DE2737513B2 - Verfahren zur Bestimmung von Phospholipiden und Reagens zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Phospholipiden und Reagens zur Durchführung des Verfahrens

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DE2737513B2 DE19772737513 DE2737513A DE2737513B2 DE 2737513 B2 DE2737513 B2 DE 2737513B2 DE 19772737513 DE19772737513 DE 19772737513 DE 2737513 A DE2737513 A DE 2737513A DE 2737513 B2 DE2737513 B2 DE 2737513B2
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Description

Phospholipide finden sich unter anderem in Serum, Ei, Fleisch und Gemüse. Die Bestimmung der Phospholipide in diesen Stoffen ist zur Diagnose von Krankheiten von Bedeutung. In der Medizin ist die Bestimmung des ■",» Phospholipidspiegels in Serum von Bedeutung zur Diagnose von beispielsweise Hypercholesterinämie und Lebererkrankungen.
Es ist bereits eine Anzahl von Testmethoden zur Bestimmung von Phospholipiden im Blut bekannt. Die üblichste Methode ist die kolorimetrische Bestimmung mit Molybdat. Einige der Methoden hängen von der Umwandlung von Phospholipiden in anorganischen Phosphor durch Veraschen der Probe ab. Bei der Umsetzung der anorganischen Phosphorverbindung mit ho Molybdat bildet sich Phosphomolybdänsäure. Die Phosphomolybdänsäure wird mit einem Reduktionsmittel zu Molybdänblau reduziert und die Absorption des Molybdäns gemessen; vgl. J. Lah. Clin. Med., Bd. 35 (1950), S. 155; J. Biol. Chem., Bd. 234 (1959), S. 466; h-, Shinryo, Bd. 16(1963),S.677; Rinsho Byori, Bd. 10(1962), S. 194, und Bd. 15 (1967), S. 853.
Vor kurzem wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem dia im Blut vorhandenen Phospholipide enzymatisch in Phosphorsäure verwandelt werden. Sodann wird die Phosphorsäure mit Molybdat umgesetzt und das erhaltene Gemisch reduziert und die Farbe der Reaktionslösung bestimmt; vgL Yatron Document, RM 137-K,YtronCo,Ltd.
Die bekannten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Phospholipiden haben einen oder mehrere Nachteile, da sie umständlich und zeitraubend sind, nicht genau reproduzierbare Ergebnisse liefern und aufgrund von Wechselwirkungen des in der Probe enthaltenen Phosphors mit den Gefäßen eine Nullmessunj erfordern.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, praktisches, wirtschaftliches und genaues Verfahren und ein Reagens zur Bestimmung von Phospholipiden in Serum zu schaffen, das die quantitative Bestimmung der Phospholipide auf kolorimetrischem Wege ermöglicht und kein speziell ausgebildetes Laborpersonal erfordert Die Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren und das im Anspruch 3 gekennzeichnete Reagenz gelöst
Eine Weiterbildung des Verfahrens ist im Anspruch 2 und Weiterbildungen des Reagenz sind in den Ansprüchen 4 bis 8 beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht eine enzymatische Bestimmung der Phospholipide und stellt eine signifikante Verbesserung der routinemäßigen medizinischen Diagnose dar. Mittels des Reagens läßt sich das Verfahren in automatischen Analysegeräten durchführen.
Die Erfindung beruht auf folgender Kombination von enzymatischen Reaktionen:
Phospholipide, wie Lecithin, Sphingomyelin, Lysolecithin, Cephalin oder Phosphatidylserin, sind im Serum vorhanden.
Unter diesen Phospholipiden in Serum entspricht die Gesamtmenge an Lecithin, Sphingomyelin und Lysolecithin etwa 95% der gesamten Phospholipide in verschiedenen Seren. Diese drei Phospholipide werden durch eine enzymatische Reaktion zu Cholin umgesetzt.
Die Menge der bei der weiteren enzymatischen Umsetzung von Cholin zu Glycinbetainaldehyd in Gegenwart von Cholindehydrogenase (CLDH) und einem Wasserstoffacceptor gebildeten reduzierten Form des Acceptors ist direkt porportional zur Menge des Phospholipids im Serum.
Weiterhin ist die Menge der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH), die bei der enzymatischen Umwandlung von Glycinbetainaldehyd in Betainaldehyd in Gegenwart von Betainaldehyd-Dehydrogenase (BADH) und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) gebildet wird, oder die Mienge an verbrauchtem N^D bei der enzymatischen Reaktion ebenfalls direkt proportional der Menge an Phospholipid im Serum.
Die reduzierte Form des entstandenen Acceptors kann somit durch Bestimmung der Absorption der Farbe der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 400 bis 700 nm bestimmt werden.
Das entstandene NADH kann auch durch Bestimmung der Absorption der Reaktionslösung bei 340 nm bestimmt werden.
