DE2724758B2 - - Google Patents

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Description

Die quantitative Bestimmung von Mono-, Di- und insbesondere von Triglyceriden in Körperflüssigkeiten von Tieren und Menschen wird bei der klinischen Diagnose vieler Krankheiten oder Störungen, wie Artherosklerose, Diabetes mellitus, Nephrose, Gallenundurchgängigkeit bzw. Gallenverschlüsse, oder verschiedener metabolischer Schädigungen bzw. Störungen, die auf endokrine Störungen zurückzuführen sind, verwendet. Bei der klinischen Analyse ist es im allgemeinen erforderlich, daß der Glycerinester zuerst unter Freisetzung von Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert wird. Verschiedene Verfahren, wie die Spektrophotometrie, werden dann zur Bestimmung der Menge an Glycerin oder Fettsäuren, die bei der Hydrolyse freigesetzt werden, verwendet.
Bis vor kurzem wurden bei den Verfahren, die zur Hydrolyse von Triglyceriden in einer Körperflüssigkeit verwendet werden, entweder die Glycerinester mit starker alkalischer Lösung, wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, gespalten, oder es wurde ein Umesterungsmittel verwendet. Bei diesen Verfahren ist eine mühevolle und zeitraubende Abtrennung der Lipide aus anderen Serumbestandteilen vor der Hydrolyse erforderlich, und sie sind für eine schnelle, routinemäßige, klinische Analyse ungeeignet. Vor kurzem wurden enzymatische Verfahren für die Hydrolyse von Serum-Triglyceriden entwickelt. Trotz der Eignung der enzymatischen Verfahren, verglichen mit älteren Verfahren, ist eine Reihe von Schwierigkeiten verblieben.
Die erste Lipase, die bei der Hydrolyse von Serum-Triglyceriden versucht wurde, war Pankreas-Lipase, die aus Säugetierpankreas isoliert wurde. Es wurde gefunden, daß dieses Enzym nicht zufriedenstellend ist, da es die Serum-Triglyceride in einer vernünftigen Zeitdauer nicht vollständig hydrolysieren kann. In der
US-PS 37 59 793 wird die Verwendung einer Lipase, die
aus dem Schimmelpilz Rhizopu? arrhizus (R. arrhizus) isoliert wird, für die Hydrolyse von Serum-Triglyceriden beschrieben. Das freie Glycerin wird dann nach einer Reihe enzymatischer Reaktionen bestimmt Dieses . Verfahren besitzt eine Reihe von Nachteilen. Eine große Menge an hochgereinigter R. arrhizus-Lipase (280 Einheiten Lipase für die Hydrolyse der Triglyceride in einer 10 μΐ Serumprobe) ist zur vollständgen Hydrolyse der Serum-Triglyceride erforderlich. Die Mengen, die an gereinigter R. arrhizus-Lipase erforderlich sind, bewirken, daß dieses Verfahren so teuer wird, daß es für routinemäßige klinische Analysen ungeeignet ist Weiterhin ist das System für ein einstufiges Analysenverfahren nicht geeignet
In der US-PS 37 03 591 wird die Verwendung eines Gemisches aus einer Lipase, bevorzugt einer mikrobiellen Lipase, mit einer Protease für die Hydrolyse von Serum-Triglyceriden beschrieben. Die Reinheit der Lipase hat auch weiterhin einen wesentlichen Einfluß auf die Wirksamkeit der Hydrolyse. In der US-PS 38 62 009 wird angegeben, daß die hydrolytische Wirksamkeit von R. arrhizus-Lipase verbessert werden kann, wenn man die Verseifung in Anwesenheit einer Carboxyl-Esterase und eines Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-alkylsulfats durchführt In der US-PS 38 98 130 wird ein Verfahren zur schnellen Hydrolyse von Triglyceriden unter Verwendung eines Gemisches aus Pankreas-Lipase, einer mikrowellen Lipase und einem Gallensalz beschrieben. Damit das Verfahren wirksam arbeitet, sind alle drei Komponenten wesentlich.
Aus der Veröffentlichung von G. Bucolo und H. David in Clinical Chemistry 19/5, 476-482 (1973) ist ein
!■> Verfahren zur Bestimmung von Serumtriglycrideii bekannt bei dem eine enzymatische Hydrolyse der Triglyceride unter Verwendung einer Mischung einer mikrowellen Lipase (R. delemar Lipase) und einer Protease (ct-Chymotripsin) durchgeführt wird.
