DE2323609A1

DE2323609A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von triglycerid

Info

Publication number: DE2323609A1
Application number: DE19732323609
Authority: DE
Inventors: Fumio Hirata; Toshiwo Inagawa; Hiroshi Shimizu; Mamoru Sugiura; Masayasu Sugiyama
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-12-25
Filing date: 1973-05-08
Publication date: 1974-06-27
Also published as: FR2212046A5; CH576143A5; GB1441642A

Description

Hamburg, den 7. Mai 197 3 13Θ973

Prioritäten: 25. 12. 1972, Japan Nr. 48-2389

und

27. 2. 1973, Japan Nr. 48-23592

Anmelder:

Ono Pharmaceutical Company Limited
No.14, 2-chome, Dosho-machi,
Higashi-ku
Osaka-shi, Japan

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Triglycerid

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von in Blutserum oijr in Gevsbeflüssigkeit enthaltenem Tr L'jlvc'iriu.

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Die bisherige quantitative Bestimmung durch Analyse von Triglycerid, das in Serum oder Gewebeflüssigkeit enthalten ist, wurde so durchgeführt, dass zunächst die Fettstoffe mit einem Lösungsmittel, beispielsweise einem Misch-Lösungsmittel aus Methylchlorid und Methanol, extrahiert, dann die extrahierten Fettstoffe alkalisch hydrolysiert wurden, wobei das Glycerin freigesetzt wurde, und anschliessend dieses in der Flüssigkeit enthaltene Glycerin quantitativ, enzymatisch oder mit chemischen I4ethoden, bestimmt wurde. Diese bisher benutzten Bestimmungsverfahren sind vergleichsweise aufwendig und umständlich, und darüber hinaus ist diese Art der quantitativen Analyse von j.'riglycerid in Geweben weitgehend abhängig von dem Ausmaß der Extraktion des Fettes vor der Hydrolyse. Darüber hinaus ist eine chemische Verseifung nicht für Fett spezifisch, so dass die analytischen Ergebnisse unter Umständen ungenau ausfallen können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese bisherigen Nachteile der Bestimmung von Triglycerid in Blut und Körper- bzw. Gewebefliissigkeiten zu vermeiden und ein einfaches und rasch durchführbares Bestimmungsverfahren zu schaffen, das eine sichere quantitative Analyse von Triglycerid in solchen Flüssigkeiten erlaubt.

Diese Aufgabe wird gelöst mittels eines Verfahrens der angegebenen Art zur quantitativen Bestimmung von in Blutserum und in Gewebeflüssigkeit enthaltenem Triglycerid, das erfindungsgemäss dadurch gekennzeichnet ist, dass das Triglycerid mittels einer Lipoprotein-Lipase-Aktivität aufweisenden Lipase, die aus einem Mikroorganismus Pseudomonas, Mucor, Streptomyces oder Serratia gewonnen wird, in dem Serum oder Gewebe hydrolysiert und Fettsäure und Glycerin freigesetzt und mindestens eine der freigesetzten Komponenten analytisch bestimmt wird.

Es wurde überraschend gefunden, dass es möglich ist, ein TriglycerLd in einem Serum oder Gewebe analytisch quantitativ zu bestimmen, ohne dass eine Extraktion aus dem homogenisierten Serur oder Gewebe vorgenommen wird, wenn man die Hydrolyse des Priglycerids zu Glycerin und Fettsäure unter Benutzung von Lipoprotein-Lin ise-^.zcivit^t -~uf

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weisender Lipase, die aus einem der genannten Mikroorganismen gewonnen wird, vornimmt. Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Lipase, die eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität besitzt, wird nachstehend als "Lipoprotein-Lipase" bezeichnet. Die Hydrolyse mittels einer solchen Lipoprotein-Lipase verläuft, wie gefunden wurde, rasch und quantitativ, und die dabei freiwerdende Fettsäure und/oder das Glycerin lassen sich in einfacher Weise bestimmen.

