DE69228554T2

DE69228554T2 - Reagenzien und untersuchungsverfahren einschliesslich eines phenazin enthaltenden indikators

Info

Publication number: DE69228554T2
Application number: DE69228554T
Authority: DE
Inventors: Helmut Freitag; Christopher Wilsey
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-18
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2012-09-19
Also published as: EP0606296A1; ES2130179T3; DE69228554D1; EP0606296A4; JP3468517B2; JPH06510905A; WO1993006487A1; EP0606296B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die kolorimetrische Messung der Menge eines Analyten in einer Probe.

Hintergrund der Erfindung

Bei kolorimetrischen Bestimmung zur Messung der Menge eines Analyten in einer Probe werden Phenazin enthaltende Verbindungen als Vermittler (Redoxvermittler) in Oxidations-/Reduktionsreaktionen eingesetzt, um die Reduktion eines Indikators zu erleichtern. Bei derartigen Bestimmungen wird die Farbintensität der reduzierten Form des Indikators mit der Menge des Analyten in der Probe korreliert. Beispielhaft für diese Tests sind die folgenden Reaktionssequenzen:
Phenazin enthaltende Verbindung (oxidierte Form) = z. B. PMS (Phenazinmethosulfat)
Indikator (oxidierte Form) = z. B. Tetrazolium-Salz, NAD (oxidierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid)
Indikator (reduzierte Form) = z. B. Formazan, NADH (reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid) Bei Verwendung als Redoxvermittler fungieren Phenazin enthaltende Verbindungen als nichtenzymatische Katalysatoren, und ihre Konzentration bei einem Test ist sehr niedrig (erheblich weniger als einmillimolar).

