DE2847202A1

DE2847202A1 - Verfahren zur bestimmung von triglyceriden

Info

Publication number: DE2847202A1
Application number: DE19782847202
Authority: DE
Inventors: Jerry William Denney
Original assignee: American Monitor Corp
Current assignee: American Monitor Corp
Priority date: 1977-12-07
Filing date: 1978-10-30
Publication date: 1979-06-13
Also published as: FR2411411B1; US4245041A; FR2411411A1; CA1125151A; JPS5480192A; IT7828628A0; BE872547A; IT1099369B

Description

GEYER, HAGEMANk' & !¹ARTNLR

estouchosstraße 60 · Postfach 400745 ■ 80(X) München 40 -Telefon 089/304071* -Telex 5-216136 hage d -Telegramm hageypalrnt -Telekopierer 089/304071

u.Z.: Pat 46/3-78Gh München_/ den

30. Oktober 1978

Dr-H/3/mi

American Monitor Corporation, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRIGLYCERIDEN

Beanspruchte Priorität: Datum: 7. Dezember 1977

Land: V.St.A. Az.: 858 187

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GEYER, HAGEMANN & PARTNrR

PATENTANV.'ÄLTt 9 8 Λ 7 2 Q 2

Destouchesstraße 60 · Postfach 400745 ■ 8000 München 40 -Telefon 089/304071* -Telex 5-216136 hago d ·Telegramm hngcypalpnl ·Tolekopierer 089/304071

American Monitor Corporation, München, den

Indianapolis, Indiana, V.St.A. 30. Oktober 1978

u.Z.: Pat 46/3-78Ch Dr.H/3/st

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRIGLYCERIDEN

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei das auf eine Hydrolyse der Triglyceride zurückgehende Glycerin enzymatisch mit einem NAD/NADH-System (System Nikotinamidadenindinucleotid / reduziertes Nikotinamidadenindinucleotid) gekoppelt wird.

Triglyceride, die Triester der Fettsäuren mit Glycerin darstellen, haben für die Menschheit dadurch eine sehr starke Bedeutung, daß sie für die im menschlichen Körper ablaufenden biochemischen Vorgänge beachtliche Energiequellen bereitste!-

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len. Etwa 18 % des gesamten Körpergewichts eines Menschens beste henaus Fettgewebe, das wiederum einen Gehalt von etwa 90 % (Trockengewicht) an Triglyceriden zeigt. Der abbauende Stoffwechsel der Triglyceride liefert die Hauptmenge der dem menschlichen Körper verfügbar gemachten Körperenergie, wobei lediglich der Glukosestoffwechsel eine Ausnahme macht.

Die Energiequellen in Form der Triglyceride werden mobilisiert und in dem Blutstrom zirkuliert, was zusammen mit Proteinträgermolekülen, bekannt als Lipoproteine, erfolgt.

Es wurde lange angenommen, daß das Vorliegen von im menschlichen Serum zirkulierenden Triglycerüen erhöhter Konzentration (Hypertriglyceridaemie) krankhafte Erscheinungen in der Herzkranzarterie zur Folge hat. In der Tat gehen etwa 50 % krankhafter Veränderungen im Arterienbereich (Artheromatöseläsionen) auf Triglyceride zurück (Böttcher, C.J.F., Boelsa - Van Houte, E., KAAR, Romeny-Wächter, CC, Woodford, F.P., und Van Gent, CM., Lancet, ii 1162, 1960, zitiert von Searcy, Ronald L-, in Diagnostic Biochemistry, 487, McGraw-Hill, 1969).

Die bedeutsame Rolle der Triglyceride bei dem Auftreten von Kranzarterienerkrankungen, die lange in den Vereinigten Staaten von Amerika als hauptsächliche Ursache des VerSterbens und des Auftretens der Arbeitsunfähigkeit und der Be-

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einträchtigung des. Schaffens erkannt worden war, wird durch die Hypertriglyceridaemie gezeigt, die zu einem hohen Prozentsatz bei Patienten mit bekannten Erkrankungen der Kranzarterie oder mit Herzmuskelinfarkt beobachtet wurde.

Es ist lange erkannt worden, daß die Diätpläne einen außergewöhnlichen Einfluß auf die Menge an zirkulierenden Triglyceriden ausüben. Somit würde eine v/irksame Messung der Triglyceridkonzentration den klinischen Mediziner im Hinblick auf den Anteil der Bevölkerung alarmieren, der für die Hypertriglyeridaemie besonders anfällig ist. Eine derartige Messung würde erstrebenswerterweise auf einen eingeschränkten oder modifizierten Diätplan bei diesen Personen hinweisen, um auf diese Weise in deren späteren Leben Kranzarterienerkrankungen auszuschließen oder deren Schwere herabzusetzen.

Die Hypertriglyceridaemie die zusätzlich mit Kranzarterienerkrankungen verbunden ist, ist auch mit gewissen Arten von Lebererkrankungen ,der Diabetes me.llitus,der Pankreatitisund Leberstärkeerkrankungen verknüpft.

Eine einfache, empfindliche und reproduzierbare Untersuchungsmethode für Triglyceride ist somit von großer Bedeutung, was kaum überschätzt werden kann. Von einem großen Anteil der

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betroffenen Bevölkerung wird diese entscheidende Untersuchung abgelehnt, was auf die relativ geringe Zahl von Möglichkeiten zurückgeht, die zur Durchführung bekannter Tests verfügbar ist, was wiederum von technologischen Schwierigkeiten abhängt.

Zwar wurden entsprechend während vieler Jahre eine Vielzahl von Triglycerid-Bestimmungsmethoden erprobt. Auch wurde in dem medizinischen Bereich seit langem die entscheidende Bedeutung der Triglycerid-Bestimmungen erkannt. Die bisherigen Bemühungen waren vielzählig und modifiziert, einschließlich 0 vielfältiger und deutlich verschiedener Abweichungen voneinander. Sämtliche bekannten Verfahren zeigten jedoch mehr oder weniger starke Nachteile.

Die medizinische Forschung hat seit langem erkannt, daß es von außergewöhnlicher Bedeutung ist, Möglichkeiten zur exakten quantitativen Erfassung der Triglyceridkonzentratxonen zur Lebensverlängerung und Lebensverbesserung, wie oben bereits erwähnt, aufzuzeigen. Studien im Hinblick auf die Bestätigung des Zusammenhangs der Hypertriglyceridaemie in der Pathogenese der Kranzarterienerkrankungen haben das in dieser Richtung vorhandene Bedürfnis gestärkt.