Die Menge des verbrauchten NAD kann durch Subtraktion des restlichen NAD vom zugesetzten NAD berechnet werden. Das restliche NAD in der Reaktionslösung kann durch Bestimmung der Absorption der Reaktionslösung bei 260 bis 280 nm bestimmt werden.
CH2OCOR2 CHOCOR3 0
Il
CH2-O-P-O-CHjCH2N(CHj)3OH" OH Lecithin
< PLD
(Reaktion I)
Cholin
CH-CH — (CH2)i2CH3 CHOH
CHNHCR1 O
Il
CHjOP-OCHjC H2N(CH3)3OH" OH
Sphingomyelin
CH2OCOR2 CHOCOR3
O
CH2-O-P-O-CH2CHjN(CHj)JOH-
OH
Lecithin
(Reaktion II) PLC
HO-P-O-CH2CH2N(CHj)3OH" OH
Phosphoryl-cholin
(Reaktion III) Phosphatase
HO-CH2CHjN(CH3)3OH" Cholin
CHjOH CHOCOR4
O CH2OP-OCH2CH2N(CHj)3OH-
OH
Lysolecithin
(Reaktion IV)
PLB
CH2OH CHOH O
Il
CH2OP-OCH2CH2N(CH,)jOH-OH
Glycerophosphoryl-cbolin
(Reaktion V)
GPD
Choiin
Cholin
(Reaktion VI)
-CLDH
■ Wasserstoff-Acceptcr
■ (Elektronen-Überträger)
OHC-CH2N(CH3KOH-
reduzierte Form
des Acceptors
Glycinbetainaldehyd
(Reaktion VII)
-BADH
NAD
Bestimmung
-OOC-CH2N(CHj)3
Glycinbetain
R2 und R3 bedeuten Kohlenwasserstoffreste.
NADH
Bestimmung
Diese Reaktionen sind einzeln bekannt. Lecithin setzt sich katalytisch mit Phospholipase D (PLD) unter Bildung von Cholin um (Reaktion I, J. Biol. Chem, Bd. 231 [1958], S- 703 und Bd. 172 [1948], S. 191). Sphingomyelin und Lecthin reagieren katalytisch mit Phospholipase C (PLC) inter Bildung von Phosphorylcholin (Reaktion H, Biochem. J, Bd. 35 [1946], S. 884; Biochem. Biophys. Acta, Bd. 59 [1962], S. 103). Das Phosphorylcholin reagiert katalytisch mit Phosphatase unter Bildung von Cholin (Reaktion III, J. Biol. Chem., Bd. 244 [1969], S. 308). Lysolecithin reagiert katalytisch 4= mit Phospholipase B (PLB) zu Glycerophosphorylcholin (Reaktion IV, »Biochemist's Handbook«, E. & F. N. Spou Ltd., 1961, S. 282; Nature, Bd. 169 [1952], S. 29; Biochem. J., Bd. 71 [19591s·61^)· Das Glycerophosphorylcholin reagiert katalytisch mit Glycerophosphorylcholin-Diesterase (GPD) zu Cholin (Reaktion V, J. Biol. Chem., Bd. 206 [1954], S. 647; Biochem. J, Bd. 62 [1956], S. 689).
Das bei der vorstehend beschriebenen L'msetzung entstandene Cholin reagiert katalytisch mit CLDH in Gegenwart eines Wasserstoffacceptors zu Glycinbetainaldehyd und der reduzierten Form des Acceptors (Reaktion VI, Agr. Biol. Chem., Bd. 39 [1975], S. 1513). Der Glycinbetainaldehyd reagiert katalytisch mit BADH in Gegenwart von NAD zu Glycinbetain und NADH (Reaktion VII, J. Biol. Chem., Bd. 209 [1954], S. 511).
Die vorstehend beschriebenen enzymatischen Reaktionen werden durch obiges Reaktionsschema wiedergegeben.
Die quantitative Bestimmung des Lecithingehaltes in einer Probe wird nach den aus den Reaktionen I und VI bestehenden Verfahren (Verfahren D) oder dem aus den Reaktionen I, VI und VII bestehenden Verfahren (Verfahren D') durchgeführt.
Die quantitative Bestimmung des Gesamtgehaltes an Sphingomyelin und Lecithin in einer Probe wird nach dem aus den Reaktionen II, III und VI (Verfahren C) oder den Reaktionen II, III, VI und VII bestehenden Verfahren (Verfahren C) durchgeführt
Die quantitative Bestimmung von Lysolecithin in einer Probe wird nach dem aus den Verfahren IV, V und VI (Verfahren B) oder den Reaktionen IV, V, VI und VII bestehenden Verfahren (Verfahren B') durchgeführt.
Die quantitative Bestimmung des Gesamtgehalts an Lecithin, Sphingomylein und Lysolecithin wird nach den Verfahren C und B, den Verfahren C und B', den Verfahren C und B oder den Verfahren C und B' durchgeführt.
Ganz allgemein gesprochen besteht das Reagenz der Erfindung somit aus einer Kombination eines Systems zur Umwandlung von Phospholipiden in einer Probe zu Cholin und einem System zur Bestimmung des entstandenen Cholins.