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein neues Reagens sowie Verfahren zur Messung der Konzentration (oder zum Nachweisen der Gegenwart) eines Analyten in einer Probe. Das Reagens enthält eine Phenazin enthaltende Verbindung und ein Enzym. Die Phenazin enthaltende Verbindung muß von hinlänglicher Art sein, um ein Semichinoid (der Farbindikator) durch eine Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu bilden. Wichtig ist, daß die Phenazin enthaltende Verbindung in ausreichender Menge vorliegen muß, um die Konzentration des Semichinoids mit der Konzentration des Analyten in der Probe zu korrelieren (oder das Vorhandensein des Analyten in der Probe nachzuweisen).
Das Reagens kann auch die folgenden Komponenten enthalten: einen Puffer, um für die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung den richtigen pH bereitzustellen und aufrechtzuerhalten und den gewünschten pH für spektrophotometrische Messungen des Semichinoids bereitzustellen, sowie ein Tensid in ausreichender Menge, um eine Ausfällung des Semichinoids zu verhindern.
Bereitgestellt werden kann auch ein Reagenzienset zur Messung der Menge eines Analyten in einer Probe. Bei diesem Reagenzienset enthält ein erstes Reagens die Phenazin enthaltende Verbindung und ein zweites Reagens enthält das Enzym und den Puffer.
Das erfinderische Reagens kann in einen Film eingearbeitet sein, der zumindest die Phenazin enthaltende Verbindung, das Enzym und ein filmbildendes Mittel wie etwa NATROSOL-250M enthält, bei dem es sich um eine mikrokristalline Hydroxyethylcellulose handelt, die von Aqualon Company (Little Falls Centre One, 2711 Centerville Road, P. O. Box 15417, Wilmington, Delaware 19850-5417) zu beziehen ist. Weiterhin kann der Film einen Puffer, ein Reagens- Stabilisierungsmittel und ein Tensid enthalten.
Alternativ kann mit dem erfinderischen Reagens ein Gewebenetz (etwa ein Nylon-Netz) oder Papier imprägniert werden. Das Reagens kann auch auf Glasfaser aufbeschichtet werden.
Zu den Verfahren zur Messung der Menge (oder zum Nachweis der Gegenwart) eines Analyten in einer Probe gehört bedeutenderweise die spektrophotometrische Messung (oder der Nachweis) des semichinoiden Indikators bei Wellenlängen von über etwa 580 nm, wodurch Störungen aufgrund des Vorhandenseins von Hämoglobin, Bilirubin und Trübungen verringert werden. Von Bedeutung ist auch, daß diese Bestimmungsverfahren mit kurzen Inkubierzeiten von weniger als etwa 30 Sekunden für Testproben zur Messung der spektrophotometrischen Extinktion (Bestimmungen werden mit Lösungen durchgeführt) und weniger als etwa 1,5 Minuten für Testproben zur Messung des spektrophotometrischen Reflexionsvermögens oder Durchlässigkeitsgrads (Bestimmungen werden mit Filmen durchgeführt) verbunden sind.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Üblicherweise werden Phenazin enthaltende Verbindungen in geringer Konzentration als Redoxvermittler (Elektronenträger) bei der Bestimmung von Analyten verwendet. Bei einer Reaktion unter Beteiligung eines Enzyms, eines Analyten und eines Farbstoffs wie z. B. eines Tetrazolium-Salzes fungiert beispielsweise eine Phenazin enthaltende Verbindung typischerweise als Redoxvermittler. Bei einer solchen Reaktion fungiert die Phenazin enthaltende Verbindung als Redoxvermittler bei der Reduktion des Farbstoffs. Der reduzierte Farbstoff ist ein Farbindikator wie z. B. ein Formazan, das zur Messung der Analytmenge in einer Probe verwendet wird.
In US-A-4 853 186 sind Phenazin enthaltende Verbindungen offenbart, die als Elektronenübertragungsreagenzien (electron transfer agents: ETA) fungieren. Diese ETA übertragen Elektronen auf reduzierbare Verbindungen, die bei Prüfungen z. B. auf Mikroorganismen wiederum eine nachweisbare Spezies, z. B. einen Farbstoff freisetzen.
Die US-A-4 472 498 offenbart die Verwendung Phenazin enthaltender Verbindungen in Analysenfilmen. Wie in der US-A- 4 853 186 werden die Phenazin enthaltenden Verbindungen der US-A-4 472 498 zur reversiblen Bildung eines Semichinoids verwendet, wobei die eigentliche Nachweisreaktion durch weitere Hilfsmittel, z. B. ein weiteres Enzym/Substrat-Paar erzielt wird.
Wird jedoch eine Phenazin enthaltende Verbindung relativ zur Menge des gemessenen Analyten in ausreichend hoher Konzentration zugeführt, so verhält sie sich bei der Bestimmung eines Analyten als Indikator und nicht nur als Elektronenträger.
Werden spektrophotometrische Messungen an einer Lösung durchgeführt, so enthält das vorliegende erfinderische Reagens ein Minimum einer Phenazin enthaltenden Verbindung und eines Enzyms.
N-Ethylmethoxyphenazinethosulfat und 1-Methoxyphenazinmetho sulfat, wie auch viele andere Phenazin enthaltende Verbindungen, sind jedoch rot gefärbt, wodurch es zu einer starken Blindreaktion bei der Bestimmung eines Analyten kommt. Daher sind Phenazinethosulfat und Phenazinmethosulfat bevorzugte Phenazin enthaltende Verbindungen, weil sie gelb gefärbt sind und nicht zu einer starken Blindreaktion bei der Bestimmung eines Analyten führen.
Zur Korrelation der Konzentration des Semichinoids mit der Glucose-Konzentration in einer Blutprobe sollte die Konzentration der Phenazin enthaltenden Verbindung in einem Reagenz mindestens etwa vier (4) millimolar sein. Anders als für die Konzentrationsbestimmung reicht für den Nachweis von Glucose in einer Blutprobe eine Konzentration der Phenazin enthaltenden Verbindung in einem Reagenz von ein (1) millimolar aus.
Die Mindestmenge an Phenazin enthaltender Verbindung, die für die Messung oder den Nachweis eines bestimmten Analyten in einer Probe erforderlich ist, hängt von folgenden Faktoren ab:
1) der Konzentration des zu messenden Analyten
2) der Effizienz des Enzyms als Redoxkatalysator
3) der Anzahl der übertragenen Elektronen
4) falls das Enzym eine Oxidase ist, der Effizienz der Reaktion der Oxidase mit Sauerstoff, welcher mit der Phenazin enthaltenden Verbindung in der Reaktion konkurriert und dem verfügbaren Sauerstoff, um mit der Oxidase zu reagieren (d. h., je wirkungsvoller die Reaktion der Oxidase mit Sauerstoff ist und je mehr Sauerstoff für die Reaktion mit der Oxidase zur Verfügung steht, desto mehr Phenazin enthaltende Verbindung wird im Reagens benötigt). Die Obergrenze der Menge an Phenazin enthaltender Verbindung, die im Reagens bereitgestellt werden kann, ist durch die Löslichkeit der Verbindung im Reagens gegeben.
Das dem Reagens zugesetzte Enzym muß von hinlänglicher Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu katalysieren. Ist zum Beispiel Glucose der Analyt, den man zu messen wünscht, so kann das Enzym Glucoseoxidase sein. In gleicher Weise kann Cholesterinoxidase zur Analyse von Cholesterin und Glycerin-3-phosphatoxidase zur Analyse von Glycerin-3-phosphat verwendet werden.
Bisweilen kann ein Puffer ein erforderlicher oder bevorzugter Zusatz zum Reagens sein. Der Puffer muß von hinlänglicher Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um für die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung den richtigen pH bereitzustellen und aufrechtzuerhalten. Zu den Beispielen für Puffer, die je nach gewünschtem pH im Reagens verwendet werden können, gehören "gute" Puffer wie etwa 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, N-(2-Acetamido)-2- iminodiessigsäure, Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure), N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure, N,N-Bis(2- hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure und N-2- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure. Für die Glucose-Analyse kann auch Maleinsäure verwendet werden.
Vorzugsweise kann dem Reagens auch ein Tensid zugesetzt werden, insbesondere bei höheren Konzentrationen an Phenazin enthaltender Verbindung. Das Tensid muß von hinlänglicher Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um eine Ausfällung des semichinoiden Indikators zu verhindern. Es können nichtionische Tenside wie etwa Polyoxyethylenether, Polyoxyethylensorbitane und TRITON-Tenside (zu beziehen durch Sigma Chemical Company) verwendet werden.
Spezielle Reagenzien für die Analyse spezieller Analyten können wie folgt formuliert werden:

Glucose-Reagens

Schritt 1: Es wurde eine Puffer-Stammlösung hergestellt durch Lösen von etwa 3,9 Gramm (g) 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure in etwa 100 Milliliter (ml) destilliertem Wasser. (Die Konzentration an 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure in der Puffer-Stammlösung belief sich auf etwa 200 mM). Der pH der resultierenden Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf etwa 5, 6 eingestellt.
Schritt 2: Es wurde eine Enzym enthaltende Lösung hergestellt durch Lösen von etwa 6 Kiloeinheiten (kE) Glucoseoxidase (Aspergillus niger) in etwa 8 ml der Puffer- Stammlösung.
Schritt 3: Es wurde eine Lösung von Phenazin enthaltender Verbindung hergestellt durch Lösen von etwa 3,3 g Phenazinethosulfat in etwa 25 ml destilliertem Wasser (diese Lösung hatte etwa 400 mM Phenazinethosulfat).
Ein einfaches Glucose-Reagens läßt sich herstellen durch Zusammengeben der Enzym enthaltenden Lösung und der Lösung der Phenazin enthaltenden Verbindung in einem Verhältnis von etwa 9 : 1 (Volumen/Volumen). Alternativ kann ein Reagenzienset bereitgestellt werden, wobei die Enzym enthaltende Lösung und die Lösung der Phenazin enthaltenden Verbindung jeweils in getrennten Ampullen aufbewahrt werden (und lyophilisiert werden können). Zur Anwendung des Reagenziensets sind die Enzym enthaltende Lösung und die Lösung der Phenazin enthaltenden Verbindung im oben angegebenen Verhältnis (etwa 9 : 1) (Volumen/Volumen) zu vereinigen, um eine Glucose-Bestimmung durchzuführen. (Lyophilisierte Ampullen können auch mit Wasser wiederhergestellt und im oben angegebenen Verhältnis vereinigt werden.)

