DE2932748A1

DE2932748A1 - Verfahren zur bestimmung von transaminase in einer biologischen fluessigkeit und reagens hierfuer

Info

Publication number: DE2932748A1
Application number: DE19792932748
Authority: DE
Inventors: Giovanni Bucolo; Mathew M Madappally
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1978-08-14
Filing date: 1979-08-13
Publication date: 1980-03-06
Also published as: US4241179A; GB2028500A; NL7906143A; BE878224A; FR2433751A1; JPS5526899A

Description

Patentanwalt· Dipl.-Ing. E. Eder Dipl.-Ing. K. Schieschke

3 München 40, ElfsabethstraB« 34

Verfahren zur Bestimmung von Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit und Eeagens hierfür

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung oder Untersuchung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase oder Glutamat-Pyruvat-Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere in menschlichem Blutserum. Im einzelnen bezieht sie sich auf ein Verfahren, bei dem L-Glutamat, erhalten durch Transaminierung, im Verlauf der Bestimmung durch eine Redoxreaktion oxydativ desaminiert wird unter gleichzeitiger Bildung von reduziertem ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge, wobei der störende Einfluß einer anderen Substanz in der Flüssigkeit ausgeschaltet wird, welche, ohne quantitativ in Beziehung zu der zu untersuchenden Flüssigkeit zu stehen, mit dem gebildeten reduzierten ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid einer Redoxreaktion unterliegt, wodurch die Genauigkeit der Bestimmung beeinträchtigt wird. Außerdem sieht die Erfindung eine Reagenskombination zur Verwendung in diesem Verfahren vor.

Die Aktivität der Enzyme Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT), auch unter der Bezeichnung Aspartat-Aminotransferase bekannt, sowie Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), auch als Alanin-Aminotransferase bekannt, in biologischen Flüssigkeiten wurde in der Vergangenheit durch die indirekte Erfassung eines der Produkte

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einer Transaminierungsreaktion bestimmt, die durch die zu bestimmende Transaminase katalysiert wurde. Ein Verfahren, das gewisse Vorteile aufweist, beinhaltet die Bildung von L-Glutamat aus at/ - Ketoglutarat (2-Oxoglutarat) durch Transaminierung. Bei der Bestimmung von GOT wird das c6- Ketoglutarat mit L-Aspartat und bei der Bestimmung von GPT mit L-Alanin in Reaktion gebracht. Bei einer Redoxreaktion des L-Glutamats mit ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in oxydierter Form (NAD) in Anwesenheit des Enzyms Glutamat-Dehydrase (GLDH) als Katalysator wird das L-Glutamat oxydativ desaminiert, und das NAD wird in die reduzierte Form (NADH) der Verbindung umgewandelt. Die entstandene Menge an NADH ist proportional der Aktivität der Transaminase in der biologischen Flüssigkeit. Das NADH wird mit 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl-tetrazolchlorid (INT) in einer Redoxreaktion umgesetzt, um die reduzierte Form (INTH) dieser Verbindung zu erhalten, proportional zur Aktivität der Transaminase in der Flüssigkeit. Das INTH ist quantitativ durch Messung der Lichtabsorption bestimmbar, vorzugsweise bei einer maximalen Absorption von 500 nm. Die Farbe ist sehr beständig und intensiv und daher meßbar. Die Absorption ist über einen großen dynamischen Bereich hinweg proportional der Konzentration von GOT oder GPT in der Flüssigkeit.