In der beiliegenden Zeichnung, in der in Form eines Diagramms die llydrolyseergebnisse nach bekanntem Verfahren (Acetyl-Aceton-Methode) in Vergleich gesetzt sind mit den Hydrolyseergebnissen bei der erfindungsgemässen Arbeitsweise (LPL-Hydrazon-Methode),erkennt man, dass das erfindungsgemässe Verfahren zuverlässig und exakt arbeitet. In der Zeichnung sind auf der Abszisse die Hydrolyse-Ergebnisse mittels der bekannten Acetyl-Aceton-Methode und auf der Ordinate die Hydrolyse-Ergebnisse mit der beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten LPL-Hydrazon-Methode abgetragen.

Beispiele für die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendbaren Lipoprotein-Lipase produzierenden Mikroorganismen der Arten Pseudomonas, Hucor, Streptomyces und/oder Serratia sind nachfolgend aufgeführt:

Pseudomonas fluoresens IAM 1057

Pseudomonas schuylkilliensis IAM 1053

Pseudomonas saccharophila IAM 1504

Pseudomonas aeruginosa IAI-I 109 5

Mucor hiemalis IAM 6088

ilucor javanicus . IAM 6108

Hucor flavus IAM 6143

Ilucor circinelloides IAM 6148

Mucor mandschuricus IAM 6118

Streptomyces aureofaciens IAM 0087

Streptomyces parvus IAIl 0013

Serratia marcescens IAM 1065

Serratia marcescens IAM 1067

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Durch die Wirkung der aus einem der zuvor genannten IliJcroorganismen erhaltenen Lipoprotein-Lipase-Produkt auf in Serum oder Gewebe vorhandenem Triglycerid werden Fettsäure und Glycerin freigesetzt. Die freigesetzte Fettsäure lässt sich durch Titration oder coloriraetrische Bestimmung analysieren, und aus den erhaltenen Werten kann die Menge an Triglycerid errechnet v/erden. Das freigesetzte Glycerin lässt sich mittels verschiedener Methoden analysieren, beispielsweise durch chemische Analyse, colorimetrisch dadurch, dass Formalin, das durch Perjodatoxydation aus Glycerin gebildet wird, mit Chromotropsäure oder mit Acetylaceton in Gegenwart von Ammoniumionen behandelt und zu einer gefärbten Substanz umgebildet wird.

Ferner kann man das Glycerin mit enzymatischer "lethode, beispielsweise durch Einwirkung eines Enzym-Systerns, die Glycerin-Kinase (nachstehend als G.K bezeichnet) - Pyruvat-Kinase (nachstehend als P.K bezeichnet) - Lactat-Dehydrogenase (nachstehend als LDH bezeichnet) prüfen, wobei verursacht durch eine Abnahme an reduziertem Hikotinamidadenindinukleotid (NADH - WAD) eine Abnahme des Wertes der ultravioletten Absorption stattfindet, die als Prüfwert dient. Ein solches konjugiertes Enzymsystem lässt sich wie folgt veranschau lichen:

LDH

G.K 1

Lactat

Glycerin
Glycerin-1-phosphat

NAD

ί . * ATPf^ >7Pyruvatr^ ^- NADH

^ ADP —' ^* Phosphoenolpyruvat

ρ ' ν Es ist so eine quantitative Bestimmung möglich.

Weiterhin kann die Menge an vorhandenem Triglycerid quantitativ nach folgenden Methoden ermittelt werden:

Glycerin-1-phosphat, das durch Einwirkung von G.K auf Glycerin gebildet worden ist, wird durch Glycerin-l-phosphat-Dehydrogenase (G-I-DH) umwandelndes HAD, ein Koenzym von G-I-DH, zu NADH oxidiert,

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und dabei wird die Zunahme an so gebildetem reduziertem Nikotinamidadenindinukleotid durch Ermittlung das Ultraviolett-Absorptionswertes gemessen. Oder man kann das Glycerin durch Glycerin-Dehydrogenase (GDH) zu Dihydroxyaceton umwandeln und durch Ultraviolett-Absorption die Zunahme an NADH von mAü als Prüfwert messen.

