DE2804356C2 - Verfahren zur Hydrolyse von proteingebundenen Cholesterinestern - Google Patents

Description

Bei der Untersuchung von Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutserum, auf ihren Gehalt an Cholesterin, besteht die einleitende Verfahrensstufe in der Regel in einer Hydrolyse der vorhandenen Cholesterinester zu freiem Cholesterin.

Bei den üblichen bekannten Cholesterinester-Hydrolyseverfahren werden starke Basen (z. B. KOH und NaOH) verwendet, oder aus Gründen der Vereinfachung und Selektivität Hydrolaseenzyme (d. h. eine Cholesterinesterase). Das Arbeiten mit ätzenden Stoffen wie beispielsweise Alkalien ist bekanntlich unvorteilhaft und nicht wünschenswert, wohingegen enzymatische Verfahren zwar für die Hydrolyse von "freien" Cholesterinestern geeignet sein können, d. h. solchen, die nicht an Protein gebunden sind, wohingegen diese enzymatischen Verfahren ineffektiv oder vergleichsweise wenig wirksam sind, wenn es gilt an Proteine gebundene Cholesterinester zu hydrolysieren. Die Bindung des Esters an ein Protein inhibiert ganz offensichtlich die Einwirkung der Esterase, weshalb ein Hilfsmittel erforderlich ist, um den Protein-Esterkomplex aufzuspalten, bevor das Enzym auf den Ester einwirken kann.

Verfahren zur Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern im Zusammenhang mit der Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes in einem wäßrigen Medium unter Einsatz von Enzympräparaten mit Cholesterinesterhydrolase-Aktivität und unter Zusatz von oberflächenaktiven Mitteln sind bekannt (vgl. DE-OS 23 15 501, DE-OS 24 09 696, DE-OS 24 39 348 und DE-OS 25 09 156).

Aus der DE-OS 24 09 696 ist bekannt, daß man oberflächenaktive Substanzen bei der Bestimmung von Cholesterin einsetzen kann. Solche oberflächenaktiven Mittel, wie bevorzugt Dinatriumsalze der Chol-, Glykochol-, Taurochol- und Taurodioxycholsäure dienen als löslich machendes Mittel für freies Cholesterin sowie als Co-Faktoren für Cholesterinesterhydrolase.

Aus der DE-OS 24 39 348 ist ein diagnostisches Mittel zum Nachweis und zur Bestimmung von Cholesterin und Cholesterinestern in Körperflüssigkeiten bekannt. Bei diesem Mittel sind die Reagentien (u. a. Cholesterinhydrolase und Cholesterinoxidase) auf einem saugfähigen Träger imprägniert, der in einem Kunststoffilm eingebettet ist und es ist ein oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von 2 bis 30% der festen Reagentien enthalten. Als brauchbares nichtionisches oberflächenaktives Mittel wird auch der Polyoxyäthylen- Alkylaryläther mit ca. 5 bis 20 Oxyäthylengruppen genannt.

Die Erfindung betrifft nicht ein Verfahren, bei dem die Hydrolyse in unmittelbarer Gegenwart einer Cholesterinoxidase durchgeführt wird.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß proteingebundene Cholesterinester in einer vergleichsweise kurzen Zeitspanne einer Größenordnung von weniger als 10 Minuten (vorzugsweise in etwa 5 Minuten) hydrolysiert werden können, wenn man die proteingebundenen Cholesterinester mit einer verträglichen Mischung aus einem Lipasepräparat mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette mit weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten in Kontakt bringt, wobei das Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des wäßrigen Mediums, vorliegt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Hydrolyse von proteingebundenen Cholesterinestern, wie es in den Ansprüchen 1 bis 7 näher erläutert wird.

Wie im Vorstehenden erörtert, gibt es Enzympräparate, welche die Hydrolyse von freiem Cholesterin katalysieren. Diese Präparate katalysieren jedoch die Hydrolyse von Cholesterinestern, die an Proteine gebunden sind, wie sie beispielsweise im Blutserum vorkommen, nur in sehr geringem Umfange oder unvollständig. Die Ursache hierfür ist ganz offensichtlich wenigstens zum Teil auf den Protein-Lipidkomplex zurückzuführen, der das Enzym daran hindert, die Hydrolyse in üblicher Weise zu katalysieren. In der Literatur wird die Verwendung von als "Effektoren" bezeichenbaren Substanzen vorgeschlagen, d. h. Verbindungen, welche die Geschwindigkeit erhöhen, mit der Lipase-Materialien Protein-gebundene Cholesterinester zu hydrolysieren vermögen. Obgleich der Mechanismus, nach dem derartige Verbindungen wirken, noch nicht restlos geklärt ist, wird doch angenommen, daß sie den Ester-Proteinkomplex in gewisser Weise aufzuspalten vermögen und den Ester für die Hydrolyse in üblicher Weise "befreien". So wurden beispielsweise für diesen Zweck Proteaseenzyme vorgeschlagen.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bestimmte oberflächenaktive Verbindungen Effektoren darstellen und anstelle von Protease verwendet werden können, um Enzympräparate in wirksame Hydrolysier-Reagenzien für Protein-gebundene Cholesterinester zu überführen, die normalerweise nicht in der Lage wären die Hydrolyse von Protein-gebundenen Cholesterinestern zu katalysieren oder die eine solche Hydrolyse lediglich mit unerwünscht niedrigen Reaktionsgeschwindigkeiten zu katalysieren vermögen. Da des weiteren Protease dazu neigt Bindemittel auf Proteinbasis, wie beispielsweise Gelatine, abzubauen, die zur Herstellung mehrschichtiger Elemente verwendet werden, die wiederum für die Bestimmung bestimmter Substanzen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der BE-PS 801 742 beschrieben werden, eignen sich die erfindungsgemäß verwendbaren Mischungen insbesondere für die Herstellung derartiger analytischer Elemente.

