DE2459087C3 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden - Google Patents
Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von SerumtriglyceridenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung ton Serumtriglyceriden durch enzymatische Hydrolyse
•nd Dehydrierung des gebildeten Glycerins mit Hilfe •ines Enzym-Coenzym-Reagenz, das Lipoproteinlipase
(LPL), die aus einer Kulturflüssigkeit von Chromobactefium viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde,
Glycerindehydrogenase (GDH) und Nicotinamidade-■indinucleotid (NAD) enthält, und kolorimetrische
Bestimmung der Färbung, die bei Zugabe einer wäßrigen Lösung eines Gemisches einer Tetrazoliumferbindung
mit Phenazinmethosulfat durch Reduktion der Tetrazoliumverbindung zu dem Formazan entwikkelt
wird. Die Erfindung betrifft außerdem ein zur Durchführung dieses Verfahrens geeignetes Reagenz.
Die Bestimmung der Triglyceride ist als einer der Lipidtests auf Hyperlipidämie allgemein bekannt, und
die klinische Bedeutung dieser Bestimmung steigt
Händig an. Einige bekannte Bestimmungsmethoden •rl'ordern jedoch komplizierte und schwierige Verfahferisschritte
und sind daher als übliche Testmethoden Ungeeignet. So werden beispielsweise bei dem Acetyllcetonverfahren,
das zur Zeit häufig angewendet wird, die Triglyceride zuerst durch Extraktion mit einem
organischen Lösungsmittel isoliert, weil die Neutralfette nicht durch Phospholipide oder Saccharide beeinflußt
werden dürfen, die in dem Serum vorliegen. Dieses Verfahren ist äußerst kompliziert Dann werden die so
extrahierten Triglyceride mit einem Alkali hydrolysiert, und das durch Hydrolyse gebildete Glycerin wird mit
einem Oxydationsmittel, wie Natriummetaperjodai, oxydiert, der dabei gebildete Formaldehyd wird mit
Acetylaceton kondensiert, und die entwickelte Färbung wird durch Kolorimetrie bestimmt. Dieses Verfahren
umfaßt somit mehrere Stufen. Das vorstehend beschriebene Acetylacetonverfahren wird beispielsweise von
M. J. Fletcher, »A colorimetric method for estimating
serum triglycerides«, Clinica Chimica Acta 22 (1968), 393-397, erläutert.
ία Außerdem wurde bereits über die Bestimmung von
Serumtriglyceriden mit Lipoproteinlipase-GIycerindehydrogenase
berichtet (K. O η ο b u , »Study of enzymatic analysis in clinical chemistry«, Report 12 [Nihon
Yakugaku-Kai 93 nen-Kai] [1973]). Nach diesen Verfahren, bei denen eine enzymatische Reaktion
angewendet wird, können die bei der Acetylacetonmethode erforderlichen Stufen der Extraktion und
Adsorption weggelassen werden. Speziell die zuletzt genannte Hydrolyse von Triglyceriden mit Lipoprotinlipase
ist vorteilhaft zur Bestimmung von Serumtriglyceriden, weil sie selektiv wirksam für Chylomikronen und
mit Lipoprotein kombinierende Neutralfette ist. Die Reaktion der Dehydrierung von Glycerin ist jedoch
nachteilig im Hinblick auf einfache und rasche Durchführung, weil spezielle Verfahrensmaßnahmen
erforderlich sind, da das Reaktionsgleichgewicht auf die Seite der NAD-Bildung verschoben ist und zur
Bestimmung von NADH Wellenlängen im Ultraviolettbereich
angewendet werden. So ist beispielsweise bei der enzymatischen Analyse nach K. O η ο b u et al. das
Gleichgewicht der enzymatischen Dehydrierungsreaktion von Glycerin mit GDH auf die Seite der
NAD-Bildung verschoben, und das durch die Reaktion gebildete Dihydroxyaceton muß daher aus dem
Reaktionsgemisch entfernt werden, um die Reaktion zu beschleunigen. Die Dehydrierungsreaktion wird durch
Zugabe von Hydrazin zu dem Reaktionsgemisch durchgeführt, um Dihydroxyaceton in das Hydrazon
überzuführen. Die Bestimmung umfaßt daher zwei Stufen. Darüber hinaus beeinflußt bei der Bestimmung
des gebildeten NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm das im Blut vorliegende Bilirubin die Absorption
bei der Wellenlänge von 340 nm, und zur Korrektur des Wertes ist daher eine Serumblindprobe unerläßlich.
