DE2051714A1 - Verfahren zur Bestimmung von Glucose - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Glucose

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DE2051714A1 DE19702051714 DE2051714A DE2051714A1 DE 2051714 A1 DE2051714 A1 DE 2051714A1 DE 19702051714 DE19702051714 DE 19702051714 DE 2051714 A DE2051714 A DE 2051714A DE 2051714 A1 DE2051714 A1 DE 2051714A1
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Dr. F. Zumöiein sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln Jun.
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872 379
Warner-Lambert Pharmaceutical Company, N.J.,USA
Verfahren zur Bestimmung von Glucose.
Die Erfindung "betrifft ein neues diagnostisches Verfahren, und insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Verfahren für die schnelle und genaue Bestimmung von Glucose in Proben.
Die Erfindung betrifft ebenfalls neue Reagentien, die bei dem obigen diagnostischen Verfahren nützlich sind. Glucose ist ein natürlich vorkommender Zucker, der in Prüchten, Pflanzen und anderen lebenden Organismen gefunden wird. Sie ist die Hauptenergiequelle für diese lebenden Organismen. Oft ist es erforderlich, in diesen Systemen die Konzentration an Glucose zu bestimmen. Beispielsweise ist es nötig, die Konzentration von Glucose in Proben und die Konzentration von Glucose in Serum genau zu bestimmen, wenn der Arzt die Abnormalitäten des Kohlehydratmetabolismus untersuchen und bestimmen will, oder wenn er sekundäre Abnormalitäten, die andere
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Krankheiten "begleiten, untersuchen will, wie beispielsweise bei Diabetes mellitus. Die Bestimmung von Glucose, "beispielsweise in Fruchtsäften, wird ebenfalls oft durchgeführt. Es stehen viele Verfahren zur Bestimmung von Glucose zur Verfügung. Die meisten dieser Verfahren verwenden die Reduktion bestimmter Schwermetalle, wie Kupfer, oder nitroarotnatischer Säuren durch die Aldehydgruppe der Glucose. Eine ausgezeichnete Übersicht dieser bekannten Verfahren ist in Clinical Diagnosis for Laboratory Use, 14.Auflage, veröffentlicht von W.B.Saunders Co., 1969, gegeben. Die meisten dieser Verfahren leiden jedoch unter dem Rückschlag, daß sie nicht spezifisch sind, oder daß ihnen die Genauigkeit fehlt. Außerdem fordert die Durchführung all dieser Verfahren recht viel Zeit.
Ein schnelles und genaues Verfahren zur Bestimmung von Glucose in Proben wurde nun gefunden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Probe,deren Glucose-Konzentration bestimmt werden soll, mit einem neuen Reagens behandelt, das die Kombination von Hexokinase, Glucose-G-phosphat-dehydrogenase, Adenosin-5-triphosphat (ΑΪΡ), Hikotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (UADP), einen chromogenen Elektronakzeptor und einen Zwischenelektronenträger (intermediate electron carrier) enthält. Der chromogene Elektronenträger, typischerweise ein Tetrazoliumsalz, wird zu einem gefärbten Formazan reduziert, dessen optische Dichte dann colorimetrisch bestimmt wird. Das neue Reagens kann gegebenenfalls eine kleine Menge von Magnesiumionen und eine kleine Menge eines chelatbildenden Mittels enthalten. Obgleich der pH-Wert nicht kritisch ist, wird die Umsetzung vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Glucose kann wie oben beschrieben durchgeführt werden, oder es kann durchgeführt werden, indem man die Probe mit dem neuen Reagens, das Hexokinase, Nikotinamid-adenin-dinucleotid -phosphat (NADP), Glucose-o-phosphat-dehydrogenase und Adenosin-5-triphosp,hat
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(ATP) enthält, gegebenenfalls in Anwesenheit von Magnesiumionen inkubiert, .. und wobei das Reagens eine geringe Menge eines chelatbildenden Mittels, wie das Natriumsälz von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.
