DE2065556A1 - Testkombination zur vollenzymatischen bestimmung von lipoproteiden und/oder proteinfreien neutralfetten in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Description

• Tostkombination zur vollenzymatischen Bestimmung von Lipoproteiden.
• und/oder proteinfreien Neutral fetten in Körperflüssigkeiten Gegenstand-der Erfindung ist eine haltbare Testkombination zur quantitativen Schnellbestimmung von Tri- Di- und Kone glyceriden, Sowohl bei der Erforschung der Arteriosklerose als auch bei l.linischen und pharmakologischen Routineuntersuchungen spielt die quantitative Bestimmung der Triglyceride, iusbesondere derjenigen, welche an Lipoproteire gebunden sind, eine iiriner bedeutendere Rollo.
• Die seit längerer Zeit bekannten Verfahren weisen arbeitstechnisch verschiedene Nachteile auf und besitzen darüberhinaus oft nur eine geringe Spezifität und Analysengenauigkeit. Die enzymatische Be-Bestimmung der Triglyceride hat sich daher auf grund ihrer ausgeurägten Spezifität und Treffsicherheit in letzter Zeit ganz allgemein durchgesezt; vgl. Klin. Wochenschr. 40, 5.362 (1962) und Klin.
• Chomic 6, S.156-159 (1968).
• Bei den bisher gebräucklichen Verfahren werden die Fette zunächst mit einer starken Base, z.B. mit alkoholischer Kalilauge in die Salze der Fettsäuren und in Glycerin gespalten, worauf das in der Flüssigkeit enthaltene Glycerin nach Abtrennung der Fettsäureanteile (beispielsweise durch Fällung und anschließendes Zentrifu'-gieren ) in bekannter Weise enzymatisch in Pyruvat übergeführt wird.
• Die dem ursprünglichen Glyceringehalt äquivalente Pyruvatmenge wird schließlich durch NADH (reduzierte Form des Nicotinamid-adenindinuoleotids oder Diphosphopyridin-nucleotids) mittels Lactatdehydrogenasc in Milchaäure übergeführt, wobei die photometrisch meßbare Abnahme des NADH ein dircktes Maß für den Glyceringehalt darm stellt.
• Die Verseifung der Fette stellt trotz des sonstigen wesentlichen Fortschritts in der, Methodik immer noch einen zeitraubenden und aufwendigen Arbeitsvorgung dar, da diene quantitativ nur durch eine halbstündige Einwirkung von äthauolischer Kalilauge in der Wärme erreicht werden kann; außerdem ist -es notwendig, die entstandenen fettsauren Kalisalze in einem zusätzlichen Schritt mittels Magnesiumsulfat als Magnesiumsalze zu fällen und den entstandenen Niederschlag beispielsweise durch Abzentrifugieren zu entfernen.
• Versuche, auch den ersten Schritt der Fettspaltung enzymatisch durchzuführen, scheiterten bisher im wesentlichen aus drei Cründen; 1. Lipoprotein-gebundene Triglyoeride lassen sich zwer durch Lipoproteidlipasen spalten. Diese können Jedoch nur au,i menschlichem oder tierischem Gewebe gewonnen werden, sind wenig stabil und besitzen einen so hohen Proteingehalt, daß die photometrische NADH-Bestimmung gestört wird. Zudem erfolgt die Spaltung auch bei langen Inkubationszeiten unvollständig.
• 2. Emulgierte Neutralfette werden durch Lipase, welche aus Pankreas stammen, stufenweise über die I)i- und Monoglyceride zu -freien Fettsäuren und Glycerin gespalten, wobei teilweise die Spaltung nur zu Monoglyceriden führt. Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode läßt sich aber nur durchführen, wenn-die Spaltung quantitativ bis zur Stufe des freien Glycerins erfolgt.
• Mit sehr großen Enzymmengen und langen Inkubationszeiten, welche die vollständige Spaltung bisweilen bewirken können, läßt sich eine quantitative Bestimmung aus praktischen Gründen nicht durchführen. -3. Einfache proteinfreie Triglyceride werden durch eine Reihe von "körperfremden", aus Pflanzen oder Fungi gewonnenen Lipase gespalten. Die Spaltung von Lipoproteiden, d.h. eiweißgebundenen Fetten erfolgt, wen überhaupt, nur unvollständig oder erfordert so große Enzymmengen (mehr als 5 mg in ca. 2 ml Lösung), daß ein optischer Nachweis wegen der durch das Reagenz her-vorgerufenca Trübung nicht mehr durchgeführt werden kann.
• Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die in Comptes Renous Acad. So. Paris 259 (1964), 5. 4394-4396 beschriebene Lipase aus Ehizopus arrhizus imstande ist, Lipoprotein-gebundene Triglyceride neben den in Chylomikronen enthaltenen Triglyceriden mit außerordentlich hoher Umsatzzalll quantitativ in freie fettsäuren und Giycerin zu spalten, ohne daß die nachfolgende optische NADH-Bestimmung im UV-Licht beeinträchtigt wird. Dieses Ergebnis isl; umso erstaunlicher, als bisher von keiner "körperfremden" Lipase eine ausreichende Aktivität gegenüber Lipoprotein-gebundenen Triglyceriden bekannt war; noch viel weniger lag naturgemäß der Einsatz fiir die quantitative Bestimmung von derartigen Substanzen nahe, Erfindungsgemäß ist es nunmehr möglich, die Bestimmung von proteinfreien Neutralfetten und proteingebundenen Triglyceriden ohne vorhergehende Alkaliverseifung in der Wärme und Aufarbeitung der Probe voll-enzymatisch und ohne Einbuße an Genauigkeit durchzuführen. Außer der Vermeidung der unangenehm zu handhabenden stark ätzenden Alkalien bedeutet die erfindungsgemäße Durchführung vor allem einen beträchtlichen Zeitgewinn.
• Die enzymatische Fettverseifung bietet außerdem den Vorteil, die benötigte Serummenge gegenüber der herkömmlichen Methode erheblich, nämlich auf 1/20 des Volumens, verringern zu können. Dies ist vor allem bei, Reihenuntersuchungen kleiner Labortiere, wie z.B. weißer Mäuse und Ratten, von Bedeutung, Schließlich ist es nunmehr möglich, die Bestiinmung auch protein-gebundener Triglyceride beispielsweise in menschlichem Serum oder Kaaillarplasma mittels vorpräparierter Testkombinationen, welche die notwendigen Enzyme und Hilfsstoffe in optimaler Menge und gegebenenfalls in gepufferter und stabilisierter Lösung enthalten, in kurzer Zeit und ohne den bisherigen Aufstand auszuführen.
• Die vorpräparierten Testkombinationen werden vorzugsweise mit stabilisiercnden HilI,'sstoffen versetzt, um eine längere Lagerung der empfindlichen Enzymgemische zu ermöglichen und um eine stabile IlandelBform für den Einsatz in Laboratorien oder in der ärztlichen Praxis zu schaffen.
• Als besonders vorteilhaft hat sich eine Testkombination erwiesen, welche in einem bestimmten Volumen einer gepufferten, wässrigen Lösung eine vordosierte Menge Adenosintriphospha t- enthält, welches durch einen Zusatz von Trishydroxymethyl-amino-methan oder von Alkali-aziden stabilisiert ist und davon getrennt ein Pulvergemisch, vorzugsweise in Tablettenform, welches NADH und Phosphoenolpyruvat-Natrium in vordosierten Mengen enthält, Da Pulvergemische oder Tabletten in der beschriebenen Form nicht haltbar sind, setzt man als Stabilisatoren eine neutrale Aminosäure, wie z.B. Glycin und vorteilhafterweise ein Alkslisalz einer starken Säure , wie z.B. Kaliumchlorid zu.
• Zur Ausführung der Testreaktion wird das Pulvergemisch oder die Tablette zu der oben beschriebenen Adenosintriphosphatlösung gegeben.
• Nach Versetzen mit der Tri-, Di- oder Monoglycerid-haltigen Probe startet man dann die Vorreaktion mit einem Enzymgemisch, welches Lactatdehydrogenase, Pyruvatkinase und Glycerokinase enthält. mach Ablauf der Vorreaktion wird der erste Extinktionswert abgelesen und die Hauptreaktion erfindungsgemäß mit Rhizopus arrhizua-Lipase in Gang gebracht. Die Differenz zwischen dem ersten Extinktionswert .und dem nach etwa 5 Minuten ablesbaren zweiten Extinktionswert ist dem freigesetzten Glycerin direkt proportional. Da bei desem Verfahren nur ein einziger Pipettierschritt - ngmlich die Zugabe der Probe erforderlich ist - ermöglicht die erfindungsgemäße Testkombination eine weitere Vereinfachung und eine Erhöhung der Treffsicherheit des quantitativen Nachweises von Mono-, Di- oder Triglyceriden.
• Die erfindungsgemäß verwendete hochgereinigte Lipase aus Rhizopus arrhizus (Var. Belemar) weist gegenüber Olivenöl bei den pH-Optima 3,5 und 7,0 Aktivitäten zwischen 3500--8000 U/mg auf. Die Reinheit der Rhizopus-Lipase wurde elektrophoretisch geprüft.