Das System zur Umwandlung der Phospholipide zu Cholin besteht aus einem oder mehreren Enzymen aus der Gruppe PLD, PLC und Phosphate sowie PLB und GPD.
Das Cholin-Erkennungssystem besteht aus CLDH und einem Wasserstoffacceptor und gegebenenfalls zusätzlich BADH und NAD und gegebenenfalls einem Elektronen-Überträger.
Mit dem Verfahren nach der Erfindung lassen sich Phospholipide quantitativ dadurch bestimmen, daß man die einzelnen Reaktionen stufenweise durchführt. Die Enzymreaktionen werden in entsprechende Gruppen unterteilt, und nach beendeter Umsetzung der vorher-
gehenden Stufe werden die nachfolgenden Enzyme zugesetzt, um die Reaktion der nächsten Stufe ablaufen zu lassen. Nach Beendung der Reaktion VI wird die Absorption des sichtbaren Teils der gefärbten Reaktionslösung durch Bildung der reduzierten Form des Acceptors bestimmt, oder nach beendeter Reaktion VII wird die Absorption des ultravioletten Teils der Reaktionslösung zur Bestimmung des entstandenen NADH oder des restlichen NAD bestimmt. Die nach einer oder mehreren der vorstehend geschilderten ι ο Stufen erhaltenen Absorptionswerte werden mit einer Eichkurve verglichen, die bei der Durchführung der vorstehend beschriebenen Stufen an einer standardisierten Probe erhalten wurde. Auf diese Weise läßt sich der Phospholipidgehalt in einer Probe bestimmen.
Erfindungsgemäß wird die quantitative Bestimmung der Phospholipide vorzugsweise folgendermaßen durchgeführt: Eine Probe wird mit einem Reagens umgesetzt, das aus Enzymen zur Umwandlung von Phospholipiden in Cholin, CLDH und einem Wasserstoffacceptor besteht. Gegebenenfalls enthält das Reagens noch BADH, NAD, einen Elektronen-Überträger und ein Netzmittel in einer Pufferlösung.
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme sind bekannt Sie können verschiedener Herkunft sein.
Es kann PLD der verschiedensten Herkunft verwendet werden, sofern es lediglich auf Lecithin unter den Phospholipiden einwirkt. Geeignetes PLD wird aus Kohl durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Es ist im Handel erhältlich. jo
Es kann PLC beliebiger Herkunft verwendet werden, sofern es nur auf Sphingomyelin und Lecithin unter den Phospholipiden einwirkt. Geeignetes PLC wird aus den Zellkörpern von Mikroorganismen der Art Escherichia coli durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Es ist im Handel erhältlich.
Phosphatase wird aus den Zellen von Mikroorganismen der Art Chlostridium perfringens oder Clostridium welchii durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Es ist im Handel erhältlich.
Es kann PLB beliebiger Herkunft verwendet werden, sofern es lediglich auf Lysolecithin unter den Phospholipiden einwirkt. Geeignetes PLB kann aus den Zellkörpern von Mikroorganismen der Art Penicillium notatum durch Extraktion gewonnen werden; vgl. Biochem. J, Bd. 70 (1958), S. 559. Ferner sind PLB-Präparate geeignet, die aus der Schleimhautmembran von Leber und Eingeweiden von Ratten, Rindern und Schweinen gewonnen werden.
Geeignetes GPD kann aus den Zellkörpern von Mikroorganismen der Art Serratia plymuthicum durch Extraktion gewonnen werden; vgl. J. Biol. Chem, Bd. 206 (1954), S. 647. Geeignet sind auch GPB-Präparate aus der Leber von Ratten, Rindern und Schweinen; vgl. Biochem. J, Bd. 62 (1956), S. 689.
Geeignetes CLDH kann aus den Zellen von Mikroorganismen der Art Pseudomonas aeruginosa gewonnen werden; vgL Agr. BioL Chem, Bd. 39 (1975), S. 1513 bis 1514. Geeignet sind ferner CLDH-Präparate aus Rattenmitochondrien; vgL J. BioL Chem, Bd. 234 eo (1959), S. 1605.
Geeignetes BADH kann aus den Zellen von Mikroorganismen der Art Pseudomonas aeruginosa gewonnen werden; vgL Agr. BioL Chem, Bd. 39 (1975), S. 513 bis 1514. Geeignet sind auch BADH-Präparate, die aus dem Überstand eines Rattenleberhomogenats erhalten werden; vgl. J. Biol. Chem, Bd. 209 (1954), S. 511.
Das Mengenverhältnis von Enzymen zu Phospholipi den liegt in einem solchen Bereich, daß die Bestimmuni genau durchgeführt werden kann. In der Regel könnei folgende Mengen an Enzymen pro 1 μg Phospholipii verwendet werden: 0,005 bis 1 IU für PLD, 0,005 bis 1 R für PLC, 0,005 bis 1 IU für PLB, 0,005 bis 50 IU fü Phosphatase, 0,005 bis 1 IU für GPD, 0,1 bis 50 IU fü; CLDH und 0,1 bis 100IU für BADH.