Für Triglyceride, die Glieder einer allgemeinen Klasse von Verbindungen, als Lipide oder Fette (andere Hauptbestandteile dieser Klasse von Verbindungen sind Phospholipide, Cholesterin und Cholesterinester) bekannt, darstellen, sind

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verschiedene Untersuchungsmethoden vorgeschlagen und während vieler Jahre erprobt worden.

Die jüngsten Versuche zur zahlenmäßigen Erfassung der zirkulierenden Triglyceride umfassen Techniken, die indirekter Natur sind, und Messungen der gesamten Klasse der Lipide einschließen, was mit den technologischen Schwierigkeiten der tatsächlichen Triglycerid-Bestimmungen zusammenhängt. Bei dem indirekten Verfahren wird die Menge an Gesamtlipiden gravimetrisch (wobei diese gravimetrische Bestimmung selbst keine sehr genaue Bestimmungsmethode darstellt) durch Extraktion des Serums mit organischen Lösungsmitteln,Verdampfen des Lösungsmittels und Wiegen der Menge des extrahierten Lipids bestimmt. Dieses extrahierte Lipoid enthält zusätzlich zu den Triglyceriden Cholesterin, Cholesterinester und Phospholipide.

Im Anschluß an das oben bezeichnete Vorgehen wird der Analytiker versuchen, so gut es möglich ist, nach anderen Verfahren den Gehalt des Serums an Phospholipiden, Cholesterin und Cholesterinestern zu ermitteln.

Der Triglyceridgehalt wird dann durch Subtraktion des derartig aufgefundenen Gewichts der Phospholipide, des Cholesterins und der Cholesterinester von dem relativ ungenau bestimmten Gewicht des gemessenen Gesamtlipids ent-

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sprechend der nachfolgend wiedergegebenen Formeln ermittelt:

Triglycerid = Gesamtlipide - (Phospholipide + Cholesterin + 1,67 Cholesterinester),

wobei der Zahlenwert 1,67 einen Faktor darstellt, der auf dem durchschnittlichen Molekulargewicht des Cholesterinesters basiert.Des weiteren gibt es jedoch noch mehrere Hauptnachteile bei dem Verfahren zur Bestimmung des Triglyceridgehalts auf indirektem Wege.

So war es bei der Bestimmung eines einzelnen Bestandteils, nämlich der Triglyceride, erforderlich, mindestens vier getrennte Analysen durchzuführen, die mögliche begleitende Meßfehler einschließen. Die Größenordnung aller Meßfehler der jeweiligen Bestimmungen wird gesteigert oder führt zumindest zu üngenauigkeiten bei der Ermittlung des Triglyceridgehalts. In einer normalen Situation stellen die Triglyceride zusätzlich lediglich ein Zehntel bis ein Fünftel des gesamten Lipidgehalts dar. Daher wird, da der tatsächliche Triglyceridgehalt kleiner wird, die Genauigkeit der Bestimmung extrem schlecht, wenn nicht gar nutzlos oder gefährlich illusorisch. Die Verwendung eines Faktors, wie desjenigen von 1,67 als Faktor für die Cholesterinester, basierte auf der Annahme, daß der Fettsäuregehalt der Cholesterinester bei einzelnen Seren

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konstant bleibt, was jedoch, was später noch gezeigt werden wird, nicht für sämtliche Personen Gültigkeit hat. Selbst bei der Bestimmung der Gesamtlipide werden häufig andere Bestandteile nicht-lipiden Typs in das organische Lösungsmittel extrahiert, was somit zu einer überbestimmung der gesamten Lipide und folglich auch zu der der Triglyceride führt.

Spätere Auffassungen über Triglyceridtests befassen sich . zentral mit der Bestimmung des Glycerins, das das Ergebnis einer Hydrolyse oder Verseifung von Triglyceridmolekülen darstellt. Hierbei handelt es sich um die sog. hydrolytischen Techniken, die hier noch abgehandelt werden.

Viele hydrolytische Verfahren und Modifikationen derselben wurden jahrelang erprobt. Im allgemeinen sind jedoch die hydrolytischen Verfahren zeitaufwendig und mehrstufig durchzuführen. Zunächst wird dabei die Extraktion der Lipide aus dem Serum mit einem organischen Lösungsmittel durchgeführt. Die nächste Stufe dieser Verfahren besteht darin, die Phospho lip ide und andere störende Substanzen aus der Lösungsmittelphase zu entfernen, da sie sonst zu fehlerhaften Ergebnissen infolge falsch erhöhter nachfolgender Anteile bei der Bestimmung führen. Nach dem Entfernen der Phosphcr lipide und anderer eventuell störender Substanzen werden die Triglyceride entweder einer Verseifung unter alkalischen Bedingungen oder einer Umesterung unterzogen.

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Das endgültig nach den beiden Verfahren anfallende Produkt stellt das Ergebnis der Freisetzung eines Mols. Glycerin aus einem Mol Triglycerid, das im System vorlag, dar. Das derartig freigesetzte Glycerin wird dann nach einer Vielzahl von Farbreaktionen erfaßt. Darauf wird,ausgehend von der Glycerinbestimmung, direkt der Triglyceridgehalt der ursprünglichen Probe bestimmt.

Eine der frühesten Ausgestaltungen der hydrolytischen Verfahren ist das nach G. Büx (Biochem. Z. 305:145, 1940), wonach das Glycerin der Triglyceride und der Phospholipide mit Jodwasserstoffsäure umgesetzt wird, · um Isopropyljodid zu bilden. Das erhaltene Jodidprodukt wird dann quantitativ durch Titration bestimmt und daraus die Menge des Glycerins berechnet. Das bei diesem Verfahren offensichtlich auftretende Problem besteht darin, daß es deshalb relativ unspezifisch ist, weil die Phospho lip ide, wie auch die Triglyceride, hydrolysiert werden, so daß erstere unrichtig als zusätzliche Triglyceride erfaßt werden.

