einem katalytischen System durchlaufen, nicht mit dem (den) Indikatorbestandteil(en) im Gleichgewicht stehen, der (die) eine Änderung in dem anderen katalytischen System während der Zeit der Assaydurchführung durchläuft (durchlaufen).
Das gemeinsame Substrat wird von dem interessierenden Analyten durch ein das gemeinsame Substrat erzeugendes System, das im allgemeinen enzymatisch ist, erzeugt. Tabelle 1 zeigt Analyten von klinischem Interesse und nützliche enzymatische Systeme, die ein gemeinsames Substrat für diesen Test zur Verfügung stellen können. Diese Reaktionen und die erforderlichen Reaktionsbestandteile sind wohlbekannt und sind zur Zeit die Grundlage für viele diagnostische Reaktionen, die Änderungen in der Intensität eines einzigen Farbtons als Antwort auf eine Analytkonzentration erzeugen. Tabelle 1 Analyt gemeinsame Substrat Glucose Glucoseoxidase Glucosedehydrogenase Hexokinase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase Cholesterin Cholesterinoxidase Cholesterindehydrogenase Alkohol Alkoholoxidase Alkoholdehydrogenase Triglyceride Lipoproteinlipase Glycerin α-Amylase α-Amylase Glucose
Jedes unabhängige katalytische System ist befähigt, eine oder mehrere Änderungen im Farbton durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen. Nützliche Katalysatorpaare für die Reaktion mit einem gemeinsamen Substrat sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