Typischerweise wird dieses während ungefähr 2 bis 3 Minuten bei 370G inkubiert,und eine kleine Menge eines Farbentwickler, der eine Mischung von Phenazin-methosulfat (PMS) und 2-p-Jodphenyl-3-p~nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchloriä (INT) (ebenfalls als Jodnitrotetrazoliumchlorid bekannt) wird zugefügt. Die entstehende Mischung wird bei ungefähr 37 °C während etwa 10 Min. inkubiert. Die Reaktion verläuft bis zur Beendigung. Das optische J Absorptionsvermögen der entstehenden Mischung wird dann bei einer Wellenlänge von ungefähr 520 nm an einem Colorimeter abgelesen. Um die Stabilität des gefärbten Formazans zu verbessern, werden gegen Ende der Inkubationsperiode Wasser oder Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder deren Mischungen zugefügt.
Die Intensität der gebildeten Farbe ist proportional der G-lucose-Konzentration in den Proben, die geprüft werden. Die so erhaltene optische Dichte wird dann mit der verglichen, die eine Blindprobe zeigt, d.h. eine Probe, die alle Reagentien enthält und keine Substanz, die untersucht v/erden soll. Die Glucose-Konzen- Λ tration kann direkt von einer Standardkurve der G-lucose-Konzen- ™ tration, aufgetragen gegenüber der optischen Dichte, abgelesen werden.
Die Hexokinase und Glueose-6-phosphat-dehydrogenase, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind im Handel erhältlich von Nutritional Biachem, Calbiochem oder Boehringer Biochem. Die Reagentien, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet v/erden, werden hergestellt, indem man die aktiven Bestandteile in Wasser löst. Alternativ können die Enzyme und die Farbentwickler in zwei Teilen hergestellt werden. Typischerweise enthält der erste Teil die Enzyme und wird hergestellt,
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indem man Hexokinase, G-lucose-6-pb.osph.at-deh.ydrogenase, Adenosin-5-triphoßphat (AIP) und Nikotinamid-adenin-dinucleotid phosphat (NADP) in Wasser löst. Dazu fügt man eine geringe Menge Magnesiumion in Form eines Magnesiumsalzes·, wie Magne.siu.tii- . Chlorid oder Magnesiumsulfat, und dann wird ithyldiamintetraessigsäure in Form ihres,· Dihatriumsalzes zugefügt. Das Endsystem wird bei einem pH von ungefähr 6,0 "bis ungefähr 8,5, vorzugsweise "bei 7,8, mit einem geeigneten Puffersystem, wie Iris-hydroxy-methylaminomethan (IRIS) oder anderen Puffern, die in der Lage sind, den pH-Wert einzustellen, gehalten.
Typischerweise werden ungefähr 35 bis 50 Bucher-Einheiten Hexokinase, 8 bia 10 Bucher-Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 2 μΜοΙ Adenosin-5-triphsophat (ATP) und 0,2 bis 2 μΜοΙ Nikotinamid-adenin-dinucleotide-phosphat (NADP) verwendet. Die enzymatische Aktivität der im Handel erhältlichen Präparationen wurde bestimmt, wie es in dem Boehringer Enzym-Katalog beschrieben ist. Eine Aktivitätseinheit wurde auf die Bucher-Einheit berechnet, wobei eine Aktivitätseinheit die Menge des Enzyms ist, die in 1 ml gelöst ist und die einen optischen Dichtewechsel von 0,100 in 100 Sekunden bei 366 nm und 250C ergibt, wobei man eine 1 cm Cuvette verwendete, d.h. sie katalysiert die Reduktion von 0,030 μΜοΙ NADP pro ml oder 22,5 μg': NADP pro ml. Optische Konservierungsmittel, wie Methylparaban, Propylparaban können ebenfalls zugefügt werden.
Der zweite Teil ist die Farbentwicklerlösung, und sie wird hergestellt, indem man in Wasser einen ehromogenen Elektronenakzeptor löst, der als Indikator wirkt, wie Jodnitrotetrazoliumchlorid (INT), oder Nitro-blau-tetrazolium und einen Zwischenelektronenträger, wie Phenazinmethosulfat.