Einige Jahre später versuchteE. Van Handel und D.B. Zilversmit (J. Lab. and Clin. Med., 50:152, 1957) eine Variation, wonach Serumlipide mittels einer Mischung aus Chloroform und Methanol extrahiert werden und die Phospholipide unter Verwendung eines Zeoliths(Doucil) aus dem organischen Lösungsmittel entfernt werden. Die in dem Lösungsmittel verbleiben-

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denTriglyceride werden dann hydrolysiert und das freigesetzte Glycerin entsprechend der Verfahrensweise von M. Lambert und A.O. Neish (Can. J. Research, 28B:83, 1950) zu Formaldehyd oxidiert. Der derartig gebildete Formaldehyd wird dann mit der Chromotropsäure umgesetzt, um ein violettes Chromophor zu bilden, das dann spektralphotometrisch quantitativ erfaßt wird.

Carlson und Wadstrom (Clin. Chem. Acta., 4:197, 1959) erprobten ein hydrolytisches Verfahren, das demjenigen von Van Handel und Zilversmit ähnlich ist/ jedoch mit der Ausnahme, daß Kieselsäure zur Entfernung der Phospholipide zur Anwendung kommt. Zusätzlich ist bei diesem Verfahren ein besonderer Extraktionsschritt zu vollziehen, um die Fettsäuren aus der organischen Phase zu entfernen.

Dieses Verfahren, wie auch die hydrolytischen Verfahren allgemein, ist ziemlich kompliziert und zeitaufwendig und erfordert im wesentlichen die nachfolgend wiedergegebenen

Stufen: Extraktion des Serums mit Methanol und Chloroform; Kochen, Inkubation über Nacht und Eindampfen des Chloroformextrakts auf ein Volumen von etwa 2 Milliliter,' wonach der Chloroformextrakt einer chromatographischen Behandlung unter Einsatz von Kieselsäure unterzogen wird. Das Chloroformeluat, das die Triglyceride enthält, wird dann eingedampft und der Rest mit Äthanol und Kaliumhydroxid wieder aufbe-

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reitet. Danach wird 30 Minuten naheam Siedepunkt erhitzt, um die vorliegenden Triglyceride zu verseifen. Die Mischung wird dann mittels eines Anteils eines Petroleumäthers zur Entfernung der Fettsäuren extrahiert. Dann wird das Glycerin mit Schwefelsäure extrahiert und mittels Natriumperjodat zum Formaldehyd oxidiert. Der Überschuß an Perjodat wird dann durch Zugabe von Natriumarsenit zers.tört. Der Formaldehyd wird dann mit Chromotropsäure zur Umsetzung gebracht, um ein violettes Chromphor zu bilden, das spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 570 nm vermessen wird.

Obwohl nachfolgende Modifikationen der oben erörterten Methodenlehren diese Verfahren etwas verkürzt oder verbessert haben, verhinderten dennoch die extrem lange Untersuchungsdauer und das außergewöhnlich hohe Maß an technologischer Schwierigkeit die erforderliche Ausnutzung bei den Analysen von großen Bevölkerungsteilen. Lediglich einige wenige Proben konnten zu einer Zeit behandelt werden, was auf den lästigen Einsatz von Glasgeräten und Laborvorrichtungen und auch darauf zurückgeht, daß technische Probleme bestehen,um die Probenintegrität infolge der großen Anzahl von Übertragungsstufen bei den Verfahren beizubehalten.

Zusätzlich erfordern diese Verfahren den Einsatz zahlreicher unbeständiger oder ätzender Reagenzien und schließen das Eindampfen eventuell explosiver organischer Lösungsmittel.

Somit bedeuten diese Verfahren für den damit befaßten

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Analytiker das Risiko einer wesentlichen Körperverletzung. Der extreme Laboraufwand und die damit verbundenen besonders hohen Kosten dieser Bestimmungsverfahren stellen natürlich einen weiteren Nachteil dar und verhindern bzw. verhinderten ihre weitere Verbreitung als klinischer Routinetest.

Aufgrund weitergehender Versuche schlugen H.B. Lofland, Jr. (Anal. Biochem. 9:393, 1964) zur Beschleunigung des Verfahrensablaufes und zur Verminderung des Ausmaßes der damit verbundenen technologischen Schwierigkeiten ein hydrolytisches Verfahren zur Bestimmung der Triglyceride vor, bei dem der letzte Abschnitt der Bestimmung automatisiert durchgeführt wird. Die Serumlipide werden zuerst mittels Isopropanol extrahiert und die Phospholipide durch Behandlung mit Zeolithen entfernt. Die Extrakte werden dann unter Anwendung von Alkalien verseift. Dann wird die Reaktion des Glycerids mit Perjodat durchgeführt, um Formaldehyd zu bilden. Die nachfolgende Bestimmung des Formaldehyds erfolgt mit Chromotropsäure, was mittels automatischer Einrichtungen geschehen kann.

Später schlugen G. Kessler und H. Lederer (Automation in Analytical Chemistry, herausgegeben von Skeggs, L.T., New Jersey, Mediad, Seite 341, 1965) eine Modifizierung des Lofland-Verfahrens vor, wonach das Serum mit Isopropanol extrahiert und die Phospholipide mittels eines Zeolithe entfernt werden. Bei diesem Verfahren werden die nachfolgende

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Verseifung, die Oxidation zum Formaldehyd und die colorimetrische Bestimmung des Formaldehyds sämtlich anhand automatischer Einrichtungen durchgeführt. Kessler und Lederer fanden jedoch, daß beträchtliche Mengen an Glukose in die organische Phase während des Extraktionsprozesses überführt werden können, so daß, wenn sich eine Behandlung mit Perjodat anschließt, nicht zutreffende positive Reaktionen erhalten werden.

Um dieses Problem zu beheben, wird der Zeolithmit kleinen Anteilen an Kupfersulfat und Calciumhydroxid kombiniert, um die vorhandene Glukose abzubauen. Außerdem wird der Formaldehyd durch die Reaktion mit einem ß-Diketon und einem Amin erfaßt, um eine Verbindung des Litidin-Typs zu bilden, die dann nach einer Fluoreszenztechnik bestimmt wird.