gemeinsames Substrat gepaarte Katalysatoren
NADH Diaphorase/Disulfidreduktase
Glycerin Glycerinkinase/Glycerindehydrogenase
Glucose Hexokinase/Glucosedehydrogenase
Diese Systeme sind nur als Beispiele vorgesehen und sollen nicht als Beschränkung in der Erfindung gedeutet werden. Die Bestandteile dieser Systeme können verwendet werden, um Testzusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung arbeiten, bereitzustellen. Zusätzlich kann ein Farbverzögerer zu der Testzusammensetzung hinzugefügt werden, um die Reaktion des gemeinsamen Substrats mit den unabhängigen katalytischen Systemen zu verzögern. - Verbindungen wie Kaliumeisen(III)cyanid, 1-N-Ethyl-4-methylchinoliniodid und analoge Verbindungen davon können als Farbverzögerer in einem für die Reaktion mit NADH bestimmten System wirken.
Die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid, NADH, hat sich als besonders nützliches gemeinsames Substrat erwiesen. Dieses System ist im EP 239 926 im Detail beschrieben.
Andere Bestandteile, wie z. B. Puffer, Tenside und Polymere können zu der Zusammensetzung hinzugefügt werden. Der pH ist im allgemeinen ausgewählt, um den Reagentien gute Leistung und Stabilität zu verleihen und wird durch die Verwendung von Puffern kontrolliert. Die Verwendung von Puffern ist bevorzugt, da die Enzyme besser innerhalb des pH-Bereichs von etwa 6,0 bis 8 arbeiten. Die Auswahl eines Puffers liegt im Können des Fachmanns. Nützliche Puffer umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure (HEPES), 2-[Tris(hydroxymethyl)methyl]aminoethansulfonsäure (TES), 2-[N-Morpholin]-ethansulfonsäure (MES) und [3-(N-Morpholin)propansulfonsäure] (MOPS). Tenside und Polymere können besonders nützlich in Formulierungen sein, die ein kationisches Tetrazoliumsalz, wie z. B. einen oxidierten Indikator, enthalten, da Tenside, wie z. B. Polyoxyethylenether, erhältlich unter der Handelsmarke TRITON® X-100 von Sigma Chemical Co., und Polymere, wie z. B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, erhältlich als PVP K30 von Aldrich Chemical Co., zu helfen scheinen, den kationischen Indikator in Lösung zu bringen und eine Wechselwirkung mit den anderen Indikatoren in der Testzusammensetzung verhindern. Tenside verbessern auch die Benetzbarkeit der Vorrichtung in einer Trockenphasenformulierung. Enzymstabilisatoren, wie z. B. bovines Serumalbumin, können auch hinzugegeben werden.
Testzusammensetzungen dieser Erfindung können durch Lösen der Zusammensetzung in einer Lösung verwendet werden oder sie können in eine Trägermatrix aufgenommen werden und an einem Stützglied, wie z. B. ein Polyesterstreifen, befestigt werden, um Trockenreagensstreifen, die in der Diagnostik wohlbekannt sind, zur Verfügung zu stellen. Diese Streifen stellen eine Ausführung bereit, die zum Tragen und Aufbewahren geeignet ist und die für Heimanwender, wie z. B. Diabetiker, besonders nützlich ist. Bevorzugte Zusammensetzungen dieser Erfindung erzeugen in weniger als etwa zehn Minuten einen Endfarbton, der mit einer speziellen Analytkonzentration verbunden ist.
Die verwendete Trägermatrix kann irgendeine von mehreren in der Industrie bekannten Trägermatrizen sein, solange die Matrix die Zusammensetzung in sich aufnehmen kann und nicht die für die Produktion der Farbe erforderlichen Reaktionen stört. Diese umfassen Papier und Folien, wie z. B. solche, die aus natürlichen Polymeren, Latices, Polyurethanen, Siliconen oder Kombinationen daraus, hergestellt sind.
Um die klarsten Farben, die möglich sind, zu erhalten, ist eine klare Trägermatrix bevorzugt. Da die für die Erfindung üblichen Analyte wasserlösliche Substanzen sind, wie z. B. diejenigen, die in Körperflüssigkeiten gefunden werden, sind Trägermatrizen, die Wasser enthalten können, wie z. B. hydrophile Träger, bevorzugt. Geeignete hydrophile Träger umfassen Agarose, Gelatine, Poly(vinyl)alkohol, Poly(propylimin), Carrageen und Alginsäure. Andere Träger können verwendet werden. Gemischte Mehrschichtenträger, die aus einer absorbierenden undurchsichtigen Matrix, wie z. B. Papier und einer hydrophilen Trägerschicht (z. B. Gelatine) zusammengesetzt sind, können vorteilhaft verwendet werden, wenn die Testbestandteile in Teilräume unterteilt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde eine Lösung von 1,25% Carbodiimid verwendet, um eine Matrix aus einem Mehrschichten-Gelatine-Träger zu vernetzen. Dieses stellt eine Ausführung für einen Vollblut-Glucosetest bereit, die es erlaubt, die Blutprobe von der Testvorrichtung durch Abwischen der Oberfläche zu entfernen. Andere, der Fachwelt wohlbekannte Beschichtungsmaterialien, können verwendet werden, um ein Waschen oder Abwischen der Vorrichtung zur Entfernung einer gefärbten Probe, wenn erforderlich, zu gestatten.
Die hydrophile Trägerschicht oder Schichten werden auf eine starre Unterlage oder ein Stützglied, wie z. B. Polystyrol, Polyester und dergleichen geschichtet. Die Unterlage kann undurchsichtig oder durchsichtig sein, obwohl eine undurchsichtige, weiße Unterlage allgemein bei visuell abzulesenden Tests bevorzugt ist.
Die Anzahl und Typen der Bestandteile, die in den unabhängigen katalytischen Systemen, die vorher beschrieben wurden, verwendet werden können, werden durch die Verwendung der Unterteilung in Teilräume von möglicherweise unverträglichen Bestandteilen in einer Testvorrichtungsausführung vergrößert. Die Unterteilung in Teilräume kann viele Formen annehmen. Die Bestandteile können durch das Plazieren von einem Teil von ihnen in einer getrennten Schicht, durch das Lösen innerhalb einer Phase einer Emulsion, durch Fällung, durch Verkapselung, usw. getrennt werden. Einige der verfügbaren Verfahren sind in den Beispielen ausführlich beschrieben.
Im EP 239 926 ist eine Vorrichtung für den Nachweis von Glucose beschrieben, die die verschiedenen Möglichkeiten der Unterteilung in Teilräume zeigt.
Das letzte Ziel der Erfindung bestand darin, deutlich unterschiedliche Farbtöne bei verschiedenen Analytkonzentrationen zu erzeugen. Es wurde gezeigt, daß dieses Ziel mit Testzusammensetzungen dieser Erfindung mit einer Vielfalt von Verfahren, wie im folgenden zusammengefaßt ist, erreicht werden kann.
1) Auswählen oxidierter Indikatoren, die den gewünschten Farbton erzeugen oder nach Reduktion farblos werden.
2) Auswählen von Indikatoren für die Reaktion in einem speziellen katalytischen System, die verschiedene Reduktionspotentiale haben, die die Reihenfolge der Reaktionen in dem System kontrollieren.
3) Kontrollieren der Mengen der Bestandteile in den unabhängigen katalytischen Systemen, so daß die an einer Reaktionsreihenfolge beteiligten Bestandteile bei den gewählten Analytkonzentrationen im wesentlichen erschöpft sind.
4) Steigern (oder vermindern) der Menge des Katalysators in einem System. Dieses steigert (oder vermindert) die Geschwindigkeit der Wechselwirkung oder Reduktion der Indikatorbestandteile durch das System und ändert daher den sichtbaren Farbton bei einer speziellen Analytkonzentration.
5) Unterteilen der Bestandteile des Reaktionssystems in einer Testvorrichtung in Teilräume. Die Vorteile der Unterteilung können die Fähigkeit umfassen des: Änderns des sichtbaren Endfarbtons der Vorrichtung, selbst wenn die Konzentrationen des Bestandteils die gleichen sind; Verwerten von unverträglichen Indikatoren oder wasserunlöslichen Indikatoren; und Verwerten von Enzymsystemen, die normalerweise durch Thiolindikatoren gehemmt werden.
6) Zufügen eines Farbverzögerers, der die Reaktionen der unabhängigen katalytischen Systeme verzögert.
Die oben vorgeschlagenen Verfahren können kombiniert werden.
Die Erfindung wird anschließend durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, jedoch ist eine Beschränkung nicht beabsichtigt.