Cholesterin-Reagens

Schritt 1: Es wurde eine Puffer-Stammlösung hergestellt durch Lösen von etwa 6,3 g 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure in etwa 100 ml destilliertem Wasser (die Konzentration an 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure in der Puffer-Stammlösung beträgt etwa 300 mM). Der pH der Puffer-Stammlösung kann durch Zugabe von 1normalem (N) Natriumhydroxid auf etwa 7,2 eingestellt werden.
Schritt 2: Etwa 2, 2 kE Cholesterinoxidase (aus Nocardia erythropolis) und etwa 104 Milligramm (mg) Phenazinethosulfat können in 5,2 ml der Puffer-Stammlösung gelöst werden. Zu der resultierenden Lösung kann TRITON X- 100 (ein nichtionisches Tensid, zu beziehen durch Sigma Chemical Company) in einer solchen Menge zugesetzt werden, daß die resultierende Lösung (das Cholesterin-Reagens) einprozentig (Volumen/Volumen) an TRITON X-100 wird.
Das Cholesterin-Reagens kann als einfaches Reagens oder als Reagenzienset bereitgestellt werden. Beim Reagenzienset wird das Phenazinethosulfat (vorzugsweise in lyophilisierter Form) in einem Behältnis bereitgestellt, und die übrigen Reagenzienkomponenten (vorzugsweise lyophilisiert) werden in einem getrennten Behältnis bereitgestellt.

Glycerin-3-phosphat-Reagens

Schritt 1: Es wurde eine Puffer-Stammlösung hergestellt durch Lösen von etwa 3,6 g N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure in etwa 100 ml destilliertem Wasser. Der pH der resultierenden Lösung wurde durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxid auf etwa 7,6 eingestellt.
Schritt 2: Es wurde eine Enzym enthaltende Lösung hergestellt durch Lösen von etwa 8 kE Glycerin-3-phosphatoxidase in etwa 8 ml Puffer-Stammlösung.
Schritt 3: Es wurde eine Lösung von Phenazin enthaltender Verbindung hergestellt durch Lösen von etwa 3,3 g Phenazinethosulfat in etwa 25 ml destilliertem Wasser (die resultierende Konzentration an Phenazinethosulfat belief sich auf etwa 400 mM.)
Ein einfaches Glycerin-3-phosphat-Reagens läßt sich erhalten durch Kombinieren der Enzym enthaltenden Lösung mit der Lösung der Phenazin enthaltenden Verbindung in einem Verhältnis von etwa 9 : 1 (Volumen/Volumen). Es kann auch ein Glycerin-3-phosphat-Reagenzienset bereitgestellt werden, indem die Enzym enthaltende Lösung und die Lösung der Phenazin enthaltenden Verbindung getrennt gehalten werden (vorzugsweise sind diese Lösungen jeweils lyophilisiert). Bei Verwendung des Set für einen Test auf Glycerin-3- phosphat sind das Enzym enthaltende Reagens und das Reagens mit der Phenazin enthaltenden Verbindung in den gleichen Anteilen wie vorstehend für das einfache Glycerin-3- phosphat-Reagens beschrieben bereitzustellen (diese Anteile gelten auch für Set-Reagenzien, die lyophilisiert und anschließend durch Zugabe von Wasser wiederhergestellt werden).
Die oben angegebenen Reagenzien sind flüssige Reagenzien (oder sind flüssig, nachdem das lyophilisierte Reagens mit Wasser wiederhergestellt wurde). Diese Reagenzien können auch in Filme eingearbeitet werden. Im Fall der Einarbeitung in einen Film enthält das Reagens ein Minimum einer Phenazin enthaltenden Verbindung, eines Enzyms und eines filmbildenden Mittels wie etwa mikrokristalline Hydroxyethylcellulose.
Wie vorstehend für die flüssigen und lyophilisierten Reagenzien angegeben, muß bei einem Film die Phenazin enthaltende Verbindung von hinlänglicher Art sein, um durch Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung ein Semichinoid zu bilden, und muß in ausreichender Menge vorliegen, um das Semichinoid nachzuweisen (wodurch die Gegenwart des Analyt nachgewiesen ist) oder die Konzentration des Semichinoid mit der Konzentration des Analyten in der analysierten Probe zu korrelieren. Demgemäß sollte die in den Film eingearbeitete Menge an Phenazin enthaltender Verbindung für die Glucose- Analyse einer Blutprobe zur Korrelation der Konzentration des Semichinoids mit der Konzentration an Glucose in der analysierten Probe wenigstens etwa 18 Mikromol (umol) pro g trockenen Films (unter der Annahme von 100% Trockenmasse oder 100% Festkörper im Film) betragen und wenigstens etwa 11 umol pro g trockenen Films für den Nachweis der Gegenwart von Glucose in der Probe. Auch das Enzym muß von hinlänglicher Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu katalysieren.
Auch ein Puffer kann in den Film eingearbeitet werden. Die verwendbaren Puffertypen und die Anforderungen an diese Puffer sind die gleichen wie die für flüssige und lyophilisierte Reagenzien vorstehend angegeben. (Bei Verwendung von Filmen zur Durchführung der Bestimmungen werden Messungen des spektrophotometrischen Reflexionsvermögens oder Durchlässigkeitsgrads und keine Extinktionsmessungen vorgenommen.)
Ein in einen Film eingearbeitetes Reagens kann auch ein Tensid enthalten. Das Tensid muß von hinlänglicher Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Oberfläche des Films bei Zugabe der zu analysierenden Probe zu benetzen.
Nachstehend ein spezielles Beispiel eines Films, der für Glucose-Analysen verwendet werden kann:

Glucose-Film

Filmkomponente Menge pro Kilogramm Film (Naßgewicht)
Äpfelsäure 150 mM
Nickelsulfat 50 mM
Mangansulfat 50 mM
CELABRITEa) 22% (Gewicht/Gewicht)
NATROSOL-250M 0,75% (Gewicht/Gewicht)
Dextransulfat (Molekulargewicht 5000 g/mol) 2% (Gewicht/Gewicht)
Glucoseoxidase (aus Aspergillus Niger, zu beziehen durch Biozyme Laboratories, Ltd.) 1500 Einheiten/g Naßfilm
PROPIOFAN 70Db) 7% (Gewicht/Gewicht)
TWEEN 20c) 0,5% (Gewicht/Gewicht)
Phenazinethosulfat 60 mM
Wasser
a) Diatomeenerde, zu beziehen durch Eagle-Picher Industries, Inc., Cincinnati, Ohio.
b) Wäßrige Vinylpropionat-Copolymer-Dispersion hoher Teilchengröße, zu beziehen durch BASF Corporation. Diese Zusammensetzung enthält ein Schutzkolloid.
c) Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, zu beziehen durch Sigma Chemical Company.
Dieser Film kann auf 250 um-CRONAR-Kunststoff aufbeschichtet werden (ein Kunststoff mit einem Gelträger, zu beziehen durch DuPont). Die nasse Beschichtung kann bei etwa 50ºC 20 Minuten lang getrocknet werden, wobei mehr als 90% des Wassers im nassen Film entfernt werden.
Das vorliegende erfinderische Reagens läßt sich vorteilhaft in Verfahren zur Messung der Menge eines Analyten in einer Probe einbringen. Das allgemeine Verfahren zur Messung der Menge (oder alternativ das Nachweisen der Gegenwart) eines Analyten in einer Probe umfaßt die folgenden Schritte:
Schritt 1: Bilden einer Testprobe durch Zusammenbringen der den Analyten enthaltenden Probe mit einem einfachen Flüssigreagens oder einem Film (vorstehend beschrieben);
Schritt 2: Inkubieren der Testproben;
Schritt 3: spektrophotometrische Messung der Extinktion der inkubierten Testprobe bei einer Wellenlänge von etwa 520 nm bis etwa 740 nm; und
Schritt 4: Korrelieren der gemessenen Extinktion der inkubierten Testprobe mit der Menge (oder der Gegenwart) des Analyten in der Probe.
Es ist wichtig, daß sich die Menge (oder die Gegenwart) des Indikators (Semichinoid) bei Wellenlängen von etwa 580 bis etwa 740 nm spektrophotometrisch messen (oder nachweisen) läßt. Die spektrophotometrische Messung bei diesen größeren Wellenlängen verringert Störungen durch Hämoglobin, Bilirubin und Trübungen, die in der analysierten Probe vorhanden sein können. Zwar können die spektrophotometrischen Messungen bei Wellenlängen von etwa 520 bis etwa 740 nm durchgeführt werden, doch werden die spektrophotometrischen Messungen mehrbevorzugt bei Wellenlängen von etwa 590 bis etwa 710 nm und meistbevorzugt bei etwa 620 bis etwa 670 nm durchgeführt.
Ein weiterer Vorteil dieser Verfahren zur Messung eines Analyten in einer Probe besteht darin, daß die Inkubierzeiten für die Testprobe viel kürzer sind als die Inkubierzeiten für die Testprobe bei den üblicheren kolorimetrischen Testverfahren. Bei Verwendung eines Flüssigreagens zur Messung der spektrophotometrischen Extinktion einer Lösung kann die Inkubierzeit im Bereich von etwa 10 Sekunden bis etwa 1 Minute liegen und liegt normalerweise im Bereich von etwa 10 Sekunden bis etwa 40 Sekunden. Bei Verwendung eines Films für die spektrophotometrischen Messungen des Reflexionsvermögens oder Durchlässigkeitsgrads kann die Inkubierzeit im Bereich von etwa 20 Sekunden bis etwa 1,5 Minuten liegen und liegt normalerweise im Bereich von etwa 20 bis etwa 60 Sekunden.
Die vorliegenden Verfahren seien anhand der folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1 - Glucose-Bestimmung