Erfindungsgemäß verwendbare Enzympräparate sind solche, die eine Hydrolaseaktivität gegenüber freien (d. h. nichtproteingebundenen) Cholesterinestern aufweisen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei Lipasepräparate erwiesen, die eine derartige Aktivität aufweisen.

Ein geeignetes Auswahlverfahren für die Bestimmung der Cholesterinesterhydrolase (Esterase)-Aktivität eines Enzympräparates, insbesondere eines Lipasepräparates besteht darin, eine bestimmte Menge des Enzympräparates zu einer standardisierten Cholesteryllinoleatlösung eines pH-Wertes von 7,0 zuzugeben, die Mischung bei 37°C unter Stickstoff 2 Stunden lang zu inkubieren und die Estermenge zu bestimmen, die in der Lösung verblieben ist, und zwar unter Anwendung der Hydroxylamin-Methode, die von J. Vonhoeffmyr und R. Fried in der Zeitschrift Z. Klin. Chem. U. Klin. Biochem., 8 (1970), 134 beschrieben wird. Nach dieser Methode wird jedes Präparat, das eine Cholesterinesteraseaktivität aufweist, die über etwa 25 mg/dl Cholesterin in dem Auswahlverfahren freisetzt, als geeigneter Kandidat für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angesehen.

Geeignete Enzympräparate für die Cholesterinesterhydrolyse können pflanzlichen wie auch tierischen Ursprungs sein. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von mikrobiologischen Präparaten erwiesen, beispielsweise von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum, und zwar in roher als auch gereinigter Form. Andere vorteilhafte Enzympräparate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung werden beispielsweise in den US-PS 2 888 385, 3 168 448, 3 189 529, 3 262 863 und 3 513 073 beschrieben.

Besonders vorteilhafte, im Handel erhältliche Enzympräparate für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind Weizenkeim- Lipasepräparate, beispielsweise der Firma Miles Laboratories of Elkhart, Indiana, USA, das Präparat Lipase 3000 von der Firma Wilson Laboratories, das Präparat Steapsin von der Firma Sigma Chemical Company (bei den beiden zuletzt genannten Präparaten handelt es sich um pancreatische Enzyme) und das Präparat Lipase M (von Candida rugosa) von der Firma Enzyme Development Company, USA.

Gewisse oberflächenaktive Verbindungen inhibieren die Cholesterinesterase- Aktivität von bestimmten Enzympräparaten. Infolgedessen ist es wichtig, daß bevor ein Enzympräparat mit einer oberflächenaktiven Verbindung kombiniert wird, die Verträglichkeit der beiden Komponenten miteinander festzustellen. Die Verträglichkeit läßt sich in vorteilhafter Weise nach dem in folgenden beschriebenen Verfahren ermitteln.

Eine Mischung eines Enzympräparates und einer oberflächenaktiven Verbindung, die den im folgenden beschriebenen Testbedingungen genügt, wird hier als verträgliche Mischung bezeichnet, wobei jede Komponente der Mischung mit der anderen Komponente verträglich ist.

Hydrolysepräparate der Erfindung sind durch Testverfahren gekennzeichnet, das in dem später folgenden Vergleichsbeispiel beschrieben wird.

Die zu untersuchende oberflächenaktive Verbindung wird normalem menschlichen Serum zugesetzt. Eine Probe des zu untersuchenden Enzympräparates wird dann zugesetzt, worauf die Mischung etwa 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird. Dann werden gleiche Teile (0,1 ml) der Lösung mit Wasser auf 1,9 ml verdünnt und 10 Minuten lang in ein siedendes Wasserbad gebracht. Cholesterin wird in einem Gesamtvolumen von 1,2 ml nach dem bekannten Cholesterinoxidase-Betimmungsverfahren bestimmt. Gleichzeitig wird ein entsprechender Vergleichs-"Test"- durchgeführt, bei dem lediglich das Enzympräparat ohne die oberflächenaktive Verbindung getestet wird.

Die bevorzugten Enzympräparate bewirken eine Hydrolyse von mindestens 70% der verfügbaren Cholesterinester in weniger als 10 Minuten. Besonders vorteilhaft sind solche Präparate, die zu einer noch weitgehenderen und praktisch vollständigen Hydrolyse führen, d. h. einer Hydrolyse von mindestens etwa 90% der verfügbaren Cholesterinester in weniger als etwa 10 Minuten.