Obwohl die dargelegte Technik einige Vorteile bei dem Triglyceridtest zeigt, sind mit ihr dennoch schwerwiegende Nachteile verbunden. Als Beispiele seien genannt: Es sind mehrere unbeständige und ätzende Reagenzien erforderlich. Die Probe muß manuell extrahiert werden. Störende Phospholipide müssen manuell vor der automatischen Phase der Bestimmungsmethode entfernt werden. Zusätzlich erfordert die automatische Testeinrichtung eine beträchtliche Aufbauzeit und einen beachtlichen Aufwand bei der Wartung. Obwohl

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die Autoren eine gute Korrelation zu den manuellen Verfahren vorgaben, wurde von anderer Seite später gefunden, daß Seren, die die Erscheinung der Hypertriglyceridaemie zeigen, offensichtlich falsch beurteilte Ergebnisse liefern, wenn mit den gleichen Seren verglichen wird, die aufgrund eines manuellen Verfahrens erfaßt werden (vergl. Claude, J.R., Corre, F., und Levallois, C: Clin. Chem. Acta. 19:231 (1968)). Letztere Forscher vermuteten, daß eine bessere Korrelation erhalten werden kann, indem nicht-verseifte reine Bestimmungsmedien verwendet werden, um die beobachteten Testergebnisse zu korrigieren. Jedoch verlangt diese Modifikation etwa das Doppelte an Kosten bei der Bestimmung. Des weiteren setzt sie die Analysengeschwindigkeit herab.

In Kenntnis der Schwierigkeiten dieser bekannten Verfahren und mit der Absicht, den Bestimmungsverfahren Spezifität zu verleihen und die Anwendung von ätzenden Reagenzien möglichst einzuschränken,wurde von anderer Seite (Eggstein, M. und Kreutz, F.H., Klin. Wochenschr., Band 44:262, 1966) versucht, Glycerin enzymatisch zu messen. Diese Verfahren erfassen grundsätzlich die direkte Verseifung des Serums, das die Triglyceride enthält, mittels Alkalien in Alkohol bei erhöhten Temperaturen, Neutralisation mit Magnesiumsulfat und anschließende Bestimmung des freien Glyceringehalts in der alkoholischen Lösung entsprechend der folgen-

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den Reaktionsfolge:

Glycerinkinase

1 . Glycerin + ATP

Glycerinphosphat + ADP

Pyruvat-

2. ADP + Phosphoenolpyruvat ► ATP

kinase + Pyruvat

Lactat-

3. Pyruvat + NADH ► Lactat + NAD

A dehydrogenase J^

( absorbiert (farblos

bei 340 nm) bei 340 nm)

Um den tatsächlichen Sachverhalt deutlich darzustellen, sei darauf hingewiesen, daß pro jedes Molekül Triglycerid ein Molekül Glycerin im Verlaufe der Verseifung gebildet wird, wobei jedes Molekül Glycerin wiederum der Reaktionsfolge unterliegt und ein Molekül NADH zu NAD mit dem ent- sprechenden Verlust an Absorptionsvermögen umgesetzt wird, wenn mittels eines Spektralphotometers bei 340 nm vermessen wird.

Obwohl diese Verfahren gegenüber den colorimetrischen Bestimmungen des Glycerins einige Vorteile zeigen, verlangen sie dennoch, daß das manuelle Verseifungsverfahren in einem getrennten Rohr bei der Glycerinbestimmung durchgeführt wird. Zusätzlich sind diese Verfahren deswegen zeitaufwendig, weil

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ein Leerversuch. ( der die Gegenwart der Glycerinkinase in der Reaktionsfolge eliminiert) bei jeder einzelnen Probe durchgeführt werden muß , um die Effekte der die Reaktionsfolge störenden Substanzen, wie das Enzym Alkaliphosphotase, auszuschalten. Dieses Enzym stellt einen üblichen Bestandteil des Serums dar und kann im Hinblick auf die verschiedenen Patienten starken Schwankungen unterliegen. Es zeigt den Effekt der Katalysierung der Umsetzung des ATP zum ADP. Dieses würde wiederum dazu führen, daß das Phosphoenolpyruvat zum Pyruvat usw. umgesetzt wird , was zu einer Überbewertung des Glycerins führt.

Ein weiterer Nachteiledes oben beschriebenen Vorgehens ist darin zu sehen, daß der aus dem Leerversuch sich ergebende, notwendige Faktor die Zeit ansteigen läßt, die zur Durchführung des Verfahrens erforderlich ist, und zudem nahezu eine Verdoppelung des erforderlichen Aufwandes für ein bereits teueres Reagenzsystem aufwerfen würde.

Die oben aufgezeigten Nachteile sind und waren der Fachwelt bekannt, so daß fortlaufend Abweichungen und Variationen der Bestimmungsmethode der Triglyceride vorgeschlagen wurden. Bucolo und David glaubten, daß die enzymatische Bestimmung der Triglyceride vereinfacht wird, indem der alkalische Hydrolyseschritt, der bisher angewandt wurde, durch eine

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enzymatische Hydrolyse ersetzt wird. Diese Autoren erreichen ihr Ziel dadurch, daß sie sowohl eine Lipase als auch eine Protease verwenden (vergl. Bucolo, G. und David, H.: Clin. Chem., 19:476 (1973) und Bucolo's U.S.-Patent 3 703 591).

Der von Bucolo und David beschriebene Versuch muß nicht nur als eine wesentliche Abweichung von dem bisherigen Vorgehen, sondern in der Tat als ein großer Schritt vorwärts angesehen werden, da zum erstenmal die vollständige Triglyceridbestimmung in einem einzigen Reaktionsbehälter durchgeführt werden konnte, was eine starke Vereinfachung des Bestimmungsverfahrens zur Folge hat.Des weiteren wird nach diesem Verfahren erreicht, daß eventuelle Störungen durch Phospholipide ausgeschlossen werden, da sich das Enzym Lipase für Fettsäureester des Glycerins als spezifisch erweist.

Obwohl das bevorzugte Verfahren von Bucolo und David in dem technischen Bereich der Triglyceridtests einen Fortschritt bedeutet, so zeigt es dennoch deswegen Nachteile, weil es die spektrophotometrische Beobachtung von NADH und die Umsetzung zu NAD und den begleitenden Verlust an optischer Dichte bei 340 nm verlangt.

