DE2518862A1

DE2518862A1 - Enzymatisches analyseverfahren und reagens zur durchfuehrung desselben

Info

Publication number: DE2518862A1
Application number: DE19752518862
Authority: DE
Inventors: Charles Allain; Carl Henson
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1974-04-29
Filing date: 1975-04-28
Publication date: 1975-11-13
Also published as: CA1051326A; US3956069A; JPS5110996A; DE2518862B2; SE7803067L; SE7504845L; GB1491313A; FR2269080B1; SE420420B; FR2269080A1; SE405046B

Description

Dr. Ing. Walier Abitz Dr. Dieter F. Morf

r^ ι ι λ r-· 28. April 1975

Dr. Hans-A. brauns ₃₁₀₆

8 München Bo, Rönzö:icuerstr. 28.

ABBOTT LABORATORIES

I4th Street & Sheridan Road, North Chicago, Illinois 60064,

V.St.A.

Enzymatisches Analyseverfahren und Reagens zur Durchführung desselben

Bei der optischen Methode zur Bestimmung von Glukose katalysiert Hexokinase (HK) die Phosphorylierung von Glukose durch Adenosintriphosphat (ATP) wie folgt:

Glukose + ATP Gluko se-6-phosphat +

Adeno sindipho sphat (ADP )

Glukose-6-phosphat (G-6-P) wird in Gegenwart von Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD) durch Glukose-6-phosphat-dehydrogenase (G-6-PDH) oxidiert:

G-6-P + NAD⁺ 6-Phosphoglukonat + NADH + H⁺

Die Reduktion von NAD zu NADH (reduzierte Form von NAD) bei

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340 nm erlaubt eine quantitative Messung der vorhandenen Glukosemenge.

Bei der Kreatinphosphokinase (CPK)-Analysemethode von

S. B. Rosalki (Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 69; (1967), S. 696) katalysiert CPK die reversible Bildung von Adenosintriphosphat (ATP) und E?eatin aus Adenosindiphosphat (ADP) und Kreatinphosphat (CPO^) gemäss der folgenden Gleichung:

ADP + Kreatin-pho sphat ' ATP + Kreatin

Das bei der von CPK vermittelten Reaktion gebildete ATP wird zur Phosphorylierung von Glukose in Gegenwart von Hexokinase (HK) verwendet; es entsteht dabei Glukose-6-phosphat. In dem Masse wie Glukose-6-phosphat gebildet wird, entsteht ADP, wobei seine Konzentration auf einer konstanten Höhe gehalten wird.

Glukose + ATP Glukose-6-pho sphat + ADP

Das durch die Hexokinasereaktion gebildete Glukose-6-phosphat wird dann durch das Enzym Glukose-6-phosphat-dehydrogenase (G-6-PDH) unter gleichzeitiger Reduktion von FAD oxidiert.

G-6-P + NAD⁺ 6-Phosphoglukonat + NADH + H⁺

Die Reduktion von NAD zu NADH lässt sich spektrophotometrisch verfolgen, indem man die sich ergebende Erhöhung der Absorption bei 340 nm beobachtet. Für jedes Mol Phosphat, das durch das CPK übertragen wird, bildet sich 1 Mol NADH. Somit ist die Geschwindigkeit der Absorptionsänderung direkt proportional der in der Probe vorhandenen CPK-Aktivität.

Milchsäuredehydrogenase (LDH) (L-Lactat: NAD-Oxidoreduktase) katalysiert die folgende Reaktion:

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Ir-(+)-Lactat + NAD⁺ Pyruvat + NADH + H⁺

Bei der Analyse von anderen Serumbestandteilen als LDH kann jedes vorhandene LDH infolge der Anwesenheit von entweder Lactat oder Brenztraubensäureester in der Probe Störungen hervorrufen und infolgedessen Fehler bei der Analyse von Glukose oder CPK oder in irgendeinem Analysensystem, in dem NAD zu NADH reduziert wird, verursachen. Gebildetes NADH unterliegt der Reaktion mit Brenztraubensäureester in Gegenwart von LDH, wodurch beispielsweise Fehler bei der Analyse von Glukose oder CPK verursacht werden.