In der US-PS 37 03 591 ist ein Verfahren beschrieben,
bei dem Triglyceride mit Hilfe einer Kombination von Lipase und Protease enzymatisch zersetzt werden und
das so erhaltene Glycerin durch eine Änderung der Konzentration an NADH bestimmt wird. Bei diesem
Verfahren kann als Lipase eine mikrobielle Lipase, wie aus Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum
verwendet werden. Die bei diesem Verfahren geeignete Glycerindehydrogenase ist ein von Enterobacter aerogenes
gebildetes Enzym. Gemäß einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird dann das gebildete NADH durch
Zugabe einer Tetrazoliumverbindung und Phenazinmethosulfat (PMS) kolorimetrisch bestimmt.
Aus der DE-OS 20 20 506 ist ferner ein Farbreagen/ zur Bestimmung der Serumtriglyceride bekannt, bei
dem die Triglyceride in einer ersten Stufe mit Hilfe einer beliebigen Methode gespalten werden und danach das
gebildete Glycerin in Gegenwart von Glycerindehydrogenase, Nicotinamidadenindinucleotid und einer Tetrazoliumverbindung
und Phenazinmethosulfat bestimmt wird. Bei der Bestimmung von Triglyceriden im Serum
treuen jedoch Schwierigkeilen wegen der im Serum vorhandenen reduzierenden Verbindungen, wie Ascorbinsäure
Und Harnsäure, auf. Diese Verbindungen
beeinflussen bei der kolorimetrischen Bestimmung mit
Hilfe von Tetrazoliumsalzen und Phenazinmethosulfat die Farbreaktion störend, da sie in bestimmten
pH-Bereichen eine Reduktion der Tetrazoliumsalze bewirken. Versucht man diese Störungen bei den
bekannten Verfahren durch genaue Einstellung des pH-Bereiche:; zu vermeiden, so wird die Aktivität der
bekanntermaßen verwendeten Bakterienenzyme vermindert.
Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Reagenz zur
Verfugung zu stellen, das die zuverlässige und genaue Bestimmung von Serumtriglyceriden mit Lipoproteinlipase-Glycerindehydrogenase
ermöglicht, ohne daß Störungen durch andere Serumbestandteile auftreten.
Dieses Verfahren soll eine kolorimetrische Ablesung bei einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich ermöglichen
und in einer einzigen Stufe durchführbar sein.
Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe gelöst werden kann, indem bei der eingangs beschriebenen Triglyceridbestimmung
als GDH ein Enzym verwendet wird, das aus einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium
erhalten wurde, und daß man sowohl die enzymatische Hydrolyse derTriglycende als auch die Dehydrierungiireaktion
des gebildeten Glycerins in Gegenwart der vorher zugesetzten Tetrazoliumverbindung und des
Pheriazinmethosulfats und bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 vornimmt.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden, enthaltend
eine Lipase, GDH, NAD, eine Tetrazoliumverbindung
lü und Phenazinmethosulfat, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es als Lipase eine Lipoproteinlipasi: (LPL), die
aus einer Kühlflüssigkeit von Chromobaceterium
viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde, und als GDH ein Enzym, das aus einer Kulturflüsisigkeit von
Bacillus megatherium erhalten wurde, aufweist und daß es auf einen pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5
gepuffert ist.
Der Mechanismus der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und in dem erfindungsgemäßen Reagenz
stattfindenden enzymatischen Reaktion kann folgendermaßen dargestellt werden:
Triglyceride j
LPL
Fettsäure +
Glycerin
GDH
,NAD ^NADH
lt_t' '
PMSH.
PMS"
PMS"
,Tetrazolium
^Formazan
^Formazan
Dihydroxyaceton
In den vorstehend angegebenen enzymatisehen
Reaktionen verläuft die Reaktion der Hydrolyse von Triglyceriden zu Fettsäure und Glycerin unter der
Einwirkung des Enzyms LPL in Richtung des Pfeils, während die Dehydrierungsreaktion des so gebildeten
Glycerins unter Bildung von Dihydroxyaceton unter Einwirkung von GDH in Gegenwart von Coenzym
NAD ein Gleichgewicht zeigt, das in Richtung der Bildung von NAD verschoben ist. Die Dehydrierungsreaktion
des Glycerins kann nun zwangsweise in Pfeilrichtung verschoben werden, indem vorher Phenazinmethosulfat
und eine Tetrazoliumverbindung zusätzlich zu dem Coenzym NAD dem Reaktionsmedium
zugegeben werden.