Ein erstes Problem dieses Verfahrens besteht.darin, daß das System den Farbverlust mißt. Somit wird bei einer Probe,

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die keine Triglyceride enthält, eine sehr große Zahl von spektralphotometrischen Absorptionsbanden erhalten, die richtig aufzeigen, daß das NADH, das bei 340 nm absorbiert, dennoch vorliegt. Bei Proben mit niedrigem Gehalt an Triglycerid ist der Farbverlust sehr klein. Daher ist diese Bestimmung bei niedriger Konzentration ungenau, was von der Art der Fehlerquelle abhängt, die gewöhnlich mit der Berechnung in Zusammenhang steht, die von der Differenz sehr großer Zahlen abhängt. Diese Schwierigkeit zeigt schließlich den Mangel der Genauigkeit oder mangelhafte Reproduzierbarkeit bei niedrigen Konzentrationen.

Ein zweites Problem, das diesen Systemen innewohnt, die das NADH-System bei 340 nm vermessen, liegt darin, was gut bekannt ist,daß die Lipaemie (Fettanreicherung im Blut) in größerem Ausmaß bei kleinerer Wellenlänge, wie 340 nm, und im Gegensatz zum Beispiel bei Messungen bei 600 bis 700 nm stört. Diese Störungen führen zu verstärkten Absorptionsablesungen und verstärken die oben erwähnten, im Zusammenhang mit der Ungenauigkeit stehenden Probleme.

Das dritte Problem, das sich bei diesem Systemtyp stellt, liegt im Chromophor selbst, der verhältnismäßig unempfindlich ist, d.h. jede Zwischenumsetzung von NADH/NAD erzeugt einen kleineren Absorptionswechsel, was dazu führt, daß der Analytiker im Hinblick auf seine Möglichkeiten zur Be-

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Stimmung der Konzentrationsdifferenzen auf die Genauigkeit seines Spektrometers eingeschränkt ist. Dieses steht im Gegensatz zur Verwendung eines Chromophors hoher Empfindlichkeit, wobei er in gleichem Ausmaß an spektralphotometrischer Genauigkeit selbst kleinere und damit stärker exakt definierte Konzentrationsdifferenzen zum Ausdruck bringt.

Des weiteren ist zu dem besonderen Vorschlag von Bucolo und David auf einen anderen Nachteil hinzuweisen, der darin besteht, daß ihr System in Abhängigkeit von der Art der Störung durch das Enzym Alkaliphosphotase anfällig ist, worin es in dem vorstehend erwähnten Vorgehen im Hinblick auf die enzymatische Bestimmung von Glycerin ähnlich ist.

Dem bekannten Verfahren von Bucolo und David, dessen Nachteile vorstehend aufgezeigt wurden, liegt die folgende Reaktionsfolge zugrunde:

Lipase

Triglyceride ^ Glycerin + Fettsäuren

Protease

Glycerin-Glycerin + ATP )> Glycerin-1-phosphat

kinase

+ ADP

Pyruvat-

ADP + Phosphoenolpyruvat ^ Pyruvat

kinase +

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Lactat-

Pyruvat + NADH ► Lactat + NAD

dehydrogenase

Die Erfindung bezweckt die Verbesserung des eingangs beschriebenen Verfahrens und zielt insbesondere darauf ab, daß eine vollständig enzyxnathische Bestimmung der Triglyceride ohne die Verwendung einer Protease möglich wird.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei das auf eine Hydrolyse der Triglyceride zurückgehende Glycerin enzymatisch mit einem NAD/NADH-System (Nikotinamidadenindinucleotid / reduziertes Nikotinamidadenindinucleotid) gekoppelt wird, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß Eisen mit dem NADH des NAD/NADH-Systems umgesetzt und der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens zur quantitativen Erfassung des Gehalts an Triglyceriden herangezogen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich, da es vollständig enzymatisch abläuft, dadurch aus, daß es

schnell und in einem einzelnen Rohr durchgeführt werden kann, um dadurch große Vorteile zu erzielen, indem eine große Zahl von Bestimmungen von einem einzigen Techniker in einer vernünftigen Zeitspanne durchgeführt werden kann.

Zusätzlich wird das erfindungsgemäße Verfahren nicht durch

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übliche Störungsquellen bei den Triglyceridbestimmungen beeinträchtigt, wie durch diejenigen, die gewöhnlich durch Phospholipide und Glukose auftreten. Der Ausschluß von Phospholipiden wird durch die Verwendung des Enzyms Lipase erreicht, das für Triester von Glycerin starke Spezifität zeigt. Glukose stellt keine Störungsquelle dar, was auf die milden Reaktionsbedingungen, die bei dem Bestimmungssystem gewählt werden, zurückgeht.

Des weiteren erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nicht den Einsatz teurer Instrumente oder einer teuren Einrichtung, mit denen Messungen im UV-Bereich zur Vervollständigung der Bestimmung durchführbar sind.

Des weiteren ermöglicht es die vorliegende Erfindung erstmals, Triglyceride mit genauer Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit zu bestimmen, was sich im Hinblick auf die Verbesserung der Gesundheit und gar auf das Retten von Leben vorteilhaft auswirkt. Dabei handelt es sich um Ziele, die zwar auch nach den bekannten Verfahren angestrebt wurden, jedoch nie erreicht wurden. Obwohl die bekannten Verfahren eine gewisse Anzahl von Nachteilen früherer Bestimmungen behoben, gelang es keinem, erfolgreich andere Nachteile zu vermeiden oder die positiven Gesichtspunkte und Vorteile zu verwirklichen,die der vorliegenden Erfindung zuzuordnen sind.

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In diesem Punkt weicht die vorliegende Erfindung von den bekannten Verfahren ab, bei denen sämtliche Reaktionen in Gegenwart von Eisen durchgeführt werden.

Die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ablaufende Reaktion nutzt eine mit Lipase enzymatisch katalysierte Hydrolyse aus. Das Glycerin, das auf diese Weise freigesetzt wird, wird zu Dihydroxyaceton und NADH entsprechend den nachfolgend wiedergegebenen Reaktionsabläufen, gemäß dem Vorschlag verschiedener Autoren (Epstein et al und Bucolo et al, a.a.O.), umgesetzt:

Glycerin-Glycerin + ATP >· Glycerin-1-phosphat + ADP

kinase

NAD + Glycerin-1-phosphat

Glycerin-phosphatd ehydrogenase

Abkürzungen:

Dihydroxyaceton + NADH

ATP = Adenosintriphosphat; ADP = Adenosindiphosphat; NAD = Nikotinamidadenindinucleotid und NADH = Nikotinamidadenindinucleotid (reduzierte

Form)

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Die vorliegende Erfindung weicht von dem Stand der Technik des weiteren aufgrund der folgenden Reaktionen ab:

(1) NADH ₊ Fe³⁺

(2) Fe²⁺ + 3 AMB-610- ^Fe (AMB-61O)₃

(Absorption bei 610 niti)

Darin bedeuten:

PMS = Phenozin-rnethosulfat und AMB-610 = 9- (2-Pyridyl)-acenaphthofi ,2-eJ-astriazinsulfonat.