■to Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz für die Hydrolyse eines Glycerinesters in wäßrigem Medium enthaltend Rhizopus arrhizus-Lipase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Gemisch aus 15 bis 95 Einheiten Rhizopus arrhizus-Lipase und 5 bis 85
■f) Einheiten Candida cylindracea-Lipase pro 100 Einheiten an gesamter, vorhandener Lipase enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Reagenz nach der Erfindung ein Gemisch aus 35 bis 80 Einheiten R. arrhizus-Lipase und 20 bis 65 Einheiten C.
w cylindracea-Lipase. Solche Gemische ermöglichen die schnellste Hydrolyse.
Überraschenderweise hat die Kombination der Lipasen aus R-arrhizus und C. cylindracea eine synergistische Wirkung, mit der viele der Nachteile, die
« den bekannten Verfahren anhaften, beseitigt werden können. Bei der Verwendung des Gemisches aus den genannten Lipasen kann man die Glycerinester, die in wäßrigem Medium vorhanden sind, unter Verwendung relativ geringer Mengen von leicht verfügbaren Lipasen
fco mit technischer Qualität vollständig hydrolysieren. Die Erfindung ermöglicht weiterhin zum ersten Mal, daß ein einziges Reagenz für die colorimetrische Bestimmung von Serum-Triglyceriden verwendet werden kann und daß Serum-Triglyceride in klinischen Laboratorien in
b5 einfacher, zweckdienlicher, billiger und schneller Weise bestimmt werden können.
Die Erfindung umfaßt deshab auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes zur Hydrolyse eines
Glycerinesters in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0.
Das Reagenz nach der Erfindung dient zur Untersuchung von wäßrigen Körperflüssigkeiten, die Mono-, Di- oder Triglyceride enthalten. Die Körperflüssigkeit kann ein Extrakt, wie aus Gewebehomogenat, sein oder sie kann eine Körperflüssigkeit, wie Blut, Serum, Plasma, lymphatische Flüssigkeit oder cerebrospinale Flüssigkeit, sein.
Die Erfindung kann zusammen mit irgendeinem der bekannten Verfahren für die quantitative Bestimmung der vorhandenen Menge an Glycerin oder Fettsäuren verwendet werden, oder sie kann als Teil eines einzigartigen colorimetrischen Systems verwendet werden, das hier beschrieben wird. Die Erfindung ist besonders nützlich, wenn sie als einstufige colorimetrische Analyse für Serum-Triglyceride verwendet wird.
In den beigefügten Zeichnungen ist die synergistische Wirkung eines Gemisches aus R-arrtüzus- und C. cylindracea-Lipasen mit unterschiedlichen Anteilen an Lipasen in dem Gemisch in F i g. 1 dargestellt.
In F i g. 2 ist die Wirkung verschiedener Konzentrationen der individuellen Lipasen dargestellt, verglichen mit der Hydrolyse, die man mit einer synergistischen Zusammensetzung aus beiden Lipasen erhält.
Die optimale Hydrolyse der in einem wäßrigen Medium vorhandenen Triglyceride tritt auf, ■ enn das Verhältnis von Candida cylindracea zu Khizopus arrhizus 0,8 bis 1,0 beträgt.
Bei der Hydrolyse von Triglyceriden, die in einer 25 μΙ Probe von Menschenserum vorhanden sind, wurde gefunden, daß ein Gemisch aus 70 Einheiten R. arrhizus-Lipase zu 64 Einheiten C. cylindracea-Lipase optimale Ergebnisse bei 37°C und einem pH-Wert von 7,6 ergibt
Der genaue Anteil der einzelnen Lipasen in dem erfindungsgemäßen Reagenz wird etwas variieren, abhängig von der besonderen, gewünschten Anwendung. Wenn z. B. der pH-Wert der Reaktion geändert wird, werden sich die optimale Menge der Lipasen wie auch ihr Verhältnis in der Zusammensetzung ändern. Wenn eine schnellere Reaktion ablaufen soll, kann die Menge an vorhandener Lipase einfach erhöht werden. Ähnlich kann, wenn eine längere Inkubationszeit gewünscht wird, die Menge an Lipasen, die zur Hydrolyse der Triglyceride erforderlich ist, vermindert werden. Eine Einheit der Lipaseaktivität ist die Menge an Fettsäure, die durch 1 μΜοΙ Natrium- oder Kaliumhydroxid in 1 min bei 25°C und einem pH-Wert von 8,1 für C. cylindracea-Lipase und bei einem pH-Wert von 8,9 für R. arrizus-Lipase neutralisiert wird.