Die vorgenannten Reaktionen, die gekoppelt durchgeführt wurden durch Inkubation der biologischen Flüssigkeit mit einem einzigen Reaktionsgemisch können wie folgt dargestellt werden:

1A. «t - Ketoglutarat + .L-Aspartat _Gq_T

L-Glutamat + Oxalacetat ^

oder

1B. ου- Ketoglutarat + L-Alanin _GpT

L-Glutamat + Pyruvat *

2. L-Glutamat + NAD + H₀O

■ GLDH

- Ketoglutarat + NADH + NH,

3. NADH + INT ν NAD + INTH

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GOT = Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

GPT = Glutamat-Pyruvat-Transaminase

GLDH = Glutamat-Dehydrase

NAD = ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid

NADH = Reduzierte Form von NAD

INT = 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl-

tetrazolchlorid

INTH ss Reduzierte Form von INT

Die Reaktion 3 kann nicht-enzymatisch katalysiert werden durch N-Methyl-Phenazon-Methosulfat (PMS, auch als Phenazin-Methosulfat bezeichnet), oder enzymatisch durch Diaphorase. Dabei hat die Diaphorase den Vorzug, da sie die Reaktion schneller katalysiert, von Licht nicht beeinflußt wird und nicht wie PMS selbstoxydabel ist. Die Diaphorase eignet sich auch zur Durchführung kinetischer Messungen der Transaminaseaktivität, wobei der Grad der INTH-Farbbildung dem Zeitfaktor gegenübergestellt wird.

Die vorstehend beschriebene Methode ist zwar vorteilhaft, jedoch enthalten die biologischen Flüssigkeiten endogene Stoffe, die unter Bildung von NADH an enzymatisehen Redoxreaktionen beteiligt sind und dadurch die Bestimmung stören. Das Gleichgewicht der Reaktion 2 verschiebt sich zur L-Glutamatbildung bei einem pH-V/ert von etwa 7-8. Infolgedessen sind hohe GLDH-Konzentrationen erforderlich, um hinsichtlich der Konzentration von vorhandenem GOT oder GPT lineare Ergebnisse zu erzielen. Bei Anwesenheit von hohen Konzentrationen an GLDH unterliegen bestimmte Aminosäuren in den Flüssigkeiten Oxidationsreaktionen, die aufgrund der geringen Spezifität des Enzyms GLDH zu einer äquivalenten Bildung von NADH führen. Das aus solchen Aminosäuren gebildete unspezifische NADH führt zu unspezifischer Färbung aufgrund resultierender INTH-Bildung und einer fälschlichen Erhöhung der Transaminase-Aktivität in der biologischen Flüssigkeit. Infolge der starken Veränderlichkeit des Aminosäurengehalts bei verschiedenen Flüssigkeitsproben ist die fälschliche Erhöhung der Aktivität nicht vorhersehbar, und zahlreiche Bestimmungen nach diesem Verfahren sind dadurch wertlos.

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In biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Blutsertim, sind außerdem Lactat und das Enzym Lactatdehydrase (LDH) in veränderlichen Konzentrationen vorhanden. Aufgrund der Aktivität des Enzyms erhöhen diese Substanzen den Gehalt an NADH in der Probe. In der Vergangenheit wurden dem Medium Oxamat oder Oxalat zugesetzt, um Lactatdehydrase zu hemmen.

Es gibt noch mehrere andere Verfahren, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei biologischen Flüssigkeiten, die störende endogene Stoffe enthalten, zu erhöhen. So kann für jede Flüssigkeitsprobe ein Blindversuch (Kontrollbestimmung) durchgeführt werden, wobei ein Reagens ohne to - Ketoglutarat verwendet wird. Dieses Verfahren verursacht wesentlich höhere Kosten für Aufwand und Reagensmaterial. Vor der Bestimmung kann auch L-Glutamat mit dem Enzym Glutamat-Decarboxylase aus der Flüssigkeit entfernt werden. Dieses Enzym entfernt jedoch nicht andere Substanzen, die ebenfalls Substrate für GLDH sind. Ein anderes Verfahren, durch das in gewissem Grad die aus der Oxidation endogener Stoffe resultierende unspezifische Färbung korrigiert werden kann, besteht darin, zu zwei verschiedenen Zeitpunkten Messungen vorzunehmen und die Bestimmung kinetisch durchzuführen. Dieses Verfahren ist jedoch für eine automatisierte Bestimmung nicht geeignet.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Nachteile der vorbekannten Verfahren zu umgehen und ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit zu schaffen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die in Anspruch 1 aufgeführten Merkmale.

