DE3905784A1

DE3905784A1 - Verfahren zum messen der natriumkonzentration eines biologischen fluessigen mediums

Info

Publication number: DE3905784A1
Application number: DE3905784A
Authority: DE
Inventors: Gary D Steinman
Original assignee: David Diagnostics Inc
Current assignee: David Diagnostics Inc
Priority date: 1986-07-14
Filing date: 1989-02-24
Publication date: 1990-08-30
Also published as: US4812400A

Description

Die Erfindung betrifft ein chemisches Verfahren zum Bestim men von Natrium in biologischen flüssigen Medien, wie Urin oder Blut. Insbesondere betrifft sie eine Enzymreaktion, die in einer spezifischen quantitativen Weise durch Natrium akti viert wird.

Die Wichtigkeit der genauen Messung von Natrium ist in der Medizin bekannt. Natrium hält das innere Wassergleichgewicht des Körpers aufrecht und ist für eine richtige Muskelkonzen tration und Nervenleitung wesentlich. Die Nieren sind das primäre Organ zur Regelung der Natriummenge. Erhebliche Ab weichungen werden häufig bei Entwässerungen durch Fieber, Diarrhoe, Brechen und extremer Hitzebelastung beobachtet. Hormonstörun gen, Nieren- und Herzkrankheiten und hoher Blutdruck werden alle durch den Natriumgehalt im Blut beeinflußt und wirken ihrerseits wieder auf diese Zustände. Ein Test auf Natrium wird häufig angeordnet, um Patienten mit Bluthochdruck, die mit Diuretika behandelt werden sollen, zu untersuchen.

Die heute am weitesten verbreitete Technik zum Messen von Natrium in biologischen flüssigen Medien sind die Emissions- Flammenphotometrie, die Atomabsorptionsspektrophotometrie und die ionen-selektive Elektrodenpotentiometrie. Diese Ver fahren erfordern ausgeklügelte analytische Apparate, genaue Handhabung und technisches Expertenwissen. Ein kritischer Bedarf besteht für eine einfache, genaue und preiswerte Me thode, die zur Verwendung in der Arztpraxis oder sogar zu Hause beim Patienten geeignet ist, um spezifisch Natriummengen in biologischen Systemen zu bestimmen.

Dementsprechend ist Ziel der Erfindung die Schaffung eines genauen aber preiswerten Verfahrens zur Bestimmung von Natriummengen in biologischen flüssigen Medien. Eine Erfin dung zur Schaffung eines derartigen Verfahrens sollte in einer Papierphase durchgeführt werden, die besonders öko nomisch ist, da die Verwendung kleiner Mengen vorher abge messener Reagentien möglich ist, sowie auch ein Bestimmungs verfahren in Lösung. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, das leicht an eine vorhandene und weithin verfügbare Instrumentierung anpaßbar ist, wodurch ein wirtschaftlicher und zweckmäßiger Gebrauch gewährleistet wird.

Bestimmte der genannten und damit verbundenen Ziele werden bereits erreicht durch Verwendung der Natriumabhängigkeit von Adenosin-triphosphatase (EC 3.6.1.3). Während die Chemie dieses Enzym bekannt ist, wurde anscheinend bisher kein Ver such gemacht, dessen Natriumstimulierung in einer quantitati ven analytischen Weise nutzbar zu machen, ganz abgesehen von der Verwendung dieser Eigenschaft zur Messung von Natrium mengen in biologischen Systemen. (J.C. Skou, Biochim. Biophy. Acta, 23, 394 (1957)). Es war bisher allgemeine Praxis von Biochemikern, einen Überschuß von Natrium solchen Systemen zuzufügen, die dafür ausgelegt und bestimmt sind, Adenosin- Triphosphatase aus verschiedenen Quellen zu bestimmen und nutzbar zu machen. (z. B. L. Josephson. and L.C. Cantley, Bio chem., 16, 4572 (1977)). Somit führt der Stand der Technik, soweit er die Verwendung sättigender Mengen von Natrium be trifft, von der Methode gemäß der Erfindung fort. Weiterhin wurde in den 30 Jahren nach den ursprünglichen Beobachtungen offensichtlich kein Versuch mehr gemacht, ein derartiges Prin zip zur quantitativen Bestimmung von Natrium in biologischen Systemen zu machen. (N.W. Tietz, ed., "Textbook of Clinical Chemistry", W.B. Saunders, Philadelphia, 1986, S. 1174) Adenosintriphosphatase (ATPase) spaltet das endständige Phos phar von Adenosin-5′-triphosphat (ATP) ab und ergibt Adeno sindiphosphat (ADP) und organisches Phosphat (Pi):