H⁺ + NADH + Pyruvat ££% Lactat + NAD⁺

Diese Störung kann mittels NADP wie folgt überwunden oder vermieden werden:

1. Kreatinphosphat (CPO^) + ADP Kreatin + ATP

2. ATP + Glukose Glukose-6-phosphat (G-6-P) + ADP

3. G-6-P + NAD-Phosphat (NADP)⁺ 6-Phosphoglukonat +

NADPH + H⁺

NADP und NADPH reagieren nicht mit in gewöhnlichen biologischen Proben vorliegendem LDH; die Verwendung von NADP bei der enzymatischen Bestimmung von entweder CPK oder Glukose erhöht jedoch die Kosten des Reagenses und setzt den dynamischen Bereich der Methode herab. Bei Verwendung von NAD anstelle von NADH ergeben sich eine Herabsetzung der Reagenskosten und eine Erhöhung des dynamischen Bereichs; es werden jedoch unerwünschte Reaktionen möglich gemacht, und es können, wie oben beschrieben, Fehler auftreten.

Es wurde gefunden, dass LDH mit Oxalsäure oder Oxaminsäure (oxamic,oxaminic acid) und ihren Salzen einen inaktiven Komplex bildet, wodurch Störungen infolge .der Anwesenheit von LDH ausgeschaltet werden. Die Oxalsäure oder Oxaminsäure oder deren

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Salze sollten nicht in solcher Konzentration vorliegen, dass sie die Messung der Bestandteile inhibieren oder stören, sondern sollten in ausreichender Konzentration vorliegen, um die Reaktion von LDH zu inhibieren. Im allgemeinen ist eine Konzentration von 2 bis 9 Mikromol Je Liter ausreichend. Bis zu 50 Mikromol können für hohe Niveaus an Brenztraubensäureester oder Lactat in Gegenwart von LDH verwendet werden. Die Methode ist zusammen mit jedem beliebigen Analysesystem anwendbar, bei dem NAD zu NADH reduziert wird und die Anwesenheit von Brenztraubensäureester und/oder LDH unerwünscht wäre.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch in solchen Analysesystemen Verwendung finden, in denen NADH zu NAD oxidiert wird, um eine Störung durch Brenztraubensäureester oder Lactat in einer LDH enthaltenden Probe zu verhüten. Bei solchen Reaktionen ist das Verschwinden von NADH ein quantitatives Mass für den Bestandteil, der gemessen wird. Ein Beispiel ist die Messung von Plasmaammoniak unter Verwendung von Glutaminsäuredehydrogenäse.

In einer Veröffentlichung von F. Da Ibnseca-Wollbeim, 'die unter dem Titel "Direkte Plasmaammoniakbestimmung ohne Enteiweissung" erschien (Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 11, (1973) S- 4-26-4-31), ist ein Analysensystem für Plasmaammoniak beschrieben, und es wird darauf hingewiesen, dass unspezifische Änderungen der Extinktion bei Einleitung der Reaktion durch Verwendung von reduziertem NAD-Phosphat (NADPH) anstelle von NADH als Coenzym vermieden werden können. Bei dieser Arbeitsweise werden 0,5 ml Plasma zusammen mit 1,5 ml Reagens verwendet. Da die Probe nicht deproteinisiert wird, können Brenztraubensäureester und LDH in der Probe mit NADH reagieren und daher als scheinbares Ammoniak gemessen werden. Da normale Ammoniakniveaus sehr niedrig liegen (weniger als 60 Mikromol je Liter, was 0,1 mg% äquivalent ist), würde sogar eine geringe Störung durch Brenztraubensäureester oder andere Ketosäuren der Analysegenauigkeit sehr abträglich sein. Durch das hier beschriebene Verfahren werden also, wie auf der Hand liegt, solche Störungen

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bei Analysen, die von Reaktionen Gebrauch machen, bei denen NADH verbraucht wird und Störungen auftreten können, ausgeschaltet.

Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft veranschaulicht durch "Verwendung von Oxalat als freie Säure oder als Kaliumsalz sowohl bei der CPK- als auch der Glukoseanalyse, wie zuvor beschrieben wurde. Oxalat ist wirksam bei der Verhütung der Störung durch hohe Niveaus von Brenztraubensäureester oder Lactat in Gegenwart von LDH und macht es somit möglich, NAD anstelle von NADP zu verwenden. Das verwendete Oxalat kann Teil des Puffersystems sein oder als besonderer Bestandteil zugesetzt werden. Die Vorteile der Verwendung von NAD anstelle von NADP sind die Kostenherabsetzung und der erhöhte dynamische Bereich.

Die Wirkung von Brenztraubensäureester bei einem Niveau von 100 mg% in der geprüften Probe wird in der Tabelle I gezeigt. Bei Verwendung von NADP tritt keine Wirkung auf, weil LDH keinen Gebrauch von NADP macht. Zusammen mit NAD bewirkt die Anwesenheit von Brenztraubensäureester eine Abnahme der scheinbaren CPK-Aktivität infolge der Umwandlung von Brenztraubensäureester in Lactat und der nachfolgenden Oxidation des NADH. Wenn die Reaktion von Proben, die 100 mg% Brenztraubensäureester enthalten, in Gegenwart von 2,63 mMol je Liter an Oxalat ausgeführt wird (vgl. Tabelle II), wird die Störung infolge des LDH umgangen.

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Tabelle I

CPK (Internationale Einheiten/Liter)-Wirkung säureester auf CPK-Aktivität	NADP 100 mg% Brenztrau bensäure ester	Kontrolle (kein Brenz traubensäure ester, kein Oxalat)	von Brenztrauben-
Kontrolle (kein Brenz traubensäure ester)	10	11	FAD 100 mg% Brenz- traub ensäure- ester (kein Oxalat)
9	80	83	14
78	9	13	80
9	461	4-90	9
455	65	70	469
65	104	106	64
102	726	845	99
717	31	32	833
31	20	25	28
19	17	20	22
16	T a b e	1 1 e II	17

CPK (Internationale Einheiten/Liter)-Wirkung von Oxalat auf CPK-Aktivität von Proben, die 100 mg% Brenztraubensäureester

enthalten

Kontrolle Prüfung

(kein Brenztrauben- (i00mg% Brenztraubensäureester

säureester) in 2,63 mMol/Liter Oxalat)

10 10 74 73

11 11 428

57 - 58

92 93

740

29 27

22 21

18 18

- 6 50984670988'

Beispiel 1

Nachfolgend wird ein Beispiel für ein Reagens gebracht, wbei NAD in Gegenwart von Magnesium und eines Aktivators verwendet wird. Das Reagens eignet sich für die enzymatische Bestimmung von Kreatinphosphokinase.

Bestandteil Menge je 3 ml der Menge je ml

zu analysierenden Reagens Mischung

Adeno sindipho sphat

(ADP) 0,5 bis 5 mg 0,16 bis 1,6 mg

Kreatinpho sphat

(CPO^) 10 bis 30 mg 3 bis 10 mg

Glukose 5 bis 20 mg 1,6 bis 6,6 mg

Nicotinamidadenin—

dinucleotid (NAD) 2 bis 6 mg 0,6 bis 2 mg Hexokinase (HK) 2 bis 10 interna- 0,6 bis 3i3 inter-

tionale Einheiten nationale Einheiten

Gluko se-6-pho sphat-

dehydrogenase (G-6-PDH) 5,0 bis 15,0 inter- 1,6 bis 5,1 inter-

(G-6-PDH) nationale Einheiten nationale Einheiten

Magnesiumasparaginat 2 bis 20 mg 0,6 bis 6,6 mg

2 bis 9 mMol Oxalat je Liter Reagens werden in der Form von Kaliumoxalat zur Verhütung der beobachteten Nebenreaktion zusammen mit einem geeigneten Puffer zur Aufrechterhaltung des pH¹s in dem Bereich von 6,1 bis 7»0 zugegeben. Dithioerythrit ist in einer Menge von 2 bis 25 mMol je Liter Lösung als Aktivator zufriedenstellend.