Entsprechend dem Konzept der vorliegenden Erfindung können sämtliche genannten Reaktionen innerhalb eines einzelnen Reaktionsbehälters durchgeführt werden.

Die vorstehend wiedergegebenen Reaktionen (1) und (2),die erfindungsgemäß zusätzlich zu verwirklichen sind, führen zu dem besonders vorteilhaften und sehr angestrebten Effekt der starken Anhebung der Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode, und vermindern auch die Störungen, die normalerweise auftreten, wenn auf Blutfett zu untersuchende Proben analysiert werden sollen. Diese stark erhöhte Empfindlichkeit geht auf das weitaus größere Absorptionsvermögen des Eisen/Chromophor-

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Komplexes gegenüber NADH zurück.

Der Anstieg der Empfindlichkeit ist etwa sechsmal so groß im Vergleich zu der zitierten Alternative von Bucolo und David.

Da das anfallende Eisenchromophor einen Absorptionspeak bei 610 nm zeigt, wird die Störung bei"lipemischen" Proben gegenüber jenen Methoden stark reduziert, die eine Messung bei niedrigeren Wellenlängen, wie 340 nm, erfordern.

Dieser außergewöhnliche Vorteil des sechsfachen Anstiegs der Empfindlichkeit, der aufgrund der zusätzlichen Reaktionsschritte unter Heranziehung von Eisenionen erreicht wird, ist so groß, daß bei der Beurteilung der Natur und der Vorzüge der Erfindung bei rückschauender Betrachtung die Frage einen nützlichen Gesichtspunkt darstellen kann, wieso die Erfindung sowohl aufgrund der Vorschläge von Bucolo und David als auch der anderen bekannten Vorschläge nicht nahe-]ag, weil insbesondere auf dem medizinischen Gebiet in vielerlei Hinsicht sehr aktiv unter großem Aufwand Forschung und Entwicklung mit unvergleichlich großem kommerziellen Interesse betrieben wird, insbesondere auch im Hinblick auf die Tatsache, daß die Verwendung von Eisen im Redoxzustand bekannt war und in der Vergangenheit zur Verbesserung der quantitativen Bestimmung verschiedener Analysen ausgenutzt wurde.

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Nach alledem bestand ein starkes Bedürfnis nach einer besseren Bestimmungsmethode für Triglyceride. Es gab verschiedene bekannte Vorschläge, nach denen NADH als Reaktionsprodukt gebildet wird, wobei dieses NADH als meßbar bekannt war.

Dennoch war man trotz vielfältiger Bemühungen nicht auf die Erfindung gestoßen,noch hatte man die bekannten Verfahren so abgewandelt, daß man zu erfindungsgemäß wesentlichen Maßnahmender Eisenreduktion in einer Reaktion mit NADH und der Verwendung eines Eisenchromophors gelangte, wobei dieses Vorgehen insofern vorteilhaft ist,weil es die Beobachtung und Ausmessung einer angestrebten hohen Wellenlänge ermöglicht.

Wenn eine derartige rückschauende Betrachtung angestellt wurde, so ist hervorzuheben, daß jeder nachfolgende Schritt bei der Herstellung von NADH, insbesondere ein zusätzlicher Schritt unter Umfassen einer Eisenreaktion mit einem Eisenchromophor, als nicht naheliegend angesehen würde, sondern ganz im Gegenteil wäre ein solches Abweichen sehr stark als widersprüchlich angesehen worden. Das läßt sich auf die bereits vor langem berichtete und weitbekannte Tatsache zurückführen, daß Eisen (III)-Ionen im allgemeinen einen inhibierenden Effekt auf die katalytische Wirksamkeit von Enzymen zeigen, was insbesondere für das Enzym Lipase gilt, weshalb davon auszugehen war, daß seine mögliche Verwendung in einem Bestimmungs-

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system ausgeschlossen ist, das mittels Lipase aktiviert wird (Laboreur, P. und Laborousse, M., Bull. Soc. Chem. Biol. 48:747, 1966). Die vorliegende Erfindung überwindet das aufgezeigte Vorurteil aufgrund des genannten inhibierenden Effekts und gestattet die Anwendung einer einzigartigen Kupplungsreaktion bei einem Bestimmungsverfahren.

Des weiteren gilt für das Verfahren von Bucolo und David, das, im Gegensatz zur Erfindung, die Gegenwart von Protease zur Bewirkung der vollständigen Hydrolyse verlangt, daß die Gegenwart von Eisen in dem Bestimmungsgystem ebenfalls stark im Widerspruch zu der Tatsache stehen würde, daß es gut bekannt ist, daß die Gegenwart von Schwermetallen, wie Eisen, irreversible Inhibierungen der Proteasen im allgemeinen und von Chymotrypsin insbesondere hervorruft (Burgmeyer, H.V-, Methods of Enzymatic Analysis, (New York Academic Press, 1965), Seite 972).

Bei derartig bedeutsamen Einwänden gegen das von der Erfindung vorgeschlagene.Konzept, selbst wenn die vorliegende Erfindung mit dem Verfahren nach Bucolo und David verglichen wird, wobei es sich offensichtlich um den nächstliegenden Stand der Technik im Hinblick auf die Abweichungen gemäß der Erfindung handelt, ist ersichtlich, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um keine nahegelegte Abweichung von dem nächstliegenden Stand der

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Technik handelt. Der Gegensatz zu dem Verfahren von Bucolo und David scheint bei der Betrachtung der Vorzüge und der Vorteile und der Natur der vorliegenden Erfindung bedeutsam.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine aliquote Menge eines Triäthanolaminpuffers, mit einem Gehalt an einem Eisen(II)-Indikator, wie 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho[j/2-e J-as-triazinsulfonat, bei einem pH-Wert von 9,4 in ein Glasfläschchen gegeben, das Lipase, Adenosintriphosphat, Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und Glycerinkinase enthält. Eine Serumprobe, die Triglyceridsenthält, wird dann zu der oben genannten Lösung zusammen mit einer Lösung, die ein Elektronenüberführungsmittel (wie Phenazin-methosulfat, Phenazinmethylsulfat; "metho" = Vorsilbe für eine Ifethylgruppe,die an dem C-Atcm einer Seitenkette oder an einem Ringatom gebunden ist), Nikotinamidadenindinucleotid (oxidiert) und Eisen(III)-Ionen enthält.