Eine coIorimetrisehe Messung kann auch in der Weise vorgenommen wurden, dass die Schiffsche Basenverbindung zwischen der Ketogruppe in Pyruvat, Dihydroxyacetonphosphat oder Dihydroxyaceton, das bei der enzymatischen Prüfung gebildet wird, und einem Hydrazin-Reagens, wie beispielsweise 2,4-Dinitrophenylhydrazin, meßtecMsch^rermittelt wird.

der Fluorescsns-vlethode kann man die Systeme NAD —=*■ NADH quantitativ analysieren. Diese Systeme NAD NADH ^* können auch colorimetrisch oder durch Fluorescens-Analyse unter Verwendung von Resazurin oder Tetrazoliumchlorid durchgeführt werden, woüei der Wasserstoff in NADH überführt wird, so dass sich Resorzin oder Formazan in Anwesenheit von Diaphorase oder Phenazinmethosulfat bilden.

Die bei der Hydrolyse von Triglycerid entstehende Fettsäure kann in einfacher Weise mittels Heptan extrahiert werden, und man kann die Bestimmung durch Neutralisationstitration mittels Alkali unter Verwendung von Thymolblau als Indikator vornehmen.

ilan kann auch durch Zugabe einer Lösung von Phenolrot-Barbitalnfctrium in die Heptanschicht den Farbumschlag, der durch pH-Änderung infolge der Einwirkung von Phenolrot auf Fettsäurl^IS elef Kurvenänderum bei 570 m,u unter Verwendung von Standardvergleichskurven für Palmitinsäure bestimmen.

Eine weitere colorimetrische Bestimmung kann in der Weise durchgeführt werden, dass man eine Metallkomplex-Verbindung von Fettsäure, beispielsweise nach der Kupferseifen-Methode oder der Kobaltseifen-Methode, meßtechnisch ermittelt, oder ein Komplexsalz aus Fettsäure und Rhodamin 6G bzw. Rhodamin B quantitativ bestimmt.

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Wie bereits zuvor erwähnt, ist das erfindungsgemässe Verfahren im Vergleich mit den bisher bekannten Untersuchungsverfahren für Triglyceride sehr viel einfacher und weniger aufwendig durchführbar, da die Verseifung und die Nachbehandlung äusserst vereinfacht sind. Es ist lediglich eine milde enzymatische Behandlung erforderlich, und dies stellt einen erheblichen Vorteil für eine klinische Diagnose dar. Es entfällt ferner der bei den bekannten Untersuchungsmethoden vorhandene Nachteil, der darin bestand, dass die Verseifung unter Verwendung von starkem Alkali, das Korrosionserscheinungen an Behältnissen, Tuben und dergleichen, wie sie an automatisch arbeitenden Analysengeräten vorhanden sind, bewirkt. Es entfällt ferner der bei der bisher bekannten Acetylaceton- lethode erforderliche Zentrifugier-Vorgang, der insbesondere dann technisch schwierig ist, wenn die Triglycerid-Untersuchung autonatisch durchgeführt wird. Bisher war diese Zentrifugier-Zwischenstufe ein "Engpass" für die Automation dieses Untersuchungsverfahrens.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat darüber hinaus den Vorteil, dass eine kurzzeitige Arbeitsweise darstellt, die einfach durchführbar ist. So sind beispielsweise zahlreiche, nachstehend veranschaulichte Vorteile gegenüber der bekanrban Acetylaceton-*lethode (vergl. i.J. Eletcher; Clin.Chim.Acty 22, 393 (1968)) und gegenüber der enzymatischen Methode vorhanden:

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ACETYLACETON - METHODL· ERFINDUNGSGEMaSSE METHODE

Serum

Isopropanol-Extraktion (IO IUn.)

Mischen mit Absorbens (16 Min.)