Die Hydralysereaktion des Triglycerids und die Dehydrierungsreaktion von Glycerin mit Hilfe der
angegebenen Enzyme werden daher in einer Stufe durchgeführt, und gleichzeitig wird die Färbung, d'e
durch Reduktion der Tetrazoliumverbindung zu dem Formazan entwickelt wird, kolorimetrisch bei einer
Wellenlänge im sichtbaren Wellenlängenbereich bestimmt, wobei der Anteil der Triglyceride erhalten wird.
Wie vorstehend veranschaulicht wurde, reduziert das quantitativ durch das Triglycerid gebildete NADH die
Tetrazoliumverbindung quantitativ zu dem Formazan über eine Verfahrensstufe, in der PMS in PMSH
umgewandelt: wird. Der Grad der Farbentwicklung der Reaktionsflüssigkeit im sichtbaren Wellenlängenbereich
ist proportional der Menge des Triglycerids, und auf diese Weise wird die Bestimmung des Trigly;erids
nach dem beschriebenen Verfahren ermöglicht.
Die Reaktionen werden gewöhnlich bei einer Temperatur von beispielsweise 37°C während 20
Minuten durchgeführt, und danach wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 0,1 n-HCI-Lösung
vermindert, um die Reaktion zu beenden.
LPL wird aus einer Kulturflüssigkeit von Chromobakterium
Viscosum var. Paralipolyticum erhalten. GDH wird aus einer Kulturfiüssigkeit von Bacilluü megatheri-
■so um erhalten.
Ein zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignetes Enzym-Coenzym-Reagenz kann hergestellt werden,
indem LPL, GDH und NAD in einer Pufferlösung gelöst werden und die erhaltene Lösung gefriergetrocknet
■j1) wird. Die Pufferlösung unterliegt keiner besonderen
Beschränkung, mit der Ausnahme, daß die Lösung eine Pufferwirkung im pH-Bereich von 7,0 bis, n,5 zeigen
sollte. Eine bevorzugte Pufferlösung ist eine 0,1 m-Phosphalpufferlösung(pH 7,6).
Phenazinmethosulfat (PMS), das als sehr instabil angesehen wurde, kann während langer Dauer stabil
aufbewahrt werden, indem es in Form einer wäßrigen Lösung oder eines Gemisches einer solchen Lösung mit
einer Tetrazoliumverbindung in einer braunen PoIyäthylenreagenzflasche
an einem kalten, dunklen Ort aufbewahrt wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels näher erläutert.
in dem Beispiel bedeutet die Einheit von GDH eine solche Menge an GDH, die zur Isolierung von I
Micromol NADH bei 25°C während einer Minute befähigt isf. wenn Glycerin als Substrat und als
Coenzym NAD verwendet werden. Eine Einheit LPL bedeutet das 2,5fache der internationalen Einheil, die
mit Hilfe der PVA-Emulsionsmethode gemessen wird.
In der Zeichnung zeigt Fig. 1 die enge Übereinstimmung
zwischen der üblichen Acelylacetonmcthode und der erfindungsgemäßen Methode zur Trioleinanalyse.
Auf diese Zeichnung wird in dem nachstehenden Beispiel ebenfalls Bezug genommen.
L Herstellung der Reagenzien
(1) Erster Ansatz (Enzym-Coenzym-Reagenz):
(1) Erster Ansatz (Enzym-Coenzym-Reagenz):
LPL | 20 000 Einheiten |
GDH | 1 000 Einheiten |
NAD | 500 mg |
Die vorstehend angegebene Stoffzusammensetzung wird in 100 ml einer 0,1 m-Phosphatpufferlösung (pH
7,6) gelöst, und 5,0 ml Anteile der Lösung werden gefriergetrocknet.
(2) Zweiter Ansatz:
Nitrotetrazoliumblau
Phenazinmethosulfat
Phenazinmethosulfat
50 mg
10 mg
10 mg
Den vorstehend genannten Bestandteilen wird gereinigtes Wasser zugesetzt, so daß die Gesamtmenge
100 ml beträgt.