Als zusätzliche Bestandteile kann das Reagenz nach der Erfindung in einer bevorzugten Ausfüh-ungsform Adenosin-5'-triphosphat, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, ein Tetrazoliumsalz, Glycerokinase, «-Glycerinphosphat-dehydrogenase und Diaphoi ase enthalten.
Die enzymatische Hydrolyse wird unter Verwendung des erfindungsgemäßen Lipasereagenzes innerhalb eines pH-Bereiches von 5,5 bis 9,O durchgeführt Das zu untersuchende wäßrige Medium ist bevorzugt Serum. Der optimale pH-Wert für die Bestimmung der vorhandenen Triglyceride wird von dem besonderen Schema abhängen, das zur Durchführung der Analyse von Glycerin oder den Fettsäuren, die während der Hydrolyse freigegeben werden, verwendet wird. Die erfindungsgemäße Verwendung kann leicht an eine
ίο Reihe analytischer Verfahren angepaßt werden. Die Inkubation kann bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 45° C durchgeführt werden. Bevorzugt wird eine Temperatur von 35 bis 37° C verwendet Bei Temperaturen über 45° C wird das Enzym zerstört
Die erforderliche Inkubationszeit wird von dem pH-Wert der Medien, der Probengröße, der Inkubationstemperatur und dem Verhältnis und der Menge an verwendeter Lipase abhängen. Im allgemeinen wurde gefunden, daß eine Inkubationszeit von 7 bis 10 min eine vollständige Hydrolyse bei einem pH-Wert von 7,6 und einer Temperatur von 37° C ergibt, wenn 70 Einheiten R.
arrhizus-Lipase und 64 Einheiten C. cylindracea-Lipase mit 20 bis 40 μΐ Menschenserum vermischt werden.
Für die Bestimmung des während der Hydrolyse der Glyceride freigesetzten Glycerins sind verschiedene Verfahren verfügbar. Bei einem Verfahren wird das Glycerin zur Umwandlung von Adenosin-triphosphat in Adenosin-diphosphat in Anwesenheit von Glycerokinase verwendet. Das Adenosindiphosphat wird dann zur
M) Umwandlung von Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat verwendet. Verfolgt man die Abnahme in der Absorption, die sich ergibt, wenn Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid zu der oxydierten Form in Anwesenheit von Pyruvat überführt wird, so kann das Glycerin, das in dem
r> Medium vorhanden ist, bestimmt werden. Ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Glycerin, die in dem Medium vorhanden ist, das zusammen mit der oben beschriebenen Lipasezusammensetzung verwendet wird unter Bildung eines einstufigen, colorimetrisehen Verfahrens, verwendet die Umwandlung von Glycerin in Glycerin-1-phosphat durch Adenosin-5'-triphosphat, das im folgenden als ATP bezeichnet wird, zur Erzeugung von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, das im folgenden als NADH bezeichnet wird.
4> aus der oxydierten Form, die im folgenden als NAD bezeichnet wird. Das NADH wird dann zur Reduktion des Tetrazoliumsalzes zu dem reduzierten Chromophoren verwendet. Normalerweise ist das verwendete Tetrazoliumsalz 2-p-]odphenyl-3-nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid (JNT). Dieses Verfahren ist vorteilhaft, da die Bildung des Chromogens mit einem an sich bekannten, klinischen Colorimeter verfolgt werden kann. Bestimmt man die Menge an gebildeter Farbe, so kann die Menge an vorhandenem Glycerin bestimmt
■>5 werden. Die allgemeine Reaktionssequenz wird durch die folgenden Gleichungen zusammengefaßt.