Zentrifugieren (2000 UpM

15 Min.)

Verseifen
(KOH)

Oxidation
(H₁-JO₆)

(15 Min.)

Farbreaktion (Acetylaceton)

(40 Min.)

Kochen

(3 Min.)

Colorimetrische Untersuchung

Für die Gesamtuntersuchung erforderliche Zeit: 114 Min.

Serum

ATP-PEP-Lösung

PK-GK-Lösung 37°C (10 Min.)

LPL-Lösung

DNP-Hydrazin-hydrochlorid

(15 Min.)

NaOH

(20 Min.)

Prüfung bei 450 m ,u

aforderliche Gesamtzeit:

45 Hin.

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Beispiel 1

Be;: Zimmertemperatur wurde Linase, die aus einer Pseudomonas- Kultur (spez. Aktivität 50.000 Einheiten/g) gewonnen v/orden war, in 0,1 >·ο1 Phosphatpuffer oder Citratnuffer, pH 7,0, mit einer Konzentration von 500 - 1.000 Einheiten/ml, gelöst. Die Lösung wurde zur Aufbewahrung gefriergetrocknet. Bevor sie für die untersuchungszwecke lyophilisiert wurde, brachte man sie in eier gleichen Konzentration wieder in Lösung.

In zwei Teströhrchen wurden je 0,5 ml der zu untersuchenden Proben gegeben. Dazu wurden 0,5 ml an Pufferlösung ( pH 7,0) gegeben, und dann wurde 5 Minuten lang bei 37°C bebrütet. In eines der Teströhrchen wurden 0,5 ml an Fnzymlösung als Arbeitslösung hinzugefügt, und dem anderen Teströhrchen wurden als Kontrolluntersuchung 5 ml eines Stoppers, bestehend aus Isopropanol-n-IIeptan-2 η H-SO. (400 : 100 : 10 V/V%) beigegeben. Beide Röhrchen wurden unter Schütteln 10 Minuten bei 37 C bebrütet. Dann wurden 5 ml des Stoppers zu der Arbeitslösung hinzugegeben, und der Kontrollprobe wurden 0,5 ml Enzynlösung zugefügt, und danach wurde sofort gut durchgemischt. Schliesslich wurden sowohl der Arbeitslösung als auch der Kontrollprobe 3 ml n-IIeptan und 2 ml Wasser zugegeben, es wurde kräftig geschüttelt und dann einige Minuten stehen gelassen. Die oberen Heptan-Schichten wurden ?bninettiert und titrimetrisch oder colori™.etrisch untersucht.

Beispiel 2

(I) Reagentien:

Ls wurden für die Untersuchung die folgenden Reagentien zubereitet:

(1) ATP-Na 20 ng
PEP-2Na 50 ng

gelöst in 100 rü nit der nachstehend unter (4) angegebenen Pufferlösung.

(2) Pyruvat-Kinase 120 Einheiten
Glycerin-Kinase 500 Einheiten

gelöst in 100 ^l mit der nachstehend um. ei. (4) angegebenen Pufferlösung.

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(3) Lipase, erhalten aus eLiar Kultur von Pseudomonas, 25ΟΟ Einheiten cjelöst in 1OO ml mit der nachstehend an_pgebenen Pufferlösung.

(4) Pufferlösung:

0,05 Mole Phosphatpuffer, ph 7,2, worin 0,003 ^ole an Ilagneniumchlorid enthalten waren.

(5) 2,4-uinitrophenylhydrazin

gelöst in 1 η HCl-Lösung mit einer Konzentration von 0,02 Molen.

(II) Prüfung:

Probe (Blutserum) 0,05 ml

Lipase-Lösung 0,5 ml

ATP-PEP-Lösung 0,2 ml

Pyruvat-Kinase - Glycerin-Kinase- ■

Lösung O,O2 nl.