Die Wirkung von Brenztraubensäureester auf Glukosebestimmungen wird in der Tabelle III gezeigt. Es ergeben sich niedrigere Werte infolge der Anwesenheit von Brenztraubensäureester und von LDH, das einer Oxidation des gebildeten NADH bewirkt. Wenn Oxalat dem Ansatz zugesetzt wird, zeigt Brenztraubensäureester keine störende Wirkung in Gegenwart von LDH (Tabellen IV und V).

-V-

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0? a b e 1 1 e III Glukose (mg%)

Wirkung von Brenztraubensäureester auf Glukosebestimmungen

(native Sera)

Kontrolle (kein Brenztraubensäure- ■ ester)	Prüfung (100 mg% Brenztraubensäure ester}
64	57
86	77
95	83
78	62
96	80
75	61
80	67
93	81
152	139
76	65

Tabelle IV Glukose (mg%)

Wirkung von Oxalat auf Proben, die Brenztraubensäureester enthalten (200 mg%)

Kontrolle Prüfung

(kein Brenztraubensäureester) (200 mg% Brenztraubensäureester

(39,6 mMol/Liter Oxalat) in 39,6 mMol/Liter Oxalat)

86	-	•	- 8 -	87
105			509846/0986	105
92			92
24-		24
227		228
81		80
80		81
286	283
76	76
73	74
86	86

3106	3	2518862	100 mg% Brenztrauben säureester, kein Oxalat	100 mg% Brenztrau bensäureester , 9 mMol/Liter Oxalat
	Tabelle V		71	124
	Glukose (mg%)		24	67
Auswirkung von Oxalat auf die Bestimmung von Glukose in Gegen wart und Abwesenheit von Brenztraubensäureester	12	52
Kontrolle (kein Oxalat, kein Brenztrauben säureester)	34	82
123	9	49
67	O	27
52	30	75
81	23	69
50	31	82
26	22	66
76
68
82
65
Beispiel 2

Nachfolgend wird ein Beispiel für ein Eeagens gebracht, bei dem NAD in Anwesenheit von Magnesium verwendet wird und das sich für die enzymatisch^ Bestimmung von Glukose eignet.

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Bestandteil Menge Je 3 ml der Menge je ml

zu analysierenden Reagens Mischung

Adeno sintripho sphat

(ATP) 0,5 bis 5,0 mg 0,16 bis 1,6 mg

Ni cotinamidadenin-

dinucleotid (NAD) 0,5 bis 5,0 mg 0,16 bis 1,6 mg

HeXokinase (HK) 0,5 bis 5,0 inter- 0,16 bis 1,6 internationale Einheiten nationale Einheiten

Glukose-6-phosphat- 0,5 bis 5»O inter- 0,16 bis 1,6 dehydrogenase nationale Einheiten internationale

(G-6-PDH) Einheiten

Magnesiumasparaginat 2 bis 10 mg 0,6 bis 3»3 mg

2 bis 9 mMol Oxalat je Liter Reagens in Form von Kaliumoxalat werden hinzugegeben, um die beobachtete Nebenreaktion zu verhindern. Ein geeigneter Puffer wird zugesetzt, damit der pH-Wert bei etwa 7*5 bleibt.

Die Bestandteile des Reagenses von jedem der Beispiele 1 und 2 können zu einem Produkt vermischt werden. Demgemäss wird ein trockenes, stabiles Einzelreagens für die enzymatische Analyse von Glukose oder Kreatinphosphokinase bereitgestellt.