Die Mischung wird dann bei einer Temperatur von 37'⁰C einige Zeit einer Inkubation unterzogen und die erhaltene blaue Farbe, die das Triglycerid wiedergibt, dann in einem Spektralphotometer einer Wellenlänge von 610 niu vermessen. Die erhaltene Absorption wird aufgezeichnet und verwendet, um den Triglyceridgehalt der ursprünglichen Probe durch Vergleich mit der Absorption einer Standardlösung von Tri-

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glycerid, die in einer identischen Weise wie die Serumprobe behandelt wurde, zu ermitteln. Das vorstehend ausführlich beschriebene erfindungsgemäße Verfahren bedeutet ersichtlich einen großen Fortschritt im Vergleich zu dem bekannten Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, da es die angewandten Techniken vereinfacht und daher einem größeren Anteil der Bevölkerung einen bedeutenden und für die Vorbeugung entscheidenden Testversuch bereitstellt. Die stärkere Bereitstellung einer zuverlässigen 0 Triglyceridbestimmungsmethode ermöglicht es wiederum, daß viele Personen gesünder, intensiver und langer leben können.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher erläutern.

Beispiel 1

2,0 Milliliter 0,128 m Triäthanolaminpuffer (pH 9,4) mit einem Gehalt an 9- (2-Pyridyl) -acenaphto/_1,2-eJ-as-triazinsulfonat werden in einer Konzentration von 1,6 mmol/1 in ein lyophilisiertes Glasflaschen gegeben, das 18 μπιοί Adenosintriphosphat, 20, 5 μπιοί MgSO., 660 Einheiten Lipase, 3 internationale Einheiten Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (3 I.U.) und 0,29 internationale Einheiten Glycerinkinase enthält. Alle genannten Verbindungen befinden sich in der lyophilisierten Form, um eine maximale Stabilität zu gewähr-■ leisten. _ 31 _

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2!ü dieser Mischung wird eine 20 Mikroliter (0,02 Milliliter) Probe des Serums gegeben, das Triglyceride enthält. Zu dieser Mischung wird dann eine aliquote Menge von 1,5 Milliliternder Lösung gegeben, die 47 Mikromol/1 Phenazinmetbosulfat, 27 mmol/1 Nikotinamidadenindinucleotid (oxidiert) und 0,466 mmol/1 Eisen(III)-Ionen enthält.

Die anfallende Lösung wird dann sorgfältig gemischt und bei einer Temperatur von 37 ⁰C 2O Minuten lang einer Inkubation unterzogen (nach der Zugabe der Lösung, die Phenazinmethosulfat enthält, wird es bevorzugt, daß die Lösung von der Einstrahlung starken Lichts oder Sonnenlichts bewahrt bleibt). Nach Abschluß der 20-minütigen Inkubationsdauer wird die Absorption der Mischung in einem Spektralphotometer bei 610 nm gegen ein Blindreagenz vermessen, das in gleicher Weise wie die serumreaktionsmischung hergestellt wird _t _was jedoch mit der Ausnahme geschieht, daß 20 Mikroliter destilliertes Wasser für die Serumprobe eingesetzt werden.

Der Triglyceridgehalt der Serumprobe wird dann berechnet, indem die gemessene Absorption zu der Absorption, die mittels einer Lösung bekannten Triglyceridgehalts festgestellt wurde und die in der gleichen Weise wie die Serumprobe behandelt wurde, in Vergleich gesetzt wird.

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Unter den oben beschriebenen Bedingungen wird eine lineare Reaktion (d.h. die gemessene Absorption verändert sich direkt mit der Konzentration des Triglycerids in der ursprünglichen Serumprobe) bis zu einer Konzentration von etwa 500 mg/dl Triglycerid beobachtet. Da ein langsamer, jedoch kontinuierlicher Anstieg der Absorption in allen Rohren vorliegt, einschließlich des Rohrs mit dem Blindreagenz, wird es empfohlen, daß der Analytiker zwischen den Testablesungen zur Erzielung optimaler Ergebnisse das Spektrometer mit dem Rohr mit dem Blindreagenz auf Null (re-zero) einstellt. (Eine Einheit der Lipaseaktivität stellt die Menge des Enzyms dar, die 1 μπιοί Fettsäure pro Minute bei einem pH-Wert von 8,9 bei 25 ⁰C freisetzt).

Beispiel 2

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung, die für ein automatisch betriebenes Instrument besser geeignet ist, wird eine 7 Mikroliter Serumprobe in einem Reaktionsbehälter verteilt. In diesen Behälter werden gleichzeitig folgende aliquote Mengen gegeben: 0,5 Milliliter einer aliquoten Menge eines Reagenzes, das 36 mmol/1 Adenosintriphosphat, 40,9 mmol/1 MgSO₄, 1.318.000 Einheiten/1 Lipase, 6.040 internationale Einheiten/1 Glycerin-3-phosphatdehydrogenase und 570 internationale Einheiten/1 Glycerinkinase enthält,

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eine aliquote Menge von 1,5 ml eines Reagenzes, das 47 [imol/l Phenazinmethosulfat, 0,466 mmol/1 Eisen(III)-Ionen und 27,3 mmol Nicotinamidadenindinucleotid (oxidiert) enthält, und eine aliquote Menge von 1,5 ml eines 0,17 molaren Triäthanolpuffers (pH 9,4), der 2,1 mmol/1 9-(2-Pyridyl)-acenaphto-U 12-eJ-as-triazinsulfonat enthält. Die Lösung wird dann gemischt und bei einer Temperatur von 37 ⁰C während etwa 15 Minuten einer Inkubation unterzogen. Die endgültige Absorption der Mischung wird dann spektralphotometrisch bei 610 nm gemessen. Die in der ursprünglichen Probe enthaltene Menge an Triglycerin wird wie im Beispiel 1 berechnet. Unter diesen Bedingungen wird eine lineare Absorptionsreaktion in den Serumproben, die bis zu 1.000 mg/dl Triglyceride enthalten, demonstriert.