Die oben angegebene Probe und die Reagentien wurden miteinander vermischt und 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Dazu wurde 1,0 ml 2 ,'I-Dinitrophenylhydrazin-Kydrochioridlösung gegeben, und man liess das Gemisch 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen. Anschlies-3end wurden 5,0 ml an 0,6 η NaOH ~ Lösung hinzu gegeben. Wach weiteren 20 Minuten bei Zimmertemperatur wurde die Untersuchung bei 450 m,u durchgeführt.

Mittels der in Beispiel 2 beschriebenen untersuchungsinethode wurden 40 Einzel oestiinnungen von menschlichem Blutserum durchgeführt. Es wurden dabei die Acetylaceton-Methode und das erfindungsgemässe Verfahren mit der Enzym-Methode in Paralleluntersuchungen gleicher Proben durchgeführt. Aus den erhaltenen Versuchsergebnissen wurde ein Korrelationskoeffizient von r = 0,3 89 und eine Relationsgleichung y = 1,03 χ + 5,6 ermittelt. Die Ergebnisse sind in dem beiliegenden Diagramm graphisch veranschaulicht.

Beisniel 4

us ''urde wie in Beispiel 2 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde an-.stelle von aus Pseudomona.i-Kultur gewonnener lipase eine Lipase ein-

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- ίο -

gesetzt, die durch Züchtung von "ikxoorganisvten i.T "\rt ' ucor υ zw..
der Art Streptor.ycen gewonnen '-/orden x-'ar. Aus den Ergebnissen -urden Korrelationskoeffizienten von r = 0,97-j hzv/. o,9c3 ermitteLt.

Beispiel 5

L·s wurde wie in Beispiel 2 bescririeben gearbeitet, jedoch wurrlc- als Lipase eine solche verv/enclet, die durch Züchtung des UkroorcranisFu der Art Serratia gewonnen worden war. Die Untersuchungen wurden nit einen automatisch arbeitenden Analysator durch :!es.sung der

von iJ'ADH zu MAD bei 340 ni ,u durchgeführt.

2 6/0. t> -

Claims

ί> a \. ■.? η \ a η :3 η r i c h c

μ,^{1 7}.->ria^;ircn zur quanti tat i V3n r*3r;t i.» * 'un<i ^τόπ in I-lutnerum oder in (-<·■> · ,JX.-A lüGsig'voit enthaltener.. Tric/lvcfiri ο , .ladurc'i qekennzcichnot, ii.13'5 -las Triq3^vcori 1 nittels einer Lipo^rot «?i n-Lipase-Aktivii."it aufweisenden ioa;;e, dia au^? einen ''ikroor ianisinus der ArLe Pseuciononas, -lucoi , .Strepto iyces und/oder Scrratia gewonnen wird, hydrolysiert und I'iittsrure unJ Glycerin freigesetzt und mindestens eine der freigesetzten Komponenten analysiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als j-akroorganisnus der Art Pseudomonas einer der folgenden eingesetzt wi rd:

Pseudomonas fluorescens ΙΛΜ 105 7

Pseudononas schuylkxlliensis IAM 105 3

Pseudoiiionas saccherophila IAM 1504

Pseudoinonas aeruginosa IA'l 1095
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadixrca gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus der Art Mucor einer der folgenden eingesetzt wird: 'lucor hiemalis IAM 6088

*'ucor javanicus IAH 6108

!ucor flavus IAM 614 3

-iUcor circinelloides 1ΛΓΊ 614 8

"ucor mandschuricus IA^M 6118.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als .dkroorganismus der Art Streptom'Tes canar der folgenden eingesetzt wird:

Streptoniycei; a'n.:cf_tcienr, J.^:-? OD87

Strcpto/n/oeL; ^τ> η νη.· ΙΛΜ 0013
5. Verfahren y.ar.n _:n-5pruch 1, dadurch gekennzeichnet., da^s als ikroorganisnu , .'·,: Art Serratia einir der folgenden einqeretzt wird:

:.;rrratia marcc ~ ? ns ]Λ : 1065

■"erratia marrt «: nmf? 1."" 1OG7.

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