Des weiteren sieht die Erfindung eine neue und verbesserte Reagenskombination zur Verwendung bei der genannten Transaminase-Bestimmung vor. Zu Beginn wird der Flüssigkeit ein erstes Reagenz beigemischt, um die Oxidation der endogenen Substanz zu bewirken

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und das gebildete reduzierte ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid zu oxydieren. Ein zweites Reagens wird dem Produkt aus der Reaktion mit dem ersten Reagens beigemenjfc, um die Lactatdehydrase-Aktivität zu hemmen und sodann durch Transaminierung eine bestimmte Menge L-Glutamat zu bilden in Anwesenheit der Transaminase in der Flüssigkeit, wodurch 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetra~ zolchlorid in reduzierter Form und in einer Menge proportional dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit gebildet wird.

Durch das erfindungsgemäß verbesserte Verfahren wird eine Farbentwicklung aufgrund unspezifischer Reaktionen von Glutamat-Dehydrase in Anwesenheit von ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid mit endogenen Aminosäuren in der biologischen Flüssigkeit ausgeschaltet sowie deren beider Reaktion mit endogener Lactat-Dehydrase vermieden, wodurch eine wesentlich genauere Bestimmung erzielt wird, Phasenverzögerungen, wie sie bei gekoppelten oder mehrstufigen enzymatxschen Reaktionen üblich sind, werden durch eine Optimierung von Komponenten und Bedingungen reduziert.

Die Methode ist empfindlich und erfordert nur eine sehr kleine Menge biologischer Flüssigkeit für jede Untersuchung. Die Bestimmung ist mit üblicher Laborausstattung in nur einem Gefäß, z.B. einem Glasröhrchen, rasch durchführbar. Die Bestimmung wird bei einem einzigen Bestimmungspunkt durchgeführt.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Bei der Bestimmung von Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit nach der Erfindung wird eine störend wirksame endogene Aminosäure aus der Flüssigkeit durch Oxidation der Aminosäure bei gleichzeitiger Reduzierung von NAD zu NADH entfernt. Die Reaktion kann dabei wie folgt dargestellt werden:

4. Endogene Aminosäure + NAD + H₀O

Ketosäure + NADH + NH₃ '

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Störend wirkende Aminosäuren in Blutserum umfassen Glutaminsäure, Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin und oo -Aminobuttersäure. Die Reaktion 4· entspricht im Grunde der Reaktion 2. Als nächstes wird das NADH in seinen oxydierten Zustand rückgeführt, um eine Störung der nachfolgenden Bestimmung zu verhindern, und zwar durch folgende Reaktion:

5. NADH + Pyruvat LSH ν NAD + Lac tat

wobei

LDH = Lactat-Dehydrase

Die Reaktionen 4 und 5 werden in einer ersten Bestimmungsphase als gekoppelte Reaktionen durchgeführt, wobei der Flüssigkeit ein einziges Reagens wie nachfolgend beschrieben hinzugefügt wird.

Das Lactat-Dehydrase-Enzym mit hinzugefügtem und endogenem Enzym wird nun gehemmt oder inaktiviert, um eine Störung des folgenden Teils der Bestimmung zu verhindern. Unter den gegebenen Bedingungen für die Bestimmung, insbesondere bei dem in dem Reaktionsgemisch gegebenen pH-Wert, kann das Enzym durch Hinzufügen der Anionen von Oxamsäure und Oxalsäure gehemmt werden. Oxamat dient dazu, die LDH-Aktivität bei der Reaktion 5 in Reaktionsrichtung zu hemmen, während Oxalat die LDH-Aktivität in entgegengesetzter Richtung hemmt.