Beispiel 3

Dieses Beispiel wird wie das Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch die Ausnahme erfolgt, daß 1,6 mmol/1 Bathophenanthrolinsulfat für 1,6 mmol/1 9-(2-Pyridyl)-acenaphthojH ,2-eJ-astriazinsulfonat eingesetzt wird.

Beispiel 4

Dieses Beispiel wird wie das Beispiel 1 mit der Ausnahme durchgeführt, daß 1,6 mmol/1 Ferrozine für 1,6 mmol/1

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9-(2-Pyridyl)-acenaphtho/j, 2-eJ-as-triazinsulfonat eingesetzt werden(Perrozine stellt den Handelsnamen der Hach Chemical Co., of Amex, Iowa dar). Wie in Aldridge Catalog - Handbook of Organic and Biochemicals, Seite 385 (1977-8) ausgewiesen wird, ist ihm die folgende Benennung zuzuschreiben: Dinatriumsalz der 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazin-p,p'-disulfonsäure in Form des Trihydrats).

(Ähnlich wie bei den Ausgestaltungen des Beispiels 3 und 4 kann der Eisenchelatbildner (iron chelator) (wie Bathophenanthrolinsulfonat und Ferrozine) auf äquimolarer Grundlage für das im Beispiel 2 genannte 9-(2-Pyridyl)-acenaphthol j_1, 2-e"]-as-triazinsulfonat, wie im Beispiel 2 angeführt, gesetzt werden).

Anhand der gegebenen Lehre wird es dem Fachmann ohne weiteres möglich sein, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen, diese vielfältig zu modifizieren. Zum Beispiel kann die genaue Anzahl der Einheiten der Lipase bei begleitendem Anstieg der Inkubationszeit herabgesetzt werden, um die vollständige Hydrolyse zu bewirken.

Ähnlich kann die genaue Zusammensetzung des Puffers, der in den erwähnten Bestimmungssystemen optimiert worden ist, geringfügig und in Abhängigkeit vom Typ und dem angestrebten pH-Wert ohne schwerwiegende Beeinträchtigungen des Bestimmungssystems modifiziert werden.

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Claims

PATENTANWÄLTE "°

Dostouchesstraße 60 · Postfach 400745 ■ 8000München 40- telefon 089/304071* -Telex 5-216136 hagc d ·Tflof-Mnim li.i^cypatcnl ■ Telekopiercr 089/504071

American Monitor Corporation, München, den

Inianapolis, Indiana, V.St.A. 30. Oktober 1978

u.Z.: Pat 46/3-78Ch Dr.H/3/st

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRIGLYCERIDEN

Patentansprüche

1 Λ Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden, wobei las auf eine Hydrolyse der Triglyceride zurückgehende Glycerin enzymatisch mit einem NAD/NADH-System (System Nikotinamidadenindinucleotid/reduziertes Nikotinamidadenindinucleotide) gekoppelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß Eisen mit dem NADH des NAD/NADH-Systems umgesetzt und der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens zur quantitativen Erfassung des Gehalts an Triglyceriden herangezogen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eisen in der Reaktionsmischung des NAD/NADH-Systems enthalten ist.
3. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Bioflüssigkeiten durch enzymatische Hydrolyse der Triglyceride unter dem Einfluß von Lipase, durch Umsetzen des auf diese Weise gebildeten Produkts zu Glycerin-1-phosphat mittels Adenosin-triphosphat (ATP) und des Enzyms Glycerinkinase (GK) und durch Umsetzung des Glycerin-1-phosphate zu Dihydroxyacetonphosphat unter Vernwendung des Enzyms Glycerin-phosphatdehydrogenase (GPDH) bei gleichzeitiger Reduktion des Nikotinamidadenindinucleotids (NAD) zur reduzierten Form NADH, dadurch gekennzeichnet, daß das derartig gebildete NADH mit

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- 2 -ORIGINAL INSPECTED

sich in der oxidierten Form (Fe(III)) befindende Eisen zur Bildung reduzierten (Fe(II)) Eisens umgesetzt, die Reaktion durch ein Elektronenüberführungsmittel vermittelt und das reduzierte Eisen mit einem Eisenchelatbildner umgesetzt wird, um ein Chromophor starker Intensität.zu bilden, und danach die in der Bioflüssigkeit vorhandene Menge an Triglycerid durch Messen der Chromophormenge quantitativ erfaßt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, 0 daß als Elektronenüberführungsmittel Phenazin-methosulfat' eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner 9-(2-Pyridyl)-acenaphthoD / 2-e] -as-triazinsulfonat eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner Bathophenanthrolinsulfonat eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner das Dinatriumsalz der 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1 ^^-triazin-pip' in der Trihydratform eingesetzt wird.
8. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Bioflüssigkeiten, in denen die Triglyceride enzymatisch unter Verwendung des Enzyms"Lipase hydrolysiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß Eisen und Lipase in der gleichen Reaktionsmischung eingebracht werden und anschließend der Wechsel der Oxidationsstufe des Eisens bei der quantitativen Erfassung des Gehalts der Triglyceride herangezogen wird.

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9. Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden in Bioflüssigkeiten, wobei die jeweilige Probe einer Umsetzung unterzogen wird, um die reduzierte Form des Nikotinamidadenindinucleotids (NADH) als Reaktionsprodukt zu bilden, und die derartig gebildete Menge des NADH ein Maß für die ursprünglich in der Probe enthaltenen Triglyceride darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß das NADH mit sich in der oxidierten Form (Fe(III)) befindenden Eisen zur Bildung reduzierten (Fe(II)) Eisens umgesetzt, die Reaktion durch ein Elektronenüberführungsmittel vermittelt und das reduzierte Eisen mit einem Eisenchelatbildner umgesetzt wird, um ein Chromophor starker Intensität zu bilden, und danach die in der Bioflüssigkeit vorhandene Menge an Triglyceriden durch Messen der Chromophormenge quantitativ erfaßt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektronenüberführungsmittel Phenazinmethosulfat eingesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho [i , 2-e"]-as-triazinsulfonat eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner Bathophenanthrolinsulfonat eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Eisenchelatbildner das Dinatriumsalz der 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazin-p,p'-disulfonsäure in der Trihydratform eingesetzt wird.

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