Die Phosphatase-Aktivität ist am größten zwischen pH 7,2 und 8,0 mit Enzymen aus verschiedenen Quellen. Das Gleichgewicht der hydrolytischen Reaktion unter Verwendung dieses Enzyms wird gegen die beiden Produkte in Gegenwart von Magnesium, Kalium und Natrium verschoben. Bei seinem natürlichen Vor kommen ist das Enzym an Membrane gebunden und ist verantwort lich für die Energiezufuhr beim Austausch von Natrium und Kalium gegenüber Membranen. Unter Verwendung in vitro einer vorbestimmten Menge von ATPase, ATP, K⁺ und Mg⁺² und Messen in bestimmter Weise kann das Auftreten von Produkten zur Bestimmung des Grades der Aktivierung von ATPase, dem Enzym katalysator, verwendet werden. Das Ausmaß der Reaktion, d. h. die Aktivität dieses Enzyms, ist direkt proportional der Natriumkonzentration.

Das Phosphatprodukt kann nach dem bekannten Verfahren von Fiske und Subbarow gemessen werden. In ähnlicher Weise können Techniken, die das Auftreten von ADP messen, zur Bestimmung der Größe der Aktivität von ATPase angewendet werden. Das ADP Stichprodukt von Reaktion I kann mit Phosphoenolpyruvat (PEP) in Gegenwart von Pyruvatkinase (PK) zu Pyruvat gemäß Reaktion II reagieren:

Schließlich kann gemäß der US-PS (USSN 06/7 29 633) eine Reihe von Verfahren verwendet werden, um die Menge des Pyruvat produktes zu messen, enthalten, bezogen auf das Gewicht von Alkylbenzosulfonat. Das Pyruvat kann mit Lactatdehydrogenase und reduziertem Nikotinamid-adenindinucleotid umgesetzt wer den, wobei die Änderung der Menge des letzteren in Ultravio let-Spektrophotometer verfolgt wird. Alternativ kann eine Reaktion mit Pyruvatoxidase Peroxid ergeben. Bei der Kupplung mit Peroxidase und einem zugegebenen Indikator ist das Aus maß der Farbänderung proportional zu der Menge des vorhandenen Pyruvats.

Ein anderes Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Py ruvatprodukts von Reaktion II ist die Reaktion mit 2,4-Dinitro phenylhydrazin. Nach der Zugabe von verdünntem Alkali ist die gebildete sichtbare Färbung proportional der Menge von Pyruvat, die ihrerseits wiederum ein Maß der Aktivität der ATPase in Reaktion I ist. Wie in der obengenannten Patentan meldung festgestellt wird, können diese quantitativen Reak tionen in Lösung oder in der "Papierphase" durchgeführt wer den, wobei letztere besonders wirtschaftlich und praktikabel für die Verwendung zu Hause oder in der Praxis ist. In Lösung wird die schließliche optische Dichte der Lösung vorzugsweise in einem Spektrophotometer gemessen. Zur Anwendung in der Pa pierphase werden die Reagenzstreifen so präpariert, daß die gebildete Färbung durch das Auge und Vergleich mit einer Standard-Farbkarte oder in einem Reflexionsspektrophotometer gemessen werden kann.