Nach Hemmung des Enzyms LDH kann die Bestimmung der Transaminase ohne Störung durch die endogenen Stoffe stattfinden, indem die Reaktionen 1A oder 1B, 2 und 3 gekoppelt durchgeführt werden. Die Reaktion 3 wird vorzugsweise durch Diaphorase katalysiert. Die Enzymhemmung und die vorgenannten Reaktionen werden in einer zweiten Phase der Bestimmung durchgeführt, unter Hinzufügung eines Reagens zu dem Reaktionsgemisch wie nachfolgend beschrieben.

Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt wird die enzymatische Aktivität durch Ansäuern beendet, vorzugsweise mit verdünnter Salzsäure. Es wird die Absorption des Reaktionsprodukts bei 500 mn gemessen,

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und die GOT- oder GPT-Aktivität wird errechnet, indem ein Vergleich mit der Absorption einer Kontrollprobe von bekannter GOT- oder GPT-Aktivität vorgenommen wird. Es kann jedoch auch die enzymatische Aktivität erhalten bleiben und die Veränderung der Absorption bei 500 nm über einen bestimmten Zeitraum verfolgt werden, wobei die Aktivität anhand des molaren Extinktionskoeffizienten von reduziertem INT errechnet wird.

Die Reaktion 1B wurde in einem vorbekannten Verfahren zur Bestimmung von GPT mit Reaktion 5 gekoppelt. Der Reaktion 5 folgt eine Abnahme der Absorption bei 340 nm, d.h. in direktem Verhältnis zur GPT-Aktivität. Dieses Verfahren ist jedoch mit Geräten, die nicht für kontinuierliche Messungen bei 34-0 nm ausgelegt sind, nicht leicht durchführbar und bei einer großen Anzahl von Untersuchungen nicht gut geeignet.

Nach einem bevorzugten Verfahren werden der biologischen Flüssigkeit, z.B. menschlichem Blutserum, nacheinander zwei Hauptreagenzien beigefügt und inkubiert. Das erste Reagens enthält zumindest das Material, das für die Durchführung der den Reaktionen 2 und 5 entsprechenden Reaktion 4- erforderlich ist sowie für die Oxidation jeder anderen störenden endogenen Substanz. So enthält das erste Reagens NAD, GLDH, Pyruvat und LDH. Das zweite Reagens enthält zumindest die Stoffe, die für die Hemmung der enzymatischen Aktivität des LDH erforderlich sind. Insbesondere enthält das zweite Reagens Oxamat und Oxalat.

Jedes dieser Reagenzien kann die verbleibenden, für die Reaktionen 1A oder 1B erforderlichen Stoffe enthalten. So kann jedes der Reagenzien L-Aspartat oder L-Alanin sowie oC - Ketoglutarat enthalten. Die Diaphorase und das INT müssen jedoch in verschiedenen Reagenzien enthalten sein, um eine Diaphorasereaktion vor der Hemmung der LDH-Aktivität sowie eine eventuelle Nebenreaktion bei langem Stehen zu verhindern. Wenn öo- Ketoglutarat und L-Aspartat oder L-Alanin in dem ersten Reagens zusammen enthalten sind, finden Reaktionen 1A oder 1B und 2 zusammen mit Reaktionen 4- und 5 statt. Dieses

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Verfahren kann, falls gewünscht, durchgeführt werden, doch ist es vorzuziehen, auf der einen Seite das oL - Ketoglutarat und auf der anderen das L-Aspartat oder L-Alanin in verschiedenen Reagenzien zu verwenden. Dann finden die Reaktionen 1A oder 1B und 2 nur statt, nachdem das zweite Reagens hinzugefügt wurde.

Die Reagenzien werden in wäßrigen Lösungen wasserlöslicher Materialien in destilliertem oder deionisiertem Wasser verwendet. Die Reagenslösung hat jeweils einen bevorzugten pH-Wert im Bereich von etwa 7,3 - 8. Im allgemeinen können von Säuren stammende Reagensmaterialien in der freien Säure oder in Form eines wasserlöslichen Salzes verwendet werden, solange der pH-Wert des Reagens und die Konzentration des reagierenden Anions konstant bleibt, es sei denn, es sind keine Kationen vorhanden, die die an den Reaktionen beteiligten Enzyme hemmen oder beeinträchtigen. Die Salze, besonders die Alkalimetallsalze stellen im allgemeinen die bevorzugte Form für die Verwendung in den Reagenslösungen dar, und zwar aus Gründen der Stabilität bei der Lagerung und infolge ihrer Löslichkeit.