Glycerokinase
(I) Glycerin + ATP Glycerin-1-phosphat + ADP
(II) Glycerin-l-phosphat + NAD;
i-Cilycerinphüsphatdehydrogenasc
=± Dihydroxyacctonphospnat + NADII
Dhphorase
(111) NADII + JNT NAD + reduziertes JNT (Chiomophor)
Die Menge an Farbe, die sich bei der obigen Reaktionssequenz bildet, ist direkt proportional zu der Glyceridkonzentration, wenn die Hydrolyse mit dem erfindungsgemäßen Reagenz durchgeführt wurde.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Eine für die colorimetrische Bestimmung von Triglyceriden in menschlichem Serum geeignete Reagenzzusammensetzung enthält die folgenden Bestandteile in 1 ml Pufferlösung mit einem auf 7,6 eingestellten pH-Wert und enthält 1 mMol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS).
Magnesiumchlorid 0,6 mg
Adenosin-5'-triphosphat 1,8 mg
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid
(NAD) 2-(p-Indophenyl)-3-p-nitrophenyl-
5-phenyltetrazoliumchlorid 0,25 mg
Diaphorase 5,52 Einheiten
Glycerin-Kinase 0,92 Einheiten
Λ-Glycerinphosphat-dehydrogenase 13,8 Einheiten
Lipase von Rhizopus arrhizus 70 Einheiten
Lipase von Candida cylindracea 64 Einheiten
Natriumchlorid 0,1 mMol
Calciumchlorid 0,005 mMol
Äthylendiamin-tetraessigsäure
(EDTA) 0,0005 mMol
15
20
25
Tabelle I Serumprobe Triglyceridkonzentrationen (mg/di) Chemische Enzymatische Hydrolyse Hydrolyse
Serumprobe Triglyceridkonzentrationen (mg/dl)
Chemische Enzymatische
Hydrolyse Hydrolyse
Menschenserum mit einer Triglyceridkonzentration von etwa 560 mg/dl wird nach zur Zeit verwendeten chemischen Verseifungsverfahren bestimmt, wobei man das Reagens von Beispiel 1 für die Analyse verwendet, ausgenommen, daß die Lipase von R. arrhizus von 0 bis 140 Einheiten/Versuch variiert wurde. Die Probengröße beträgt bei jedem Test 25 μΐ. Das allgemeine Analysenverfahren ist in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt Bei den Bedingungen dieses Versuchs zeigen die Ergebnisse an, daß mit 64 Einheiten C. cyündracea-Lipase/Test eine vollständige Hydrolyse in 10 min erreicht werden, wenn 70 Einheiten R. arrhizus-Lipase vorhanden sind.
313 313
305 305
691 681
23 23
151 161
347 343
404 418
Beispiel 2
Die ersten neun der obigen Bestandteile werden in einem lyophilisierten Gemisch zur Erhöhung der Stabilität vereinigt Die restlichen drei Bestandteile werden in dem TRIS-Puffer gelöst
Das allgemeine Verfahren zur Durchführung der Triglyceridbestimmung in Menschenserum in den folgenden Beispielen ist wie folgt
Das vorstehend beschriebene Reagenz wird etwa 5 min bei 37° C erhitzt und 25 μΐ Serum werden zugegeben. Das Serumgemisch wird etwa 10 min inkubiert und dann aus der Wärmequelle entfernt Das Endvolumen der Probe wird mit 0,05 η Chlorwasserstoffsäure auf 3 ml eingestellt Ablesungen erfolgen an einem Spektrophotometer oder einem Colorimeter, das auf eine Wellenlänge von 500 nm eingestellt wurde. Die sich bildende Farbe ist direkt proportional zu der Triglyceridkonzentration.
Die Proben von menschensera mit einem weiten Bereich an Triglyceridkonzentrationen werden unter Verwendung an sich bekannter chemischer Hydrolysen mit Natriumhydroxid in Methanol analysiert Die gleichen Proben werden unter Verwendung der enzymatischen Zusammensetzung und des Verfahren, die oben beschrieben wurden, analysiert Ein Vergleich der Ergebnisse, die man nach den beiden Verfahren erhält, ist in Tabelle I aufgeführt- Die Ergebnisse zeigen, daß die Hydrolyse von Triglyceriden in den Seraproben mit der Lipasezusammensetzung vergleichbar mit der Hydrolyse ist, die durch Verseifung erhalten wurde.