Die vorstehend aufgeführten Enzyme werden in eine: entsprechenden Pufferlösung eingesetzt Die bevorzug ten Konzentrationen der Enzyme in der Pufferlösung betragen 0,01 bis 1 IU/ml für PLD, 0,0! bis 1 IU/ml füi PLC, 0,01 bis 1 IU/ml für PLB, 0,1 bis 50 IU/ml füi Phosphatase, 0,01 bis 1 IU/mi für GPD, 0,1 bis 50 IU/ml für CLDH und 0,1 bis 100 IU/ml für BADH.
Der Ausdruck IU bezeichnet eine internationale Einheit des Enzymfaktors. Der zur Zersetzung von 1 μΜοΙ Substrat in 1 Minute fähige Faktor wird als 1 IU definiert, d. h. 1IU ist 1 μΜοΙ/min.
Der pH-Wert der Pufferlösung liegt in einem Bereich von 5,0 bis 10,0, vorzugsweise von 6,5 bis 7,5. Beispiele für verwendbare Puffer sind Phosphat-, Succinat-, Citrat-, Borat-, Acetat-, Glycylglycinat- und tris-Malonat-Puffer sowie andere Puffer, die einen pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 10,0 liefern. Die Pufferkonzentration ist nicht kritisch. Vorzugsweise werden jedoch verhältnismäßig verdünnte Pufferlösungen verwendet, zweckmäßig einer Konzentration von 0,1 bis 0,2 Mol/Liter.
Beispiele für verwendbare Wasserstoffacceptoren sind
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-
[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-
2H-tetrazoliumchlorid](Nitro TB),
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphen;1en)-bis-
[2,5-bis-(p-nitrophenyI)-
2H-tetrazoliumchlorid] (TNTB),
3-fp-Indophenyl-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-
2H-tetrazoliumchlorid] (INT),
2,6-Dichlorphenylindophenol (DCPIP) und NAD.
Bei Verwendung von DCPIP wird es mit einem Elektronen-Überträger, wie Phenazin-methosulfat, verwendet, das ein Elektron von Cholin aufnimmt und es an DCPIP weitergibt.
Da NAD durch Enzyme in NADH überführt wird, wobei NAD dessen Coenzym ist, können bisweilen Fehler vorkommen, wenn derartige Enzyme im Reaktionssystem vorliegen. Vorzugsweise werden daher derartige Kombinationen vermieden.
Die bevorzugte Konzentration des Wasserstoff-Acceptors in der Pufferlösung beträgt 0,1 bis 500 mMol/Liter.
Die bevorzugte Konzentration des Elektronen-Überträgers beträgt 0,1 bis 50 mMol/Liter.
Typische Proben, in denen Phospholipide bestimmt werden können, sind Serum oder Leber, und Nahrungsmittel, wie pflanzliche öle, Fischöl und Gemüse. Sofern die Probe ein Feststoff ist, wird sie vermählen und sodanr mit Wasser oder einer geringen Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Äthanol oder Chloroform, extrahiert. Wenn die Probe ein öl ist, kann der Reagenslösung ein Netzmittel zugesetzt werden, um die Affinität der Reagenslösung zu verbessern. Beispiele für geeignete Netzmittel sind höhere Alkohole, wie PolyäthylenglykoL Vorzugsweise liegt das Netzmittel in der Reagenslösung in einer Konzentration von 0,01 bis 5 g/Liter vor.
Die enzymatischen Reaktionen werden in der Regel
bei Temperaturen von 20 bis 45° C, vorzugsweise bei 30 bis 40° C und bei einem pH-Wert von 5 bis 10 während eines Zeitraumes von 4 bis 60 Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktionen wird die Absorption der Reaktionslösung beispielsweise mittels eines Spektrophotometers gemessen. Bei der Bestimmung der Menge an entstandener reduzierter Form des Acceptors wird die Absorption des sichtbaren Teils der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge im Bereich von 400 bis 700 nm gemessen. Bei Verwendung ι ο von NAD als Wasserstoff-Acceptor bei der Reaktion Vl wird die quantitative Bestimmung der reduzierten Form des Acceptors, d. h. NADH, in der Reaktion VI durch Messung der Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 340 nm durchgeführt.
Bei der Bestimmung von NADH wird die Absorption des ultravioletten Teils der Reaktionslösung bei 340 nm gemessen. Bei der Bestimmung der restlichen Menge an NAD wird die Absorption bei 260 bis 280 nm gemessen. Die bei der Reaktion entwickelten Farben unter Verwendung von Nitro-TB, TNTB, INT oder DCPIP als Wasserstoff-Acceptor sind blau, rotbraun, rot (oder violett), bzw. rotstichigblau.