Der pH-Wert wird durch einen Puffe:peingestellt und aufrechterhalten, der aus der Reihe der Phosphat- oder Nichtphosphat-Puffer kommen kann, wie sie für diesen Zweck bekannt und geeignet sind. Die bevorzugten Puffer umfassen Phosphatpuffer, "Tris" /bris(Hydroxyme thyl) -aminomethan/ ¹^d. "Tricine" /N-tris(Hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfosäure_7· Vorzugsweise wird ein Alkalimetallphosphatpuffer verwendet. In diesem Fall wird der gewünschte pH-Wert dadurch erzielt, daß einbasiges und zweibasiges Phosphat in einem geeigneten Verhältnis verwendet werden, z.B. durch Titrieren einer Lösung aus einbasigem Phosphat gegen eine Lösung aus zweibasigem Phosphat auf den gewünschten pH-Wert. Der Puffer kann jedoch auch hergestellt v/erden, indem einer Phosphorsäurelösung ein starkes Alkali wie z„B. Kalium oder Natriumhydroxid hinzugefügt wird, um d^n gewünschten pH-Wert zu erhalten.

Das erste Reagens enthält Adenosin-5'-dipfcD6phat als Stabilisator für GLJH und um die Spezifität des GLDH gegenüber L-Glutamat zu

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erhöhen und die Aktivität des GLDH gegenüber anderen Aminosäuren zu verringern, insbesondere gegenüber Alanin. Entweder dem ersten oder zweiten Reagens wird vorzugsweise ein oberflächenaktxves Mittel beigesetzt, um das INGH in Lösung zu halten und die dadurch erhaltene Farbe zu stabilisieren. Als solches Mittel kommen lösliches Cholesterin (Solulan C-24), Polyoxyethylen (20) Sorbitmonooleat (Tween 20) und Polyoxyethylen (50)-Stearat (Myrj) in Betracht.

Die Tabelle 1 zeigt eine Zusammensetzung, wie sie vorzugsweise für das erste Reagens verwendet wird, zusammen mit den jeweiligen Materialanteilen. Die Tabelle 2 zeigt dementsprechend · eine Zusammensetzung, wie sie vorzugsweise als zweites Reagens Verwendung findet. Die Reagenzien werden in wäßrigen Lösungen der entsprechenden Stoffe verwendet, wobei die angegebenen Mengen pro Liter Lösung gelten.

₌TABELLE_1₌

Material Menge

Alkalimetall-Ir-Aspartat 100-200 Millimol

oder

L-Alanin 150-300 Millimol

Alkalimetall-Pyruvat 0,25-1 Millimol

Alkalimetall-Adenosin-5'-diphosphat 1-5 Millimol Alkalimetall-Phosphat-, Tris- oder

Tricine-Puffer, pH-Wert 7,3-8 25-150 Millimol

ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid 2-5 Millimol

Glutamat-Dehydrase 40-80 I.U. χ 10^

Lactat-Dehydrase 0,2-0,5 Ι·ϋ. χ 1(X

Diaphorase 1-3 I.U.χ 10^

Obaflächenaktives Mittel 10-30 g/l (wie oben beschrieben)

Das Aspartat wird zur Bestimmung von GOT, das Alanin für die Bestimmung von GPT verwendet.