Es wurden wäßrige (destilliertes Wasser) Glucose-Stammlösungen mit Konzentrationen von 189, 472,5, 787,5 bzw. 1417,5 mg pro Deziliter (dl) hergestellt. Es wurde eine Bestimmung durchgeführt, indem 50 Mikroliter (ul) einer jeden Glucose- Stammlösung mit 1 ml des vorstehend beschriebenen, einfachen, speziell formulierten flüssigen Glucose-Reagens vereinigt wurden, um so eine Testprobe zu bilden. Jede Testprobe wurde etwa 15 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Dann wurde die spektrophotometrische Extinktion einer jeden inkubierten Testprobe bei 646 nm gemessen. Es bestand eine direkte Korrelation zwischen der spektrophotometrischen Extinktion der Testprobe und der Glucose-Menge in der analysierten Probe (Stammlösung).

Beispiel 2 - Cholesterin-Bestimmung

Es können PRECISET-Cholesterin-Standards (zu beziehen durch Boehringer Mannheim Corporation) verwendet werden. Es können Cholesterin-Standards von 0, 50, 100, 150, 200, 300 bzw. 400 mg Cholesterin pro dl Standard hergestellt werden. Mit den jeweiligen Cholesterin-Standards können Bestimmungen durchgeführt werden durch Vereinigen von 500 ul Cholesterin- Standard mit 500 ul des einfachen, speziell formulierten flüssigen Cholesterin-Reagens (vorstehend beschrieben), um so eine Testprobe bilden. Der Test kann etwa 15 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert werden. Die spektrophotometrische Extinktion der Testprobe kann dann bei 602 nm gemessen werden. Die Intensität der spektrophotometrischen Extinktion läßt sich dann direkt mit der Cholesterin-Menge im analysierten Cholesterin-Standard korrelieren.