Die in den Tabellen I bis V wiedergegebenen Untersuchungen wurden bei einer Temperatur von 37° C unter Verwendung eines Gesamtvolumens von Reagens und Probe von 3*02 ml, das 0,02 ml Probe einschliesst, durchgeführt. Für die Durchführung der Bestimmung kann ein aufzeichnendes Spektrophotometer-, z. B. das Perkin-Elmer-Modell 124, verwendet werden.

Die Reagentien der Beispiele 1 und 2 können durch Zugabe von destilliertem Wasser und sachtes Mischen zur Auflösung der Bestandteile angesetzt werden. Die Reagentien sind bei Raumtemperatur 6 Monate lang und in Lösung mindestens 8 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 24· Stunden bei 4° c stabil.

Im Gebrauch wird das angesetzte Heagens in aliquote 3,0 ml-

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Portionen unterteilt; jeder Portion werden 0,02 ml Probe zugesetzt. Das Gemisch wird bei 37° C mindestens 10 Minuten lang bebrütet, und die Absorption wird gegen eine Reagensblindprobe aufgezeichnet, um die Konzentration des gemessenen Bestandteils zu bestimmen.

Bei den Untersuchungen, über die hier berichtet wird, wurden zwar 3,0 ml-Portionen an Reagens verwendet, es können aber, wenn gewünscht, auch andere Mengen verwendet werden. Die in den Beispielen 1 und 2 angezeigten Konzentrationen beziehen sich auf das Reagens in Form einer Lösung oder auf eine trockene Pulvermischung, die beim Ansetzen in der gewünschten Menge Wasser oder eines anderen Lösungsmittels die angezeigten Konzentrationen ergeben.

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Claims

Patentansprüche

ihzymatisches Analyseverfahren, bei dem Nicotinamidadenindinucleotid reduziert oder die reduzierte Form des Nicotinamidadenindinucleotids zu Nicotinamidadeninnucleotid oxidiert und bei dem die reduzierte Form oder das Verschwinden der genannten reduzierten Form des Mcotinamidadenindinucleotids ein quantitatives Mass des Bestandteils in der Probe darstellt, welche gemessen und der Umsetzung mit Brenztraubensäureester in Gegenwart von Milchsäuredehydrogenase unterzogen wird, was Fehler bei der Analyse verursachen kann, dadurch gekennzeichnet, dass man das genannte Analyseverfahren in Gegenwart einer Verbindung, und zwar von Oxalsäure, Oxaminsäure und/oder Salzen davon ausführt, wobei die Konzentration der genannten Verbindung ausreichend ist, um die Reaktion der Milchsäuredehydrogenase zu verhindern, und dabei gleichzeitig die Bestandteile, welche gemessen werden, nicht störend beeinflusst, wodurch die genannte Verbindung mit Milchsäuredehydrogenase einen inaktiven Komplex bildet und dadurch Störungen ausgeschaltet und irgendwelche Fehler bei dem Analyseverfahren auf ein Mindestmass beschränkt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Verbindung in einer Konzentration von 2 bis 50 Mikromol je Liter Reagenslösung vorliegt.
3. Enzymatisch.es Analyseverfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Glukose in einer Probe, bei dem man Glukose in der genannten Probe durch Adenosintriphosphat in Gegenwart von Hexokinase unter Bildung von Glukose-6-phosphat phosphoryliert, das Glukose-6-phosphat in Gegenwart von Hicotinamidadenindinucleotid durch Glukose-6-phosphatdehydrogenase unter Bildung der reduzierten Form des Hicotinamidadenindinucleotids oxidiert, und die Menge der reduzierten Form des Uicotinamidadenindinucleotids zur