Tabelle II % Hydrolyse
Rhizopus arrhizus-
Lipasekonzentration
Einheiten/Test 14,8
0 22,8
3,5 30,8
7,0 85,9
17,5 97,0
35,0 100,0
70,0 100,0
140,0
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird das gleiche Verfahren wie ir Beispiel 2 verwendet, ausgenommen, daß die Konzentration an C. cylindracea-Lipase von 0 bis 64 Einheiten/Test variiert wird, während die R. arrhizus-Lipasenkonzentration konstant bei 70 Einheiten/Tesi gehalten wird. Aus den Ergebnissen der Tabelle HI is) erkennbar, daß eine vollständige Hydrolyse vor Triglyceriden erreicht wird, wenn 64 Einheiten C cylindraeca-Lipase in der Reagenzzusammensetzung vorhanden sind.
Tabelle ΠΙ
60
65 Candida cylindracea-Lipasekonzentration,
Einheiten/Test
% Hydrolyse
1 134 128
2 63 62
3 215 234
0 33,7
2,1 65,8
6,4 83,3
10,7 92,8
21,4 95,4
42,8 97,9
64,0 100,0
Die Werte der Tabellen I und II sind graphisch in Fig. 1 zusammengefaßt. Die verschiedenen Lipasekonzentrationen sind als Einheiten von R. arrhizus- und C. cylindracea-Lipase/lOO Einheiten Gesamtlipasegemisch ausgedrückt. Die theoretische Aktivtät der verschiedenen Lipasegemische, wenn kein Synergismus beobachtet wurde, ist als gestrichelte Linie auf der Zeichnung dargestellt.
Vergleichsversuch A
Unter Verwendung des oben allgemein beschriebenen Verfahrens wird eine Reagenzzusammensetzung, die ähnlich wie die von Beispiel 1 ist, ausgenommen, daß keine C. cylindracea-Lipase vorhanden ist und daß verschiedene Konzentrationen an R. arrhizus-Lipase verwendet werden, werden die Trigiyceride, die in einer Serumprobe vorhanden sind, die etwa 530 mg/dl Trigiyceride enthält, hydrolysiert. Die Ergebnisse sind
graphisch in Fig. 2 dargestellt. Die Werte zeigen an, daß ohne vorhandene C. cylindracea-Lipase die R. arrhizus-Lipase auf das lOfache, d h. bis zu 700 Einheiten, erhöht werden kann, ohne daß eine vollständige Hydrolyse der Trigiyceride erhalten wird.
Vergleichsversuch B
Das Verfahren von Vergleichsversuch A oben wird mit verschiedenen Konzentrationen an C. cylindracea-Lipase, das in dem Reagens vorhanden ist, wiederholt. Es ist keine R. arrhizus-Lipase vorhanden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die ebenfalls graphisch in F i g. 2 dargestellt sind, zeigen, daß ohne in dem Gemisch vorhandene R. arrhizus-Lipase eine 5fache Erhöhung in der C. cylindracea-Lipasekonzentration, d. h. bis zu 320 Einheiten, weniger als 20% der vorhandenen Trigiyceride hydrolysiert.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Reagenz für die Hydrolyse eines Glycerinesters in wäßrigem Medium enthaltend Rhizopus arrhizus-Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gemisch aus 15 bis 95 Einheiten Rhizopus arrhizus-Lipase und 5 bis 85 Einheiten Candida cylindracea-lipase pro 100 Einheiten an gesamter, vorhandener Lipase enthält
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gemisch aus 35 bis 80 Einheiten Rhizopus arrhizus-Lipase und 20 bis 65 Einheiten Candida cylindracea- Lipase pro 100 Einheiten an gesamter, vorhandener Lipase enthält
3. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Candida cylindracea-Lipase zu Rhizopus arrhizus-Lipase 0,8 bis 1,0 beträgt.