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TABELLE_2_ Material Menge

Alkalimetall- <*- Ketoglutarat 10-50 Millimol

Alkalimetall-Oxalat 25-75 Millimol

Alkalimetall-Oxamat 10-30 Millimol

Alikalimetall-Phosphat-, Tris- oder

Tricine-Puffer, pH-Wert 7,3-8 - 25-150 Millimol

2-p-Jodophenyl-3~p-nitrophenyl-

5-phenyltetrazolchlorid 0,2-1 Millimol

Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht Zusammensetzungen und Verfahren zur Durchführung von Transaminasebestimmungen nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Natürlich ist die Erfindung nicht auf die Materialien, Anteile, Bedingungen und Verfahrensschritte beschränkt, wie sie in dem Ausführungsbeispiel angeführt sind, da diese nur beispielhaften Charakter haben.

Beispiel

Die Transaminase-Aktivität in menschlichem Blutserum wird unter Verwendung der ersten und zweiten Reagenslösungen bestimmt. Die erste Lösung hat dabei einen pH-Wert von etwa 7»4 - 0,1 und enthält die in Tabelle 3 aufgeführten Stoffe, die in destilliertem oder deionisiertem Wasser in den angegebenen Anteilen gelöst vorhanden sind. Das Aspartat wird in der Lösung verwendet, wenn GOT bestimmt werden soll, und das Alanin, wenn GPT bestimmt wird.

TABELLE 3 Material Menge

Kalium-L-Aspartat 125 Millimol

oder

L-Alanin 180 Millimol

Natriumpyruvat 0,25 Millimol

Natrium-Adenosin-5'-diphosphat, 2,5 Millimol

Monohydrat t - ." . _.

ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid

(90% rein) 2,25 Millimol

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Glutamat-Dehydrase 60 I.U. χ 10*

Lactat-Dehydrase 0,25 I.U. χ 10*

Diaphorase 1,75 I.U. χ 10^ Wasserlösliches Cholesterin

(Solulan C-24-) 20 g

Die Phosphatsalze werden in einem Gewichtsverhältnis von etwa 7 Teilen K₂HPO₄ zu 1 Teil KH₂PO₄ (14,68 g K₂HPO₄ und 2.14- g KH₂PO₄ pro Liter zur Erzielung von 100 Millimol/Liter Lösung) verwendet.

Die Glutamat-Dehydrase ist frei von Ammoniak und wird aus Rinderleber gewonnen. Die Lactat-Dehydrase stammt aus Rindermuskel und kann auch aus Rinderherz, Schweinemuskel oder Schweineherz, Kaninchenmuskel oder anderen Quellen gewonnen werden, die das für L-Lactat spezifische Enzym liefern. Die Diaphorase stammt aus Clostridium kluyveri. Die Enzyme sind aus verschiedenen Quellen im Handel erhältlich.

Die zweite Reagenslösung hat einen pH-Wert von etwa 7 »4· - 0,1 und enthält die in Tabelle 4- aufgeführten, in destilliertem oder delonisiertem Wasser in den angegebenen Anteilen gelösten Stoffe.

_TABELLE_4:_

Material Menge pro Liter

Natrium-flt-Ketoglutarat 25 Millimol

Kaliumoxalat 53,5 Millimol

Natriumoxamat 20 Millimol

KoHPOf,, wasserfrei)

^ * ) 100 Millimol

KH₂PO₄, wasserfrei)

2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-

5-phenyltetrazolchlorid 0,5 Millimol

Die Phosphatsalze wurden in einem Gewichtsverhältnis von ca. 7,8 Teilen K₂HPO₄ zu 0,7 Teilen KH₂PO₄ (7,835 g K₂HPO₄ und ca. 0,682 g KH₂PO₄ pro Liter zur Erzielung von 100 Millimol/Liter Lösung) verwendet.

Zur Durchführung der Bestimmung werden 0,5 ml der ersten Reagenslösung auf 37°C vorgewärmt. 50 Mikroliter des zu untersuchenden Serums werden in einer Küvette gemischt und diese Mischung wird fünf Minuten bei 37⁰C inkubiert. Nun werden 0,5 ml der zweiten auf 37°C erwärmten Reagenslösung der Mischung zugesetzt, und die entstandene Mischung wird fünfzehn Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann werden der Mischung 3 ml 0,1N Salzsäure beigemengt, um die enzymatische Reaktion und Farbbildung zu beenden. Die Absorption bei 500 nm wird an einem Spektrophotometer abgelesen.