Bei Verwendung von NAD als Wasserstoff-Acceptor in der Reaktion VI und bei der quantitativen Bestimmung der Phospholipide durch Bestimmung der entstandenen Menge an NADH nach Beendigung der Reaktion VII stellt der gemessene quantitative Wert von NADH die Gesamtmenge an entstandenem NADH bei den Reaktionen VI und VII dar. Deshalb wird die bei jo der Reaktion VI entstandene M-.nge an NADH berücksichtigt Die Reaktion VII verläuft gewöhnlich zu 100%. Somit wird die bei der Reaktion VII entstandene Menge an NADH zu 50% dieses Wertes angenommen.
Das Reagens der Erfindung kann in verschiedener r> Form verwendet werden. Beispielsweise können die Bestandteile in flüssiger Form oder als Pulver vermischt verwendet werden. Pulver werden durch einfache Zugabe von Wasser oder einer Pufferlösung in Lösung gebracht Zur leichteren Verwendung kann das Pulver tablettiert werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Quantitative Bestimmung von Lecithin,
Sphingomyelin und Lysolecithin in humanem Serum
3 ml einer 0,15molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,2), die 0,04 IU PLC, 5 IU Phosphatase, 0,014 IU PLB, 0,014 IU GPD, 5 IU CLDH und 0,6 mMol TNTB enthält wird mit 20 μίΰβΓ Blutserum versetzt
Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 37° C durchgeführt Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung bei 550 nm mit einem Spektrophotometer bestimmt um den Gehalt an reduzierter Form des entstandenen Acceptors zu messen.
Der Gehalt an Phospholipiden wird durch Vergleich des Absorptionswerts mit einer Eichkurve erhaHsn. Diese Eichkurve wird nach der vorstehend beschriebenen Methode mit einer Standardprobe von Lecithin hergestellt
Zum Vergleich wird das Serum nach Folch mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol extrahiert Der erhaltene Extrakt wird mit Perchlorsäure zu anorganischem Phosphat und einem Moiybdat oxidiert Sodann wird die erhaltene Lösung mit Hydrazinsulfat versetzt Hierauf wird die Absorption der entstandenen Farbe bei 700 nm mit einem Spektrophotometer gemessen; vgl. Rinsho Byori.Bd. 10(1962),S. 194.
Die Proben werden nach jeder Methode zehnmal gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I
Versuch Gehalt an Phospholipiden,
mg/dl
Verfahren der bekanntes
Erfindung Verfahren
1 185,3 189,3
2 187,2 195,2
3 184,4 199,4
4 186,7 190,8
5 185,1 187,2
6 181,9 193,6
7 188,2 195,1
8 187,5 188,8
9 186,3 192,3
10 184,6 190,5
Durchschnittswert 185,7 192,2
Standardabweichung 1,85 3,68
VariationskoefTizient 0,99% 1,91%
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die Standardabweichung und der Variationskoeffizient im erfindungsgemäßen Verfahren geringer sind als beim bekannten Verfahren.
Hinsichtlich des Gehalts an Gesamtphospholipiden ergibt die Multiplikation mit einem Faktor von 1,0416 einen Durchschnitt des Gehalts an Gesamtphospholipiden von 193,4 mg/dl, d. h. nahezu den gleichen Zahlenwert wie beim bekannten Verfahren.
40
•4r>
Beispiel 2
Quantitative Bestimmung von Lecithin,
Sphingomyelin und Lysolecithin in Serum von
Patienten (Ilb-Typ)
3 ml einer 0,15molaren Tris-Pufferlösung (pH 7,2), die 0,04 IU PLC, 5 IU Phosphatase, 0,014 IU PLB, 0,014 IU GPD, 5 IU CLDH, 5 IU BADH und 0,9 mMol NAD enthält wird mit 20 μΐ Patientenserum versetzt
Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 37° C durchgeführt Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung bei 340 nm in verschiedenen Zeitabständen mit einem Spektrophotometer gemessen, '.im den Gehalt an entstandenem NADH in der Lösung zu bestimmen. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle II zusammengefaßt
Tabelle II Gehall an
Gesamtphospholipiden
mg/dl
305,2
30 see 312,1
1 min 314,3
5 min 313,0
15 min
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß die quantitative Bestimmung der Gesamtphospholipide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in kurzer Zeit durchgeführt werden kann.
Beispiel 3
Quantitative Bestimmung der Gesamtphospholipide in Serum
Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch werden 0,6 mMol INT anstelle von TNTB sowie normales humanes Serum und Patientenseren IIa-,IIb- und IV-Typ) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Der Gehalt an Gesamtphospholipiden wird durch Multiplikation mit einem Faktor von 1,04· 16 erhalten.