II. Verfahren
Der Inhalt (5,0 ml) des vorstehend angegebenen Enzym-Coenzym-Aflsatzes (1) wird in 5,0 ml des
Ansatzes (2) gelöst, wobei die Reaktionslösung erhalten wird. 0,5 ml der Reaktionslösung (die 100 Einheiten LPL
und 50 Einheiten GDH enthält) wird in ein Reagenzglas gegeben und mit 0,02 ml einer Serumprobe versetzt. Die
Reaktion wird bei 37°C genau 20 Minuten vorgenommen. Unmittelbar danach wird die Reaktion durch
Zugabe von 5,0 ml einer 0,1 HCl-Lösung beendet, wobei
der pH-Wert vermindert wird. 5 bis 90 Minuten nach Beendigung der Reaktion erfolgt die kolorimetrische
Bestimmung in üblicher Weise bei einer Wellenlänge von 570 bis 600 nm im Vergleich mit einer Blindprobe
des Reagenz als «vontrollprobe. Gesondert davon wird
das gleiche Verfahren unter Verwendung eines Standards (gefriergetrocknetes Serum, das eine vorbestimmte
Menge an Triglycerid enthält)' wiederholt, um eine
Eichkurve zu erhalten. Aus dem Ergebnis der Bestimmung wird die Menge des Triglycerids in der Probe
berechnet.
Die Reaktionsdauer muß streng kontrolliert werden, während die Konzentration der Reagenzien, die
Reaktionstemperatur und der pH-Wert verändert werden können, solange sie das Ergebnis der Bestimmung
nicht beeinflussen.
Die Ergebnisse der Trioleinanalyse, die nach dem beschriebenen Beispiel durchgeführt wurde, sind in
Tabelle 1 gezeigt Die Serumproben in der Tabelle werden hergestellt, indem Blut bestimmter einzelner
Personen in üblicher Weise zentrifugiert wird.
Serum Nr. | Trioleih mg/dl |
Acetylaceton- | |
Methode | |
1 | 1040 |
2 | 990 |
3 | 735 |
4 | 505 |
5 | 463 |
6 | 340 |
7 | 290 |
8 | 190 |
9 | 106 |
10 | 70 |
erfindungs-
gemäße
Methode
1090
L yw 975
735
525
445
340
525
445
340
/ 2Ά) 260
203
HO
73
HO
73
Die Trioleinanalyse wurde unter Verwendung von 70 Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das in
dem vorstehenden Beispiel beschrieben wurde, und nach dem üblichen Acetylacelonverfahren durchgeführt.
Wie in F i g. 1 gezeigt ist, wurde gute enge Übereinstimmung erreicht.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reagenz und Verfahrens werden folgende Vorteile erzielt:
Selbst eine sehr geringe Menge einer Probe kann in einer Stufe analysiert werden; mit Lipoproteincn
kombinierende Triglyceride können bestimmt werden, ohne daß sie durch andere Bestandteile des Blutes
beeinflußt werden; ein weiterer Zusatzstoff, wie Hydrazin, zum Beschleunigen der Reaktion ist nicht
erforderlich, die Bestimmung kann bei einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich durchgeführt werden, und es
ist keine Serumblindprobe erforderlich. Die Bestimmung erfordert daher nur kurze Zeit, das Verfahren ist
einfach, und es kann eine einfache Vorrichtung für die kolorimetrie eingesetzt werden.
Vergleichsversuch
Der beschriebene Versuch zeigt, daß in dem erfindungsgemäß angewendeten optimalen pH-Bereich
von 7,0 bis 9.5 bei Verwendung des LPL-GDH-Formazan-Systems
ermöglicht wird, die Aktivität der beiden speziellen Bakterienenzyme LPL und GDH optimal zu
erreichen. In diesem Versuch wurde die Aktivität der GDH nach der üblichen Methode durch die Erhöhung
der Absorption bei 340 nm (25° C) pro Minute gemessen. Für den Versuch wurde eine 0,5 m-Phosphat, Glycin und
NaOH enthaltende Pufferlösung, die 2 m-Glycerin als
Substrat sowie NAD und Rinderalbumin enthielt (0,1 m-Glycerin wurde zugesetzt, um die Pufferwirkung
auf den Bereich von 7,0 bis 10,0 auszudehnen), verwendet.