Beispiel 3 - Glycerin-3-phosphat-Bestimmung

Es wurden wäßrige (destilliertes Wasser) Glycerin-3- phosphat-Standards mit 22,1, 44,2 und 66,3 mM hergestellt. Es wurden Testproben hergestellt, indem 50 ul einer jeden Glycerin-3-phosphat-Stammlösung zu 1 ml des vorstehend beschriebenen, speziell formulierten Glycerin-3-phosphat- Flüssigreagens getrennt zugesetzt wurden. Die Testproben wurden jeweils 15 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die spektrophotometrische Extinktion einer jeden inkubierten Testprobe wurde bei 602 nm gemessen. Die Intensität der spektrophotometrischen Extinktion korrelierte direkt mit der Menge an Glycerin-3-phosphat in jedem Glycerin-3-phosphat-Standard.
Bei Verwendung eines (wie vorstehend beschriebenen) Reagenziensets bei einem Bestimmungsverfahren können erstes und zweites Reagens des Set zusammengegeben werden (unter Bildung eines einfachen Flüssigreagens wie vorstehend beschrieben), ehe die zu analysierende Probe zugesetzt wird. Alternativ kann eine intermediäre Probe gebildet werden, indem die den Analyten enthaltende Probe mit dem ersten Reagens des Set zusammengegeben wird (das erste Reagens enthält die Phenazin enthaltende Verbindung). Dann wird durch Zusammengeben der intermediären Probe und des zweiten Reagens die Testprobe gebildet (das zweite Reagens des Set enthält das Enzym und den Puffer). Die Testprobe wird dann (wie vorstehend beschrieben) inkubiert, und die inkubierte Testprobe wird (wie vorstehend beschrieben) spektrophotometrisch gemessen. Bei der Bestimmung sollte die Inkubierzeit eingeleitet werden, indem das Enzym oder der Analyt, den man zu messen wünscht, und nicht die Phenazin enthaltende Verbindung zugesetzt wird. (Wird der Analyt, den man zu messen wünscht, und das Enzym vor der Zugabe der Phenazin enthaltenden Verbindung zusammengegeben, so kann eine unerwünschte Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und Sauerstoff eintreten.)
Wird ein Film anstelle eines flüssigen Reagens verwendet, so wird die Testprobe gebildet, indem eine flüssige, den Analyten enthaltende Probe mit dem Film zusammengebracht wird (siehe Schritt 1 des allgemeinen Verfahrens). Die Testprobe wird dann etwa 20 bis etwa 60 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur inkubiert (siehe Schritt 2 des allgemeinen Verfahrens). Das Reflexionsvermögen oder der Durchlässigkeitsgrad der inkubierten Testprobe wird dann bei den vorstehend angegebenen Wellenlängen gemessen (oder nachgewiesen). (Siehe Schritt 3 des allgemeinen Verfahrens.) Die Intensität des Reflexionsvermögens oder Durchlässigkeitsgrads der inkubierten Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Analyten in der analysierten Probe (siehe Schritt 4 des allgemeinen Verfahrens).
Die vorliegende Erfindung wurde anhand der vorstehenden Lehren mit hinreichender Klarheit und Prägnanz offenbart, so daß ein Fachmann in die Lage versetzt wird, die Erfindung auszuführen und anzuwenden, die beste Art der Durchführung der Erfindung zu erkennen, und sie von anderen Erfindungen und von altem zu unterscheiden. Es sind viele Abwandlungen und offensichtliche Anpassungen ohne weiteres denkbar, und diese sollen im Umfang dieser Erfindung wie nachstehend beansprucht enthalten sein.

Claims

1. Reagens zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Probe, umfassend:

eine Phenazin enthaltende Verbindung, die von hinlänglicher Art ist, um ein Semichinoid als Indikator durch eine Reaktion unter Beteiligung eines Enzyms, eines Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu bilden, und in ausreichender Menge vorliegt, um den Nachweis des semichinoiden Indikators und damit den Nachweis des Analyten in der Probe zu ermöglichen, und wobei das Enzym von hinlänglicher Art ist und in ausreichender Menge vorliegt, um die indikatorbildende Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu katalysieren.