Tabelle III
Serum
Gehalt an Gesamtphospholipiden mg/dl
erfindungsgemäßes bekanntes Verfahren Verfahren
Normales
humanes Serum
l.a-Typ
I Ib-Ty ρ
IV-Typ
194.2 ± 14,0
275.3 ± 15,4
341,0 ± 19,5
273,5 ± 12,3
Beispiel 4
201,5 ±32,3
278,7 ± 40,2 348,2 ±51,2 263,2 ± 52,3
Quantitative Bestimmung von Lysolecithin in Patientenserum
3 ml einer 0,15molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,2), die 0,014 IU PLB, 0,014 IU GPD, 5 IU CLDH und 0,6 mMol TNTB enthält wird mit 100 μΐ Serum versetzt.
Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 37° C durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Die rotbraune Farbe der Reaktionslösung wird mit einer Eichkurve verglichen, die mit einer Standardverbindung erhalten worden ist.
Zum Vergleich (bekanntes Verfahren) wird das gleiche Serum durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel entwickelt Die erhaltene Probe wird verascht, und mit Molybdänsäure wird eine Farbe entwickelt. Die Farbe wird mit einem Densitometer gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt
Tabelle IV
Versuch
Gehalt an Lysolecithin, mg/dl
erfindungsgemäßes Verfahren
bekanntes Verfahren
35,36
35,82
35,14
35,38
34,98
35,67
35,28
35,43
35,45 36,85 34,67 35,59 36,98 35,56 36,02 35,95
Versuch
Gehalt an Lysolecithin, mg/dl
erfindungs- bekanntes
gemäßes Verfahren
Verfahren
9 35,33
10 35,87
Durchschnittswert 35,42
ίο Standardabweichung 0,28
Variationskoeffizient 0,79%
Beispiel 5
34,38
35,21
35,66
0,83
2,32%
3 ml eines 0,15molaren Glycylglycin-Puffers (pH 7,2), der 0,04 IU PLB, 0,04 IU GPD, 5 IU CLDH, 5 IU BADH und 0,09 mMol NAD enthält, wird mit 100 μΐ normalem humanem Serum versetzt. Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 37° C durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung mit einem Spektrophotometer bei 340 nm gemessen, um den Gehalt an entstandenem NADH zu bestimmen.
Der Gehalt an Lysolecithin wird durch Vergleich des Absorptionswerts mit einer Eichkurve erhalten, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit einer bekannten Menge Lysolecithin erhalten worden ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.
Tabelle V
Versuch
Probe
Gehalt an Lysolecithin, mg/dl
30 sec I min 5 min
15 min
13,25 17,66 17,69 17,58
!!,65 15,35 15,36 !5,32
15,23 20,10 20,11 20,08
12,51 16,83 16,86 16,75
11,23 14,92 14,95 14,89
Beispiel 6
Bestimmung von Lysolecithin in Seren
Beispiel 4 wird wiederholt jedoch werden 0.6 mMol INT anstelle von TNTB sowie 10 Proben von normalem humanem Serum und Patientenseren (Ha-, Hb- und IV-Typ) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt
Tabelle VI
Serum
Gehalt an Lysolecithin, mg/dl
erfindungsgemäßes bekanntes
Verfahren Verfahren
Normales 17,63 ±4,66 18,43 ± 5,42
humanes Serum
Patientenserum 25,25 ±5,70 26,26 ± 7,41
I Ia-Ty ρ
Patientenserum 35,36 ± 9,23 35,97 ± 11,45
27,08 ± 8,64 26,84 ± 11,77
Patientenserum
IV-Typ
Beispiel 7
Bestimmung von Lecithin in Patientenserum
3 ml eines 0,15molaren Phosphatpuffers (pH 7,2), der 0,014 IU PLD, 5IU CLDH und 0,6 mMol TNTB enthält
wird mit 20 μΐ Serum versetzt. Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 370C durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung bei 550 nm mit einem Spektrophotometer gemessen. Die Farbe der Reaktionslösung wird mit einer geeichten Farbkarte verglichen, die nach der vorstehend beschriebenen Methode mit Lecithin als Standardverbindung erhalten worden ist.
Zum Vergleich wird das in Beispiel 4 beschriebene bekannte Verfahren mit dem gleichen Serum wieder- io Tabelle IX
holt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammenge-
Beispiel 9
Beispiel 7 wird wiederholt, jedoch werden 0,6 mMol INT anstelle von TNTB und 10 Proben von normalem humanem Serum und Patientenseren (Ha-, Hb- und IV-Typ) verwendet. Die Ergebnisse (Durchschnittswerte) sind in Tabelle IX zusammengefaßt.
Serum
Gehalt an Lecithin, mg/ml
Tabelle VII
Versuch
Gehalt an Lecithin, mg/dl
erfindungs- bekanntes
gemäßes Verfahren
Verfahren
126,88 130,50 138,45 117,50 118,5C 113,51 141,24 114,71 124,48 134,46 126,02 9,96 7,90
1 126,88
2 128,47
3 126,48
4 124,08
5 123,88
6 128,67
7 127,87
8 126,08
9 124.28 10 129,07
Durchschnittswert 126,57
Standardabweichung 1,97
Variationskoeffizient 1,55
Beispiel 8
Quantitative Bestimmung von Lecithin in normalem humanem Serum
3 ml eines 0,15molaren Glycylglycin-Puffers (pH 7,2), der 0,04 IU PLD, 5 IU CLDH und 0,09 mMol NAD enthält, werden mit 20 μΐ Serum versetzt. Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 37° C durchgeführt. Sodann wird der Gehalt an NADH in der Reaktionslösung mit einem Spektrophotometer bestimmt. Es wird die Zunahme der Absorption bei 340 nm während 15 Minuten bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.