• Die Testkombination zur vollenzymatischen Bestimmung von Lipoproteiden und/oder proteinfreien Neutralfetten in Körperflüssigkeiten, welche als wirksame Reagenzien 1. Phosphoenolpyruva t 2. Adenosintriphosphat 3. Lipase 4. Lactatdehydrogenase 5. Pyruvatkinase 6. Glycerokinase und 7. Nicotinamid-adenin-dinucleotid in der reduzierten Form enthält, ist dadurch gekennzeichnet, daß die in der Testkombination enthaltene Lipase aus einer Kultur von Rhizopus arrhizus gewonnen wurde.
• B e i s p i e 1 1 2,5 ml wässrige Pufferlösung, enthaltend 65 mg Triäthanolamin-hydrochlorid 25 mg Tris-hydroxymethyl-aminomethan 1,25 mg Adenosintriphosphat-Dinatriumsalz 1,25 mg Mngncsiumsulfat (MgS04 x 7H20) werden mit einer Tablette versetzt, die 4,5 mg NADH, 6,0 mg Phosphoend-pyruvat-Natrium 58,8 mg Glycin 14,8 mg Kaliumchlorid und 4,4 mg Polywachs 6000 (DAB 7) enthält.
• Nach Auflösen der Tablette wird die so vorbereitete Arbeitslösung in eine Küvette gegeben und mit 20 #l Sorum sowie ca. 30 /ul Enzymgemisch, bestehend aus Lactatdehydrogenase, Pyruvatkinase und Glycerokinase versetzt. Mach Ablauf der Vorreaktion wird die Extinktion bei 366 nm bestimmt (E1) und das Gemisch mit 20 µl -Lipase aus Rhizopus arrhizus versetzt. Nach weiteren 10 Minuten wird der zweite Extinktionswert abgeiesen (E2). Aus der Extinktionsdifferenz #B = E1 - E2 ergibt sich der Triglyceridgehalt nach folgender Formel: dE x 2705 = mg % Triglyceride.
• Beispiel 2 Nach dem in Beispiel 1 aufgeführten Vorfahren wurden 37 Einzelbestimmungen menschlichen Serums einmal nach der konventionellen Methode (Verseifung der Fette mit alkoholischer Kalilauge) und dann erfindungsgemäß mit dem aus Rhizopus arrhizus gewonnenen Enzym durchgeführt.
• Aus den Ergebnissen ergab sich ein Korrelationskoeffizient von r = 0,998.
• Die Einzelergebnisse sind in der Tabelle I wiedergegeben.
• Tabelle 1 Triglyoeridgehalt menschlicher Serumproben in mg% A. Nach Verseifung mit alko- B. Nach Fettspaltung mit holischer Kalilauge Lipase aus Rhizopus arrhizus 417- 4-16 160 145 445 430 472 460-135 110 60 621 1798 1925 1843 1710 108 105 -124 133 350 305 492. 445 Fortsetzung der Tabelle I: Triglyceridgehalt m@nschlicher Serumproben in mg% A. Nach Verseifung mit alko- B. Nach Fettspaltun@ holischer Kalilauge Lipase aus Rhizo@ arrhizus 1063 1020 126 149 160 400 372 129 132 72 74 268 250 72 74 177 167 375 167 65 57 154 189 232 215 63 165 110 116 365 214 462 456 90 438 410 194 70

Claims (7)

1. Patentansprüche 1. Testkombination zur vollenzymatischen Bestimmung von Lipoproteiden und/oder proteinfreien Neutralfetten in Körperflüssigkeiten, welche als wirksame Reagenzien 1. Phosphoenolpyruvat 2. Adenosintriphosphat 3. Lipase 4. Lactatdehydrogenase 5. Pyruvatkinase 6. Glycerokinase und 7. Nicotinamid-adenin-dinueleotid in der reduzierten Form enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Testkembination euthaltene Lipase aus einer Kultur von ßhizopus arrhizus gewonnen wurde.
2. 2. Testkombination gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Adenosintriphosphat in einer gepufferten und mit Drishydroxymethylaminomethan stabilisierten Lösung vorliegt
3. 3. Testkombination gemäß Anspruch dadurch gekennzeichnet, daß Adenosintriphosphat in einer gepufferten und mit Alkaliazid stabilisierten Lösung vorliegt.
4. 4. Testkombinstion gemäß Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Phosrhoenolpyruva t zusammen mit Nicotinsmid-adenin-dinucleotid als ein mit einer neutralen Aminosäure und gegebenenfalls mit Alkalisalzen starker Säuren stabilisiertes Feststoffgemisch vorliegt.
5. 5. Testkombination gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Feststoffgemisch zu einer Tablette mit abgestimmtem Gewicht verpreßt ist.
6. 6. Testkombination gemäß Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkalisalz einer starken Säure Kaliumchlorid vorliegt.
7. 7. Testkombination gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als neutrale Aminosäure Glycin vorliegt.