Aus Versuchen dieses Typs ergab sich, daß Phenoxypolyäthoxyäthanole besonders überlegene Effektoren sind.

Wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt, bewirken Verbindungen ähnlicher Struktur nicht die erfindungsgemäß erzielbare vorteilhafte Hydrolyse.

Als besonders vorteilhafte Verbindungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens haben sich solche erwiesen, deren Alkylreste entweder 8 oder 9 Kohlenstoffatome aufweisen.

Wie in den später folgenden Beispielen gezeigt werden wird, führen oben erwähnte oberflächenaktive Verbindungen des Standes der Technik nicht zu einer praktisch verwendbaren starken Dissoziation, wenn sie mit Enzympräparaten kombiniert werden. Zu diesen nicht geeigneten oberflächenaktiven Verbindungen gehören beispielsweise die Hydroxypolyäthoxydodecane, wie sie beispielsweise aus der FR-PS 2 223 696 und der US-PS 3 925 164 bekannt sind. (In der später folgenden Tabelle I sind Beispiele für geeignete Hydrolysepräparate zusammengestellt.)

Die Konzentration der Enzympräparate und oberflächenaktiven Verbindungen in den erfindungsgemäß verwendbaren verträglichen Mischungen kann sehr verschieden sein. Die im Einzelfalle optimale Konzentration kann von verschiedenen Faktoren abhängen, wie beispielsweise der Reinheit der Enzympräparate, der Aktivität der Enzympräparate, der Natur des gebundenen Cholesterinesters, der im Einzelfalle verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und dergleichen. Ganz allgemein jedoch hat sich gezeigt, daß vorteilhafte Ergebnisse dann erhalten werden, wenn die Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung bei etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des wäßrigen Mediums, liegt.

Die Konzentration des Enzympräparates kann ebenfalls verschieden sein. Als besonders vorteilhaft haben sich Konzentrationen von etwa 10 bis etwa 80 mg Enzympräparat pro ml wäßrigen Mediums oder analytischer Lösung erwiesen, beispielsweise dann, wenn handelsübliche Präparate verwendet werden.

Vorteilhaft wird im Rahmen eines Verfahrens zur Bestimmung von Gesam-Cholesterin das Hydrolysepräparat oder Hydrolysereagens in der Ausbreitschicht eines analytischen Elementes untergebracht, während getrennt davon ein Bestimmungssystem oder Bestimmungsreagens für die Bestimmung von Cholesterin, beispielsweise eine Cholesterinoxidase und ein Indikator, der auf Wasserstoffperoxid anspricht, in der Reagens-Schicht untergebracht wird.

Vergleichsbeispiel

Es wurden direkte Vergleichsteste mit einer Cholesterinesterase von Candida rugosa und (a) einer oberflächenaktiven Verbindung wie in der FR-PS 2 223 696 beschrieben und (b) erfindungsgemäß verwendbaren oberflächenaktiven Verbindungen durchgeführt.

Es wurden Inkubierungsmischungen hergestellt, die in einem Gesamtvolumen von 0,6 ml enthielten:

0,5 ml normales menschliches Serum
20 mg Cholesterinesterase (handelsübliche Lipase M von Candida rugosa)
5 µMole Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert=7,0)
10 mg eines Effektors.

Die Umsetzung erfolgte innerhalb von 10 Minuten bei 37°C, worauf 0,1 ml Anteile zu 1,9 ml Wasser zugegeben wurden. Die Mischungen wurden dann 10 Minuten lang in ein siedendes Wasserbad gebracht. Das Cholesterin wurde dann quantitativ unter Verwendung des Cholesterinoxidase- Peroxidasesystems bestimmt, und zwar unter Verwendung von wäßrigen Cholesterin-Standardlösungen zur Herstellung einer Vergleichskurve. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle

Aus der Tabelle ergibt sich, daß die aus der FR-PS 2 223 696 bekannten Polyoxyäthylenlauryläther, keine wirksamen Effektoren im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind.

Claims (7)

1. Verfahren zur Hydrolyse von proteingebundenen Cholesterinestern,
dadurch gekennzeichnet, daß man proteingebundene Cholesterinester in einem wäßrigen Medium mit einer verträglichen Mischung aus einem Enzympräparat mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität und einem Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol mit einer Polyoxyäthylenkette von weniger als etwa 20 Oxyäthyleneinheiten in Kontakt bringt, wobei das Alkylphenoxypolyäthoxyethanol in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des wäßrigen Mediums, vorliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Blutserum vorliegenden proteingebundenen Cholesterinester hydrolysiert und demzufolge als wäßriges Medium Blutserum verwendet.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzympräparat ein Esterasepräparat mikrobiologischen oder tierischen Ursprungs verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Esterasepräparat mikrobiologischen Ursprungs von Candida rugosa, Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum oder Rhizopus arrhizus verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterasepräparat eine pancreatische Esterase verwendet.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Alkylphenoxyäthanol mit etwa 7 bis etwa 13 Äthoxyeinheiten verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol Octylphenoxypolyäthoxyäthanol verwendet.