4. Reagenz nach Anspruch I, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet daß es zusätzlich Adenosin-5'-triphosphat, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, ein Tetrazoliumsalz, Glycerokinase, oc-Glycerinphosphatdehydrogenase und Diaphorase enthält
5. Verwendung des Reagens nach Anspruch 1 zur Hydrolyse eines Glycerinesters in wäßrigem Medium bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium Serum ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1030436A (en) * 1974-03-20 1978-05-02 William S. Stavropoulos Method for determination of triglycerides and glycerol
US4245041A (en) * 1977-12-07 1981-01-13 American Monitor Corporation Triglycerides assay and reagents therefor
US4264589A (en) * 1978-12-20 1981-04-28 Felts James M Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system
JPS5584397A (en) * 1978-12-20 1980-06-25 Ajinomoto Kk Fat and oil ester exchange using lipase
US4178285A (en) * 1978-12-20 1979-12-11 Felts James M Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system
FR2449726A1 (fr) * 1979-02-22 1980-09-19 Millipore Corp Composition a base de lipases bacteriennes et son application a l'hydrolyse et au dosage d'un ester de glycerol
US4394445A (en) * 1979-02-22 1983-07-19 Nix Paul T Enzymatic glyceride hydrolysis
US4259440A (en) * 1979-05-21 1981-03-31 Miles Laboratories, Inc. Hydrolysis and assay of triglycerides
US4309502A (en) * 1980-06-30 1982-01-05 Beckman Instruments, Inc. Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein
US4338395A (en) * 1980-07-21 1982-07-06 Technicon Instruments Corporation Method for the analysis of triglycerides
DE3211167A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten
US4555483A (en) * 1982-08-11 1985-11-26 Eastman Kodak Company Methods, compositions and elements for the determination of lipase
US5273898A (en) * 1986-10-17 1993-12-28 Noro Nordisk A/S Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida
ATE117018T1 (de) * 1986-10-17 1995-01-15 Novo Nordisk As Positionsmässig nicht spezifische lipase von candida-arten; verfahren für ihre herstellung und ihre verwendung.
JP2647684B2 (ja) * 1988-04-15 1997-08-27 旭化成工業株式会社 トリグリセリドの分析用試薬および分析方法
US5616215A (en) * 1991-04-19 1997-04-01 Novo Nordisk A/S Method of making paper from pulp treated with lipase and an aluminum salt
WO2006072256A2 (en) * 2005-01-10 2006-07-13 Novozymes A/S Process for the production of fatty acid alkyl esters from triglycerides and alcohols employing mixtures of two lipolytic enzymes
US9458476B2 (en) * 2011-04-18 2016-10-04 R.J. Reynolds Tobacco Company Method for producing glycerin from tobacco
US9010339B2 (en) * 2011-05-27 2015-04-21 R.J. Reynolds Tobacco Company Method for producing triacetin from tobacco
US8268305B1 (en) 2011-09-23 2012-09-18 Bio-Cat, Inc. Method and compositions to reduce serum levels of triacylglycerides in human beings using a fungal lipase
US9289011B2 (en) 2013-03-07 2016-03-22 R.J. Reynolds Tobacco Company Method for producing lutein from tobacco
US9265284B2 (en) 2014-01-17 2016-02-23 R.J. Reynolds Tobacco Company Process for producing flavorants and related materials
US10881133B2 (en) 2015-04-16 2021-01-05 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived cellulosic sugar
US10499684B2 (en) 2016-01-28 2019-12-10 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived flavorants
US11091446B2 (en) 2017-03-24 2021-08-17 R.J. Reynolds Tobacco Company Methods of selectively forming substituted pyrazines

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2000127C3 (de) * 1970-01-02 1974-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur quantitativen Spaltung und zum quantitativen Nachweis von Tri-, Di- und Monoglyceriden
AT324282B (de) * 1972-06-19 1975-08-25 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagens zur bestimmung von triglyceriden
US3898130A (en) * 1974-03-18 1975-08-05 American Hospital Supply Corp Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides

Also Published As

Publication number Publication date
US4056442A (en) 1977-11-01
FR2353859A1 (fr) 1977-12-30
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DE2724758A1 (de) 1977-12-15
CA1066210A (en) 1979-11-13
FR2353859B1 (de) 1979-03-23
IT1115525B (it) 1986-02-03
NL7706000A (nl) 1977-12-05
AU2505577A (en) 1978-11-16
JPS5629B2 (de) 1981-01-06
BE855150A (fr) 1977-11-28
GB1519126A (en) 1978-07-26
AU504724B2 (en) 1979-10-25

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