Zusammenfassend katalysiert unter Stimulierung von Natrium die Adenosintriphosphatase die Hydrolyse von ATP zu ADP (Reaktion I). Das Diphosphat-Produkt reagiert dann mit Phosphorenolpyruvat mittels Pyruvatkinase und ergibt Pyru vat (Reaktion II). Die Menge Pyruvat wird gemessen und ist direkt proportional der Menge von Natrium, die in der ursprüng lichen Untersuchungsprobe vorhanden ist.

Im folgenden wird ein Beispiel gegeben, das typisch für ein Verfahren zur Messung der Natriumkonzentration von Ver suchsproben ist, das dort näher beschrieben wird. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß dieses Beispiel nur erläutert und nicht begrenzt sein soll. Während nur eine Ausführungsform und ein Beispiel typischer Lösungen gemäß der Erfindung dar gestellt und beschrieben sind, liegt es nahe, daß viele Ände rungen und Modifizierungen durchgeführt werden können, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.

Beispiel

Es wird zunächst eine Reagenslösung aus 100 Einheiten Pyruvat kinase, 2 mg KC1, 10 mg ATP und 3 mg PEP in 1,05 ml 0,2 mol Tris/0,05M Mg²⁺ Puffer von pH 7,5 hergestellt. Eine Enzymsuspen sion von 5 Einheiten ATPase (eine unlösliche Natriumjodid fraktion, die extrahiert wurde und 10% Protein, 90% Saccharose 0,4% Natrium-EDTA und 0,06% NaCl enthält) in 2,5 ml Tris/ Mg-Pufferlösung wird ebenfalls hergestellt. Zu 0,05 ml der Untersuchungsprobe werden 0,10 ml Reagenzlösung und 0,05 ml Enzymsuspension zugegeben. Nach 4 Minuten inkubieren bei Raum temperatur werden 0,3 ml 2,4-D (20 mg 2,4-Dinitrophenylhydra zin in 1n HCl) zugegeben. Anschließend wird bei Raumtemperatur weitere 3 Minuten gebrütet und dann noch 3 ml 0,4n Natronlauge zugegeben. Nach 1 Minute wird die optische Dichte mit einem Spektrophotometer bei 500 nm abgelesen und mit einem bekannten Standard verglichen, wodurch die Natriumkonzentration der zu untersuchenden Probe bestimmt wird.

Claims

1. Verfahren zum Messen der Natriumkonzentration eines biologischen flüssigen Mediums, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