Die bei diesem Versuch erhaltene F i g. 2 zeigt deutlich, daß das erfindungsgemäß eingesetzte GDH
von Bacillus megatherium ein Aktivitätsmaximum bei einem pH-Wert von 9,0 hat und eine relativ hohe
Aktivität innerhalb eines breiten pH-Bereiches von etwa 7,5 bis 9 aufweist, während das bekanntermaßen
eingesetzte GDH erst bei einem pH-Wert von etwa 9,5 ihr Aktivitätsmaximum zeigt und unterhalb dieses
Bereiches stark verminderte Aktivität haL
Ferner wurde ein Vergleichsversuch unter Verwendung des erfindungsgemäß eingesetzten GDH und des
bekanntermaßen verwendeten GDH nach der einstufi-
gen Verfahrensweise gemäß der Erfindung zur Bestimmung
eines Scrumtriglyccrids durchgeführt (Menge des Triglycerids : 510 mg/dl). Dieser Versuch wurde in
gleicher Weise wie das anmcldungsgemäße Beispiel vorgenommen* mit der Abänderung, daß ansteile eines
0,1 m-Phosphatpuffers der vorstehend angegebene Puffer verwendet wurde. Die so erzielten Ergebnisse
sind in der Fig.3 als Zusammenhang zwischen der Absoi-ptiön und dem pH-Wert angegeben. Bei dem
crfindungsgcmäßen einstufigen Verfahren unter Verwendung der speziellen Glycerindehydrogcnase wird
der Absorptionsverlauf in einem pH-Beruich von etwa
7,5 bis 9 konstant, so daß das Meßergebnis in diesem Bereich nicht durch den pH-Wert beeinflußt wird (bei
dem erfindungsgemäßen Beispiel wurde ein pH-Wert von 7,6 eingestellt).
Wenn der pH-Wert jedoch 9,5 überschreitet, so tritt eine nichtenzymatische Reduktion von Tctrazoliumsalzcn
durch die im Serum vorliegenden reduzierenden VcfüinuüngEn ein.
Wenn andererseits jedoch die Glycerindehydrogcnase gemäß US-PS 37 03 591 verwendet wird, bewirkt
eine leichte Veränderung des pH-Wertes während der Reaktion eine starke Änderung der Absorption, so daß
das Meßergebnis verfälscht wird. Außerdem ist bei Verwendung des bekannten Enzyms in diesem pH-Bereich
die Keaktionsaktivität so gering, daß die Reaktion nicht ausreichend fortschreitet.
Um bei dem bekannten Verfahren ausreichende
ί Reaktionsaktivität zu erreichen und um Störungen
durch eine pH-Änderung auszuschalten, muß bekanntermaßen ein pH-Wert von mehr als 9,5 angewendet
werden. Bei hohen pH-Werten herrscht jedoch die niclitenzymatische Reduktion Von Tetrazoliumsalzen
in durch im Serum vorliegende reduzierende Verbindungen
vor. Darüber hinaus wird die Von Vornherein auftretende Färbung der Tetruzoliumsalzc stärker. Die
so entwickelte Färbung ist durch eine Erhöhung des Blindwertes im Verlauf der Zeit ersichtlich, so daß keine
Ij exakte Bestimmung der Triglyceridc durchgeführt werden kann.
Um diese erwähnten Nachteile zu umgehen und trotzdem eine exakte Messung durchführen zu können,
muß bei dem bekannten Verfahren und unter Vcrwen-
Ss u'iiiig der b'ekafifiien GDn die Bestimmung der
Serumtriglyceride in mindestens zwei Stufen Vorgenommen werden, wobei zuerst die enzymatische Reaktion
bei einem pH-Wert von 9,5 oder darüber und danach die Farbreaktion bei einem pH-Wert von vorzugsweise 8,5
oder weniger durchgeführt wird.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
809 642/330
Claims (2)
1. Verfahren zur Bestimmung von Serumtriglyceriden
durch enzymatische Hydrolyse und Dehydrierung des gebildeten Glycerins mit Hilfe eines
Enzym-Coenzym-Reagenz, das Lipoproteinlipase (LPL), die aus einer Kulturflüssigkeit von Chromobacterium
viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde, Glycerindehydrogenase (GDH) und Nicotinamidadenindinucleotid
(NAD) enthält, und kolorimetrische Bestimmung der Färbung, die bei Zugabe einer wäßrigen Lösung eines Gemisches einer
Tetrazoliumverbindung mit Phenazinmethosulfat durch Reduktion der Tetrazoliumverbindung zu dem
Formazan entwickelt wird, dadurch gekennzeichnet,
daß man als GDH ein Enzym verwendet, das aus einer Kulturflüssigkeit von
Bacillus megatherium erhalten wurde, und daß man sowohl die enzymatische Hydrolyse der Triglyceride
als auch die Dehydrierungsreaktion des gebildeten Glycerins m Gegenwart der vorher zugesetzten
Tctrazoüurnverbindiing und des Phenazinrnethosu!
fats und bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 vornimmt.
2. Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden, enthaltend eine Lipase, GDH, NAD, eine
Tetrazoliumverbindung und Phenazinmethosulfat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lipase eine
Lipoproteinlipase (LPL), die aus einer Kulturflüssigkeit von Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum
erhalten wurde, und als GDH ein Enzym, das aus. einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium
erhalten wurde, aufweist und daß es auf einen pH -Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 gepuffert ist.
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