2. Reagens nach Anspruch 1, des weiteren umfassend Wasser.

3. Reagens nach Anspruch 1, worin die Phenazin enthaltende Verbindung in ausreichender Menge vorliegt, um die Konzentration des Semichinoids mit der Konzentration des Analyten in der Probe zu korrelieren.

4. Reagens nach Anspruch 3, des weiteren umfassend Wasser.

5. Reagens nach Anspruch 2, wobei der Analyt Glucose ist und die Konzentration der Phenazin enthaltenden Verbindung wenigstens etwa einmillimolar ist.

6. Reagens nach Anspruch 4, wobei der Analyt Glucose ist und die Konzentration der Phenazin enthaltenden Verbindung wenigstens etwa 4millimolar ist.

7. Reagens nach Anspruch 4, wobei die Phenazin enthaltende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat, N-Ethylmethoxyphenazinethosulfat und 1-Methoxyphenazinmethosulfat.

8. Reagens nach Anspruch 4, wobei die Phenazin enthaltende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenazinmethosulfat und Phenazinethosulfat.

9. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, des weiteren umfassend einen Puffer hinlänglicher Art und in ausreichender Menge, um für die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung den richtigen pH bereitzustellen und aufrechtzuerhalten.

10. Reagens nach Anspruch 8, des weiteren umfassend einen Puffer hinlänglicher Art und in ausreichender Menge, um für die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung den richtigen pH bereitzustellen und aufrechtzuerhalten.

11. Reagens nach Anspruch 9, des weiteren umfassend ein Tensid hinlänglicher Art und in ausreichender Menge, um eine Ausfällung des Semichinoids zu verhindern.

12. Reagens nach Anspruch 11, wobei das Tensid ein nichtionisches oder anionisches Tensid ist.

13. Film zum Nachweis der Gegenwart eines Analyten in einer Probe, umfassend:

eine Phenazin enthaltende Verbindung, ein Enzym und ein filmbildendes Mittel,

wobei die Phenazin enthaltende Verbindung von hinlänglicher Art ist, um ein Semichinoid als Indikator durch eine Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu bilden, und in ausreichender Menge vorliegt, um den Nachweis des semichinoiden Indikators und damit den Nachweis des Analyten in der Probe zu ermöglichen,

wobei das Enzym von hinlänglicher Art ist und in ausreichender Menge vorliegt, um die indikatorbildende Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung zu katalysieren, und wobei das filmbildende Mittel in ausreichender Menge vorliegt, um einen zusammenhängenden Film zu bilden.

14. Film nach Anspruch 13, worin die Phenazin enthaltende Verbindung in ausreichender Menge vorliegt, um die Konzentration des Semichinoids mit der Konzentration des Analyten in der Probe zu korrelieren.

15. Film nach Anspruch 13, wobei der Analyt Glucose ist und die Menge an Phenazin enthaltender Verbindung wenigstens etwa 11 umol pro Gramm trockenen Films beträgt.

16. Film nach Anspruch 14, wobei der Analyt Glucose ist und die Menge an Phenazin enthaltender Verbindung wenigstens etwa 18 umol pro Gramm trockenen Films beträgt.

17. Film nach Anspruch 13 oder 14, des weiteren umfassend einen Puffer hinlänglicher Art und in ausreichender Menge, um für die Reaktion unter Beteiligung des Enzyms, des Analyten und der Phenazin enthaltenden Verbindung den richtigen pH bereitzustellen und aufrechtzuerhalten.

18. Film nach Anspruch 17, des weiteren umfassend ein Tensid hinlänglicher Art und in ausreichender Menge, um die Oberfläche des Films nach Zugabe der Probe zu benetzen.

19. Film nach Anspruch 18, wobei der Analyt Glucose ist, die Phenazin enthaltende Verbindung Phenazinethosulfat ist, das Enzym ist Glucoseoxidase ist, das filmbildende Mittel mikrokristalline Hydroxyethylcellulose ist, der Puffer Äpfelsäure ist, und das Tensid Polyoxyethylensorbitanmonolaurat ist.