20
JO
Tabelle VIII Lecithin, X mg/dl 5 min 15 min
Probe Gehalt an 1 min 128,3 126,61
3 see 124,8 130,1 128,1
1 124,6 127,7 128,6 127,2
2 126,8 126,0 124,4 123,8
3 125,2 123,7 132,0 130,7
4 123,8 128,4
5 128,6
Tabelle
55 erfindungsgemäßes
Verfahren
bekanntes
Verfahren
Normales
humanes Serum
Ila-Typ Ilb-Typ IV-Typ 128,3 ± 4,8
175,18 ± 9,8
219,90 ± 10,8
174,88 ± 11,04
Beispiel 10
128,85 ± 8,75
173.68 ± 12,34 226,05 ± 12,84
173.69 ± 16,72
Quantitative Bestimmung von Sphingomyelin in Serum
(1) Bestimmung des Gesamtgehalts an Lecithin und
Sphingomyelin in Serum
3 ml eines Q,15molaren Phosphatpuffers (pH 7,2), der 0,04 IU PLC, 5 IU Phosphatase, 5 IU CLDH und 0,6 mMol TNTB enthält, werden mit 20 μΐ Serum versetzt. Die enzymatische Reaktion wird 15 Minuten bei 37°C durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung bei 550 nm gemessen und der erhaltene Absorptionswert mit einer geeichten Farbkarte verglichen, die nach der vorstehend beschriebenen Methode mit einer bekannten Menge L-a-Lecithin als Standard erhalten worden ist.
Als Ergebnis wird der Gesamtgehalt von Lecithin und Sphingomyelin erhalten.
(2) Bestimmung des Lecithingehalts in Serum
Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Bestimmung des Gesamtgehalts von Lecithin und Sphingomyelin wird wiederholt, jedoch werden 0,04 IU PLD anstelle von PLC und Phosphatase verwendet. Als Ergebnis wird der Gehalt an Lecithin in Serum erhalten.
Der Gehalt an Sphingomyelin wird durch Subtraktion des Gehalts von Lecithin vom Gesamtwert erhalten.
Zum Vergleich wird das in Beispiel 4 beschriebene bekannte Verfahren mit dem gleichen Serum wiederholt
Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt
Versuch
Erfindungsgemäßes Verfahren, mg/dl
Lecithin
+ Sphingomyelin
Lecithin Sphingomyelin
Bekanntes
Verfahren
mg/dl
167,20 171.35
126,88 128.47 40,32
42.88
41,69
46.21
Fortsct/une
16
Versuch Erfindungsgemäßes Verfahren, Lecithin -l Sphingomyelin 126,46 mg/dl Bekanntes
Lecithin 165,56 124,08 Sphingo Verfahren
163,85 125,88 myelin mg/dl
3 169,53 128,67 39,08 37,85
4 170,20 127,87 39,77 42,32
5 168,35 128,08 43,65 37,01
6 171,12 124,28 41,53 38,35
7 165,35 129,07 40,48 43,32
8 168,82 126,97 43,04 41,51
9 168,13 1,78 41,07 40,21
10 2,57 1,40 39,75 39,35
Durchschnittswert 1,53 41,15 40,78
Standardabweichung 1,57 2,80
Variationskoeffizient 3,81 6,86
Beispiel i 1
Quantitative Bestimmung von Sphingomyelin in Serum
(1) Bestimmung des Gesamtgehalts an Lecithin und Sphingomyelin
ml eines 0,15molaren Glycylglycin-Puffers (pH 7,2), der 0,04 IU PLC, 5 IU Phosphatase, 5 IU CLDH, 5 IU BADH und 0,09 mMol NAD enthält, werden mit 20 μΐ Serum versetzt. Die enzymatische Reaktion wird Minuten bei 37° C durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wird die Absorption der Reaktionslösung bei 340 nm mit einem Spektrophotometer gemessen, um das entstandene NADH in der Reaktionslösung zu bestimmen. Die in Beispiel 10 beschriebene Eichkurve wird als Eichkurve verwendet.
(2) Bestimmung des Lecithingehalts
Es wird das Verfahren zur Bestimmung des Gesamtgehalts von Lecithin und Sphingomyelin wiederholt, jedoch werden 0,04 IU PLD anstelle von PLC und Phosphatase verwendet. Der Gehalt an Sphingomyelir wird gemäß Beispiel 10 berechnet. Die Ergebnisse sind
j in Tabelle XI zusammengefaßt.