VI. Beispiele

Abkürzungen
MPMS 1-Methoxyphenazinmethosulfat
DCIP 2,6-Dichlorindophenol
ATP Adenosintriphosphat
NAD&spplus; Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Lithiumsalz
NADH reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid
HEPES Puffer, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
BES Puffer, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure
TRIS Puffer, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Triton®X-100 Tensid, Polyoxyethylenether, erhältlich bei Sigma Chemical Co.
GDH Glucosedehydrogenase (EC 1.1.147) zur NADH-Produktion befähigt
U Internationale Einheiten, ein Maß für die Enzymaktivität (ein U ist diejenige Aktivität, die erforderlich ist, um die Umwandlung von einem Mikromol eines Substrats pro Minute unter festgelegten Temperatur- und pH-Bedingungen zu katalysieren)
dl Deziliter
ml Milliliter
ul Mikroliter
g Gramm
u Mikron

Beispiel 1:

Nachweis von Stärke: Glucose als gemeinsames Substrat

Ein Stärkenachweis kann unter Verwendung der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, um einen visuellen Endpunkt eines bei verschiedenen Konzentrationen verschiedenen Farbtons bereitzustellen. Stärke kann mit Amylase behandelt werden, um Glucose zu bilden, die als gemeinsames Substrat für zwei unabhängige katalytische Reaktionen verwendet wird, die Hexokinase und Glucosedehydrogenase (GDH) als Enzymkatalysatoren verwenden. Die Gesamtreaktion kann wie folgt schematisch dargestellt werden:
Die spezifisch unabhängigen Reaktionen sind:
Ein Reaktionsgemisch wurde durch Kombinieren von 0,1 mM NAD, 0,0025 mM MPMS, 0,5 mM p-Nitroblau-Tetrazol, 0,2% Triton®X-100, 10 mM ATP, 1 mM Magnesiumnitrat und 0,15 Phenolrot und 10,1 mM Trispuffer hergestellt. Der pH der Reagensmischung wurde mit Ammoniumhydroxid auf etwa 8,5 eingestellt. Die Enzyme Hexokinase (2,9 U/ml) und Glucosedehydrogenase (9,9 U/ml) wurden hinzugefügt.
Der pH-Indikator ändert sich mit abnehmendem pH von rot nach schwach gelb; p-Nitroblau-Tetrazol ändert sich bei Reduktion mit NADH von farblos nach blau.
Aliquots der Lösung wurden mit Glucose behandelt, 5 Minuten reagierengelassen und der Farbton beobachtet. Die durch verschiedene Glucosespiegel erhaltenen Farbtöne (die auf die Stärkekonzentration bezogen werden können) waren wie folgt:
Glucose mg/dl Farbton
0 malvenfarbig/ rot
72 rosa
144 gelb
288 braun
432 dunkler braun
576 malvenfarbig
Die roten bis gelben Farbtöne entsprachen der Phenolrot- Umwandlung, die von der Hexokinasereaktion erwartet wird und die Bildung von blau (in braun bis malvenfarbig resultierend), entsprach der Reduktion von p-Nitroblau-Tetrazol durch den Glucosedehydrogenase-Stoffwechselweg. Die Ergebnisse zeigen deutliche Farbtöne, die mit der Glucosekonzentration in Verbindung stehen, die auf die Konzentration von Stärke in einer Probe bezogen werden kann.