a) Fixieren der vorhandenen Mengen Adenosin-5′-tri phosphat (ATP), Adenosin-triphosphatase (ATPase), Magnesium und Kalium, in Gegenwart eines Puffers in einem Reaktions gemisch für die folgende enzymatische Reaktion I wobei ADP Adenosindiphosphat bedeutet, an dieses biologische flüssige Medium,
b) Messen der Geschwindigkeit des Auftretens der Produkte in der Reaktion I, so daß die Reaktionsgeschwindig keit von Adenosin-triphosphatase, welche der Konzentration von Natrium proportional ist, bestimmt wird, und
c) Vergleichen der Reaktionsgeschwindigkeit von Ade nosin-triphosphatase in der Reaktion I mit der Reaktion der gleichen Substanz in wenigstens einer Vergleichslösung bekann ter Natriumkonzentration und Bestimmen der Natriumkonzentra tion des biologischen flüssigen Mediums aus der Differenz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Puffer ein Tris-Puffer vom pH-Wert 7,5 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (b) und (c) durch Vergleich der optischen Dichte der erhaltenen Färbung bei den gekoppelten Reak tionen II und III durchgeführt wird: (PEP=Phosphoenolpyruvat, 2,4-D=Dinitrophenylhydrazin) mit wenigstens einem kolorimetrischen Standard bekannter Natriumkonzentration, wobei die optische Dichte der erhal tenen Färbung als Funktion der Zeit direkt proportional der Natriumkonzentration der biologischen Flüssigkeit ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die optische Dichte der erhaltenen Färbung durch Reflexions- oder Transmissionsspektrophotometrie ge messen wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die erhaltene Färbung durch Vergleich mit ei ner standardisierten Farbkarte gemessen wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das gebildete Pyruvat durch Reaktion mit einem anorganischen Phosphat, Pyruvat-Oxidase, Thiaminpyrophosphat, Flavinadenindinucleotid und einem Oxidationsindikator in ei nem Spektrometer gegen wenigstens einen kolorimetrischen Standard bekannter Konzentration gemessen wird, wobei die op tische Dichte der erhaltenen Färbung als Funktion der Zeit direkt proportional der Natriumkonzentration der biologi schen Flüssigkeit ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das gebildete Pyruvat durch Reaktion mit Nikotinamid, Adenindinucleotid und Lactatdehydrogenase in einem Spektro photometer gegen wenigstens einem kolorimetrischen Standard bekannter Konzentration gemessen wird, wobei die optische Dichte der erhaltenen Färbung als Funktion der Zeit direkt proportional der Natriumkonzentration der biologischen Flüs sigkeit ist.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß das zu untersuchende biologische flüssige Medium Ganzblut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Speichelflüs sigkeit, Rückenmarksflüssigkeit, Schweiß, Stuhlextrakt, Trä nen oder Peritonealflüssigkeit ist.

9. Verfahren zum Messen der Natriumkonzentration eines biologischen flüssigen Mediums zur Verwendung in einer Pa pierphase, gemäß Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Mengen Adenosin-5-′triphosphat, Adenosin triphosphatase und Kalium in Gegenwart eines wäßrigen Puf fers fixiert,
b) ein Indikatorsystem für die quantitative kolori metrische Analyse zu dieser wäßrigen Lösung zufügt,
c) ein faserartiges Material in die wäßrige Lösung eintaucht,
d) das faserartige Material aus der wäßrigen Lösung entfernt,
e) das faserartige Material an der Luft trocknet,
f) das faserartige Material in eine organische Lö sung einer bekannten Magnesiumkonzentration eintaucht,
g) das faserartige Material aus der organischen Lö sung entfernt,
h) das faserartige Material an der Luft trocknet,
i) die biologische zu testende Flüssigkeit auf das faserartige Material gibt, um die enzymatische Reaktion I nach Anspruch 1 zu starten,
j) die Geschwindigkeit des Auftretens der Produkte der Reaktion I durch die Farbmenge mißt, die in einer quan titativen kolorimetrischen Analyse gebildet wird, und
k) die Farbmenge, die gebildet wird, mit wenigstens einem Standard bekannter Natriumkonzentration vergleicht, wodurch die Farbmenge direkt proportional der Natriumkon zentration der zu testenden biologischen Flüssigkeit ist.

10. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Lösung bekannter Magnesiumkonzentration in Stufe (f) Magnesiumacetat, gelöst in absolutem Methanol, ist.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das faserartige Material Papier, ein Zellulosederivat oder ein synthetisches Material ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Standard in Stufe (c) in einem Bereich von 130-150 mEq/L liegt und daß der Tris-Puffer 0,2 Mol Tris und 0,05 Mol Magnesium²⁺-Ionen enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ADP-Produkt von Reaktion I unter Verwendung der gekoppelten Reaktion II bis V oder VI gemessen wird: unter Verwendung eines Spektrophotometers gegen wenigstens einen analytischen Standard bekannter Konzentration im Bereich von 130-150 mEq/L Natrium, wobei TPP=Thiaminpyrophosphat, FAD= Flavinadenindinucleotid Pi=anorg. Phosphat TMBZ=Tetramethyl benzidin, NAD=Nicotinamid-Adenindinucleotid LDH=Lactatdehydro genase und NADH=reduzierte LDH.