Um die Lagerung und das Handhaben zu erleichtern, können die obigen Lösungen lyophilisiert werden, oder alle Bestandteile können in Form von Kapseln oder Tabletten verteilt sein und vor
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der Verwendung mit Wasser rekonstituiert werden. Der chromogene Elektronenakzeptor-Indikator existiert in einer farblosen Form in oxydiertem Zustand und wird gefärbt, wenn er in reduziertem Zustand vorliegt. Beispielsweise wird INI rot, wenn es reduziert ist. Die Konzentration dieser Indikatoren "beträgt von ungefähr 150 mgfo bis 400 mg$ für INT und von 25 mg$ bis 75 mg# für Phenazinmethosulfat.
Bei der Umsetzung können andere Elektronenträger, wie Methylenblau, 2,6-Dichlorphenolindophenol oder Ihionin, verwendet werden. Andere Tetrazoliumsalze, wie blaues Tetrazolium (BT) (3,3t-Dianisol-bis-4,4l~3,5-diphenyltetrazoliumchlorid), Neotetrazoliumchlorid, Nitro BT, Nitroneotetrazoliumchlorid, TNBT (Tetranitro BT) oder 2,3,5-Triphenyltetrazolimformazan, anstelle von INT verwendet werden. Die Zwischenelektronenträger werden in dem Artikel in Analytical Biochemistry, 1, 317-326 (1960) mit dem Titel "The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrazolium Salt" von M.M.Nachlas, S.I. Margulies, J.D. Goldberg und A.M. Seligman,..beschrieben.
Alternativ können Hexokinase, Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase, Adenosin-5-triphosphat (ATP) und Nikotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADP), der chromogene Elektronenakzeptor wie auch der Zwischenelektronenträger zusammen unter Bildung einer einzigen lösung gegeben werden. Um die Lagerung und das- Handhaben zu erleichtern, kann diese Lösung ebenfalls lyophilisiert und vor dem Gebrauch rekonstruiert werden.
Wird die Bestimmung von Blutglucose gewünscht, so werden typischerweise 20 Mikroliter Probe zu 1,0 ml von 0,1 M -Tris-hydroxymethylaminomethan (TRIS) Puffer zugefügt, pH 7,8, der 9 Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 g% oder 500 mg^ p 6H2O, 16 ing$ Nikotinamidadenin-dinucleotid-phosphat (NADP), 50 Bucher-Einheiten Hexokinase, 8 Bucher-Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase pro Yersucb. oder 50 mgfo Adenosin-5-tri-
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phosphat (ΑΐΡ) enthält. Man präinkubiert während 2 bis 3 Minuten und fügt dann 0,2 ml des.Farbentwioklers zu. Man inkubiert dann während 10 Minuten und fügt dann 5 ml 0,1 η HOl in · Ze itIntervallen bis zum Ende der Enzymreaktion hinzu. Man liest den Endfarbwert gegenüber einer Blindreagensprobe bei 520 nm ab,
Vergleicht man die Ergebnisse, die man erhält (d;h. die Ablesungen der Probe und der Blindpirobe) mit denen., die man bei bekannten Glueose-Konzentrationen erhalten hat, so kann man die Konzentration der Glucose in der Probe leicht bestimmen. '
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Claims (10)

  1. Pa t entans ρ rüc lie
    Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a. eine Probe mit einer Lösung, die Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Adenosin-5-triphosphat (ATP) und Nikotinamid-adenin-dinucleotid' -phosphat (UADP), einen chromogenen Elektronenakzeptor und einen Zwischenelektronenträger enthalt, inkubiert und
    b. die optische Dichte der entstehenden Lösung bestimmt.
  2. 2. Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a. die Probe mit einer Lösung, die Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Adenosin-5-triphosphat (ATP) und Nikotinamid-adenin-dinucleotid -phosphat (NADP) enthält, inkubiert und
    b. eine Lösung,, die einen chromogenen Elektronenakzeptor und einen Zwischenelektronenträger enthält, zufügt und
    c. die optische Dichte der entstehenden Lösung bestimmt.