Tabelle XI
Versuch
Erfindungsgemäßes Verfahren, mg/dl
Lecithin Lecithin Sphingo-
+ Sphingomyelin myelin
Bekanntes Verfahren
mg/ml
1 213,6
2 215,4
3 209,5
4 210,3
5 213,2
6 211,2
7 208,9
8 214,3
9 215,0 10 2K,2
Durchschnittswert 212,5 Standardabweichung 2,37
Variationskoeffizient 1,1
161,3 159,6 162,1 161,2 160,8 163,0 159,4 156,3 162,1 159,6
160,5 1,91 1,2
52,3 56,3
55,8 51,7
47,4 49,6
49,1 55,8
52,4 52,7
48,2 48,6
49,5 43,8
58,0 52,8
53,9 49.6
54,8 58,4
52,1 51,9
3,53 4,28
6,7 8,2
Beispiel 12
Beispiel 10 und 11 werden an 10 Serumproben wiederholt. Nach der quantitativen Bestimmung von Sphingomyelin wird die reduzierte Form des Acceptors (Absorption im sichtbaren Bereich) und von NADH (Absorption im UV-Bereich) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle XII und XIII zusammengefaßt.
030 107/391
17
Tabelle XII Q F-Q' Verfahren nach Q'
Probe Lecithin 38,8 Beispiel 11 Lecithin
Verfahren nach 49,2 F
Beispiel 10 Lecithin
P 128,4 + Sphingo- 127,9
Lecithin 164,1 mye'in 165,3
+ Sphingo- 204,2 166,7 208,3
1 myelin 175,2 214,5 174,5
2 167,2 162,4 267,3 159,9
3 213,3 202,3 233,8 203,1
4 269,8 219,9 212,3 220,1
5 233,6 159,3 268,3 261,1
6 214,5 174,9 281,9 173,8
7 267,9 132,1 200,3 133,0
8 283,2 224,3
9 201,0 Gehalt an Sphingomyelin, 173,1
10 226,7 P-Q P-Q
Tabelle 172,4 38,8 mg/ml 38,8
XIII 49,2 P-O' 50,4
39,1
1 48,0
2
18
Gehalt an Sphingomyelin, mg/ml P-Q F-Q' P-O'
65,6 58,4 52,1 65,5 63,3 41,7 51,8 40,3
59,0 59,3 52,4 65,2 61,8 39,2 50,5 40,1
61,5 63,1
59,1 58,6
54,6 49,9
64,8 66,0
63,1 62,0
39,9 41,0
52,9 49,4
39,4 41,0
Beziehung zwischen P und P' Koeffizient der Beziehung γ = 1,00,
Y= 0.99X + 1.54
Beziehung zwischen Q und Q' Koeffizient der Beziehung γ = 1,0,
Y= 1,02X-3,03
Beziehung zwischen P-Q und P'—Q' Koeffizient der Beziehung γ = 0,98,
Y= 0.93X + 2.56
Beziehung zwischen P-Q' und P' — Q Koeffizient der Beziehung γ = 0,97,
Y= 0.96X + 1.82.

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Phospholipiden, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einem Cholin-bildenden System, das mindestens Phospholipase D, Phospholipase C, Phosphatase, Phospholipase B, Glycerophosphorylcholin-Diesterase oder deren Gemisch enthält, und einem Cholin-Erkennungssystem zur Umsetzung bringt, das eine Cholindehydrogenase und einen Wasserstoffacceptor enthält
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholin-Erkennungsreagens zusätzlich Betainaldehyd-Dehydrogenase und Nicotinamid-adenin-dinucleotid enthält
3. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend ein Cholin-bildendes System, das mindestens aus Phospholipase D, Phospholipase C, Phosphatase, Phospholipase B oder Glycerophosphorylcholin-Diesterase oder deren Gemisch besteht, und ein Cholin-Erkennungsreagens, das mindestens aus Cholindehydrogenase und einem Wasserstoffacceptor besteht
4. Reagens nach Anspruch 3, enthaltend zusätzlich Betainaldehyd-Dehydrogenase und Nicotinamidadenin-dinucleotid.
5. Reagens nach Anspruch 3 zur Bestimmung von Lecithin, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholinbildende System aus Phospholipase D besteht jn
6. Reagens nach Anspruch 3 zur Bestimmung von Lysolecithin, dadurch gekennzeichnet, daß das Choliii-bildende System aus Phospholiphase B und Glycerophosphorylcholin- Diesterase besteht.
7. Reagens nach Anspruch 3 zur Bestimmung von Lecithin und Sphingomyelin, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholin-bildcndc System aus Phospholipase C und Phosphatase besteht
8. Reagens nach Anspruch 3 zur Bestimmung von Lecithin, Sphingomyelin und Lysolecithin, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholin-bildende System aus Phospholipase B, Phospholipase C, Phosphatase und Glycerophosphorylcholin-Diesterase besteht.
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