Beispiel 2:

Glycerin als gemeinsames Substrat

Ein weiteres gemeinsames Substrat, Glycerin, kann in dem Assay für Triglyceride produziert werden.
Triglyceride Lipoproteinlipase Glycerin + freie Fettsäuren
Dieses Verfahren ist zu dem in Beispiel 1 analog, worin eine Kinase und eine Dehydrogenase verwendet wurden. Glycerinkinase und Glycerindehydrogenase arbeiten bei höherem pH, daher wurden die verwendeten Puffer zu BES gewechselt. Der verwendete Redoxindikator war DCIP (blau nach farblos) und der pH-Indikator war Phenolrot (rot nach gelb).
Es wurde eine Lösung mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt. Reagens NAD Mg(NO&sub3;)&sub2; ATP Puffer Triton Phenolrot DCIP Endkonz.
Die Enzyme Glycerinkinase (60 U/ml von E. coli, Sigma G 4509) und Glycerindehydrogenase (5,3 U/ml Cellulomonas, Sigma G 3512) wurden hinzugefügt.
Die Antwort dieser Lösungen auf Glycerin zu verschiedenen Zeiten ist unten dargestellt: Farbton Glycerinkonz. (mM) Zeit (min.) malve blau grün dunkelgrünblau/grün hellgrün malve/blau gelb/grün limonen-grün

Claims

1. Testzusammensetzung für die visuelle Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend:

(a) ein gemeinsames Substrat erzeugendes System, das in Gegenwart eines in einer flüssigen Probe befindlichen Analyten ein gemeinsames Substrat erzeugt, das aus einer Gruppe, die aus Adenosintriphosphat, reduziertem Flavinadenindinucleotid, Wasserstoffperoxid, Glycerin und Glucose besteht, ausgewählt ist;

(b) ein erstes, unabhängiges katalytisches System, das befähigt ist, eine Veränderung im Farbton eines ersten Indikatorbestandteils durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen; und

(c) ein zweites, unabhängiges katalytisches System, das befähigt ist, eine Veränderung im Farbton eines zweiten Indikatorbestandteils durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen;

wobei das Erzeugen der Veränderung in den Farbtönen der ersten und zweiten Indikatorbestandteile kontrolliert werden kann, um verschiedene Farbtöne bei verschiedenen Analytkonzentrationen bereitzustellen, insbesondere Endfarbtöne, die von der Testzusammensetzung in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten gebildet werden.

2. Testzusammensetzung nach Anspruch 1, in der ein dritter Indikatorbestandteil auch vorhanden ist und das erste oder zweite katalytische System befähigt ist, eine Änderung des Farbtons in dem dritten Indikator durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen.

3. Testzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, bei der die Farbtonveränderung eines der ersten, zweiten oder dritten Indikatoren von einem Farbton zu farblos besteht.

4. Testzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei der eines der ersten oder zweiten katalytischen Systeme befähigt ist, einen gelben Farbton zu erzeugen.

5. Testvorrichtung, zur visuellen Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend die Testzusammensetzung nach Anspruch 1.

6. Testvorrichtung nach Anspruch 5, in der ein dritter Indikatorbestandteil auch vorhanden ist und das erste oder zweite katalytische System befähigt ist, eine Farbtonveränderung des dritten Indikatorbestandteils durch Reaktion mit dem gemeinsamen Substrat zu erzeugen.

7. Testvorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 5 und 6, in dem die Farbtonveränderung eines der ersten, zweiten oder dritten Indikatoren von einem Farbton zu farblos besteht.

8. Testvorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, in dem eines der ersten oder zweiten katalytischen Systeme befähigt ist, einen gelben Farbton zu erzeugen.