  3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (a) bei einem pH-Wert von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,5 und in Anwesenheit einer geringen Menge an Magnesiumionen durchgeführt wird.
  4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (a) in Anwesenheit eineschelatbildenden Mittels durchgeführt wird.
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  5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das chelatbildend© Mittel das Natriumsalz vom Äthyl end iamlntetraessigsäure (EDTA) ist.
  6. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Serum ist und die verwendete Menge ungefähr 20 Mikroliter "beträgt.
  7. 7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Serum ist und die verwendete Menge ungefähr 20 Mikroliter beträgt.
  8. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der chromogene Elektronenakzeptor ein Tetrazoliumsalz ist.
  9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetrazoliumsalz aus der Gruppe ausgewählt wird, die Jodnitrotetrazoliumchlorid, (INT) und Mtro-blau-tetrazolium enthält.
  10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der chromogene Elektronenakzeptor ein Tetrazoliumsalz ist.
    11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetrazoliumsalz aus der Gruppe ausgewählt wird, die Jodnitrotetrazoliumchlorid (INT) und Nitro-blau-tetrazolium enthält.
    12. Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a. 20 Mikroliter der Probe zu ungefähr 1 ml einer lösung, die ungefähr 0,1 M Tris-hydroxy-methylaminomethan (TRIS), eine geringe Menge Athylendiamintetraessigsäure (EDTA) und eine geringe Menge Magnesiumchlorid, ungefähr 35 bis 50 Bucher-Einheiten Hexokinase, 8 bis 10 Bucher-Einheiten Glucose-S-phosphat-dehydrogenase, 0,5 bis 2 μΜο! Ade.no-
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    sin-5-triphosphat (ATP) und 0,2 Ms 2 μΜοΙ Hikotinatnidadenin-dinacleotid-phosphat (HADP) enthält, zufügt,
    b. die sogebil'dete Mischung während 2 "bis 3 Minuten bei 370O inkubiert,
    c. ungefähr 0,2 ml einer lösung," die 150 mg$ Ms 400 mgfo Jodnitrotetrazoliumchlorid (IHT) und 25 mg$ Ms 75 mg$ Phenazinmethosulfat enthält, zufügt,
    d. während. 10 Minuten bei 370C die entstehende Mischung inkubiert,
    e. 5 ml 0,1 molare Chlorwasserstoffsäure zufügt, und
    f. die optische Dichte der entstehenden Lösung bestimmt. ™
    13- Reagens zur colorimetrisehen Bestimmung von- Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lösung von Hexokinase, Glucose-6-phosphat-dehyd'rogenase, Adenosin-5-tr!phosphat (ATP), Hikotinamid-adenin-dinucleotid —phosphat (HADP), ein chromogenen Elekt'ronenakzeptbr und einen Zwischenelektronenträger -enthält.
    14. Reagens gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung lyophilisiert ist.
    15. Reagens· gemäß-Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung einen pH-Wert von ungefähr 6,5 bis 8,5 besitzt und eine geringe Menge von Magnesiumion enthält.
    16. Reagens zur colorimetrisehen Bestimmung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lösung von ungefähr 35 bis ungefähr 50 Bucher-Einheiten Hexokinase, ungefähr 8 bis ungefähr 10 Bucher-Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, ungefähr 0,5 bis ungefähr 2 μΜοΙ Adeno3in-5-triphosphat (ATP), ungefähr 2 μΜοΙ Nikotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (HADP), eine geringe Menge Magnesiumionen,'ungefähr 400 mgfo Jodnitrotetrazoliumchlorid (IHT) und ungefähr
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    25 mg$ "bis ungefähr 75 mgfo Phenazinmethosulfat enthält und einen pH-Wert von ungefähr 6,5 his 8,5 besitzt.
    17. Reagens gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung lyophilisiert ist.
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DE2740957A1 (de) * 1976-09-13 1978-03-16 Ivan Endre Modrovich Stabilisierte fluessige enzym- und koenzymmassen und verfahren zu ihrer herstellung

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