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Bestimmung der in der Probe vorhandenen Glukose misst, dadurch gekennzeichnet, dass man das genannte Analyseverfahren in Gegenwart einer Verbindung, und zwar von Oxalsäure, Oxaminsäure und/oder deren Salze ausführt, wobei die Konzentration der genannten Verbindung ausreicht, um die Reaktion von geglicher in der Probe vorhandener Milchsäuredehydrogenase zu inhibieren.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einer Konzentration von 2 bis 50 Mikromol je Liter Reagenslösung vorhanden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, dass

die Konzentration der genannten Verbindung von 2 bis 9 Mikromol je Liter Reagenslösung reicht.
6. Enzymatisch.es Analyseverfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Kreatinphosphokinase in einer Probe, bei dem man Adenosindiphosphat und Kreatinphosphat in Gegenwart von Kreatinphosphokinase unter Bildung von Adenosintriphosphat und Kreatin umsetzt, Glukose mit dem in Gegenwart von Hexokinase gebildeten Adenosintriphosphat unter Bildung von Glukose-6-phosphat phosphoryliert, das Glukose-6-phosphat mit Glukose-6-phosphat-dehydrogenase in Gegenwart von ITicotinamidadenindinucleotid unter Bildung der reduzierten Eorm des Hicotinamidadenindinucleotids oxidiert, die Menge an reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid misst, die sich gebildet hat, um so die in der Probe vorhandene Kreatinphosphokinaseaktivitat zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass man das genannte Analyseverfahren in Gegenwart einer Verbindung, und zwar von Oxalsäure, Oxaminsäure und/oder deren Salzen, ausführt, wobei die Konzentration der genannten Verbindung ausreicht, um die Reaktion von jeglicher in der Probe vorhandenen Milchsäuredehydrogenase zu inhibieren.

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7- Verfahren nach. Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der genannten Verbindung 2 bis 50 Mikromol je Liter Reagenslösung beträgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der genannten Verbindung 2 bis 9 Mikromol je Liter Reagenslösung beträgt.
9· Einzelreagens zur Durchführung des enzymatisehen Analyseverfahrens gemäss Anspruch 1 zur Bestimmung des Glukosegehaltes einer Probe, enthaltend eine wasserlösliche, feste, praktisch wasserfreie, lagerungsstabile Mischung aus Adenosintriphosphat in einer Konzentration von 0,16 bis 1,6 mg je ml Reagens, Micotinamidadenindinucleotid in einer Konzentration von 0,16 bis 1,6 mg je ml Reagens, Hexokinase in einer Konzentration von 0,16 bis 1,6 internationalen Einheiten je ml Reagens, Glukose-6-phosphatdehydrogenäse in einer Konzentration von 0,16 bis 1,6 internationalen Einheiten je ml Reagens, ein Magnesiumsalz in einer Konzentration von 0,6 bis 3^3 Big je ml Reagens und 2 bis 50 Mikromol je Liter Reagenslösung an einer Verbindung, und zwar von Oxalsäure, Oxaminsäure und/oder deren Salzen.
10. Reagens nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der genannten Verbindung 2 bis 9 Mikromol Liter Reagenslösung beträgt.
11. Einzelreagenslösung zur Durchführung des Analyseverfahren gemäss Anspruch 1 zur Bestimmung der Kreatinphosphokinaseaktivität einer Probe, die eine wasserlösliche, feste, praktisch wasserfreie, lagerungsstabile Mischung enthält aus Adenosintriphosphat in einer Konzentration von 0,16 bis 1,6 mg je ml Reagens, Kreatinphosphat in einer Konzentration von 3 bis 10 mg je ml Reagens, Glukose in einer Konzentration von 1,6 bis 6,6 mg je ml Reagens, Ficotinamidadenindinucleotid in einer Konsentration von

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0,6 bis 2 mg je ml Reagens, Hexokinase in einer Konzentration von 0,6 bis 3>3 internationalen Einheiten je ml Eeagens, Glukose-6-phosphat--dehydrogenase in einer Konzentration von 1,6 bis 5»0 internationalen Einheiten je ml Eeagens, ein Magnesiumsalz in einer Konzentration von 0,6 bis 6,6 mg je ml Eeagens und 2 bis 50 Mikromol je Liter Eeagenslösung an einer Verbindung, und zwar an Oxalsäure, Oxaminsäure und/oder deren Salzen.
12. Eeagens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der genannten Verbindung 2 bis 9 Mikromol je Liter Eeagenslösung beträgt.

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