Die Absorption wird mit einer Blindprobe (Kontrollreagens) verglichen, die auf den Absorptionswert Null eingestellt ist. Die Aktivität der Transaminase in der Serumprobe wird aus der Absorption errechnet, die auf die gleiche Weise mit einem Eichserum mit bekanntem GOT- oder GPT-Enzymgehalt erhalten wird, wobei jedoch statt des Testserums das Eichserum bei dem Versuch Verwendung findet.

PKtenttnwlH· Dlpl.-Inofe Edtr Dipl.-Ing. K& 8 Mönchen AtC&Lthe^^^S 84

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Claims

Patentanwllto

DJpl.-Ing. E. Eder O Q O ο 7 / Q

Dlpl-Ing. K. Schleschke * 3 0 ^ / 4 Ö

* Mönchen 40, Elleabethstraße 34

Ίο 317

COULTER ELECTRONICS, INC. 590 West 20th Street
Hialeah, Florida 33010, USA

Patentansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase oder Glutamat-Pyruvat-Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit, wobei L-Glutamat durch Transaminierung in Anwesenheit der Transaminase in der Flüssigkeit aus cc - Ketoglutarat gebildet und in Anwesenheit von Glutamat-Dehydrase oxydativ desaminiert wird unter gleichzeitiger Bildung von reduziertem ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge, und wobei die Flüssigkeit eine endogene Substanz enthält, die in Anwesenheit von Glutamat-Dehydrase oxydiert wird unter gleichzeitiger Bildung von die Bestimmung beeinträchtigendem reduziertem ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß

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die Beeinträchtigung durch die endogene Substanz ausgeschaltet wird, indem

a) die endogene Substanz in Anwesenheit von Glutamat-Dehydrase oxydiert wird bei gleichzeitiger Reduzierung von ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid,

b) das erhaltene reduzierte ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid

in Anwesenheit von Lactat-Dehydrase oxydiert wird bei gleichzeitiger Reduzierung von Pyruvat zu Lactat, und indem sodann die Lactat-Dehydrase-Aktivität gehemmt wird,

c) durch Transaminierung eine Menge L-Glutamat aus oc - Ketoglutarat gebildet und oxydativ desaminiert wird unter gleichzeitiger Bildung von reduziertem ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit in menschlichem Blutserum besteht.

3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die endogene Substanz eine Aminosäure enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactase-Dehydrase-Aktivität durch die Anionen von Oxamsäure und Oxalsäure gehemmt wird.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin das reduzierte ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Produkt mit 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolchlorid in Reaktion gebracht wird, wobei die reduzierte Form dieser Verbindung in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge erhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Anwesenheit von Diaphorase stattfindet.

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?. Verfahren zur Bestimmung von Glutamat-Pyruvat-Transaminase oder Glutamat-Oxalacetat-Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine Mischung aus biologischer Flüssigkeit, ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid und Glutamat-Dehydrase inkubiert wird, wobei in der Flüssigkeit enthaltene, in Anwesenheit von Glutamat-Dehydrase oxydierende endogene Substanzen oxydiert werden bei gleichzeitiger Reduzierung von ß-Nicotinamid-Adenin-JJinucleo tid,

b) in der erhaltenen Mischung Pyruvat und Lactat-Dehydrase enthalten sind und die Mischung inkubiert wird, wobei das reduzierte ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid oxydiert wird bei gleichzdtiger Reduzierung von Pyruvat zu Lactat,

c) die enzymatische Aktivität der Lactat-Dehydrase in der erhaltenen Mischung gehemmt wird, und

d) in der erhaltenen Mischung <^ - Ketoglutarat, ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, Glutamat-Dehydrase und L-Alanin oder L-Aspartat enthalten sind und die Mischung inkubiert wird, wobei L-Glutamat durch Transaminierung gebildet und oxydativ desaminiert wird, und wobei gleichzeitig reduziertes ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge gebildet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit in menschlichem Blutserum besteht und die endogenen Substanzen eine Aminosäure umfassen.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Hemmung der enzymatischen Aktivität der Lactat-Dehydrase der erhaltenen Mischung Oxamat und Oxalat beigegeben werden.

10· Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltenen Mischung Diaphorase und 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolchlorid b eigegeben w erden, wobei die

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reduzierte Form dieser Verbindung in einer dem Gehalt an Iransaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge gebildet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit in menschlichem Blutserum besteht und die endogenen Substanzen eine Aminosäure einschließen, und daß zur Hemmung der enzymatischen Aktivität der Lactat-Dehydrase der erhaltenen Mischung Oxamat und Oxalat beigegeben werden.

12. Reagenskombination zur Bestimmung von Glutamat-Pyruvat-Transaminase oder Glutamat-Oxalacetat-Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit, gekennzeichnet durch ein erstes Reagens, das ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, Glutamat-Dehydrase, Pyruvat und Lactat-Dehydrase enthält und das der Flüssigkeit zu Beginn beigegeben wird, wobei in der Flüssigkeit vorhandene endogene Substanzen oxydiert werden und eine Beeinträchtigung der Bestimmung verhindert wird, und wobei ein ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in oxydierter Form enthaltendes Produkt gebildet wird, sowie durch ein zweites Reagens, das Oxamat und Oxalat enthält und das dem Produkt zur Hemmung der enzymatischen Aktivität der Lactat-Dehydrase beigemengt wird, wobei in einem der Reagenzien L-Aspartat, «. - Ketoglutarat, Diaphorase und 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolchlorid sowie L-Alanin oder L-Aspartat enthalten sind, und wobei die reduzierte Form dieser Verbindung gebildet wird in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge.

13· Reagens zur Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase in einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Reagens folgende Materialien in den jeweils angegebenen Anteilen enthält:

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Material

Alkalimetall-Pyruvat
Adenosin-5'-diphosphat Alkalimetall-Phosphat-, Tris- oder

Tricine-Puffer, pH-Wert 7,3-8 ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid Glutamat-Dehydrase
Lac tat-Dehydras e
Diaphorase

Wasserlösliches Cholesterin (Solulan C-24-)

Menge

0,25-1 Millimol 1-5 Millimol

25-150 Millimol 2-5 Millimol 40-80 I.U. χ 0,2-0,5 I.U. x 1-3 I.U. χ 10⁵

20 g

und daß dieses Reagens der Flüssigkeit zu Beginn beigemerg; wird, wobei in der Flüssigkeit enthaltene endogene Substanzen oxydiert werden und eine Beeinträchtigung der Bestimmung verhindert wird, und wobei ein das ß-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in oxydierter Form enthaltendes Produkt gebildet wird, und daß ein zweites Reagens folgende Materialien in den jeweils angegebenen Anteilen enthält:

Material

Alkalimetall-«/- Ketoglutarat Alkalimetall-Oxalat

Alkalimetall-Oxamat

Alkalimetall-Phosphat-, Tris- oder

Tricine-Puffer, pH-Wert 7,3-8 2-p-Jodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolchlorid

Menge

10-50 Millimol 25-75 Millimol 10-30 Millimol

25-150 Millimol 0,2-1 Millimol

und daß dieses zweite Reagens dem erhaltenen Produkt zur Hemmung der enzymsttisehen Aktivität der Lactat-Dehydrase beigemeig; wird, wobei die reduzierte Form von 2-p-Jodophenyl-3-pnitrophenyl-5-phenyltetrazolchlorid in einer dem Gehalt an Transaminase in der Flüssigkeit proportionalen Menge gebildet wird, und wobei das erste Reagens zur Bestimmung der Glutamat-

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Pyruvat-Transaminase bzw. Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
100-200 Millimol Alkalimetall-L-Aspartat bzw. 150-300 Millimol L-Alanin enthält.

14-. Reagenskombination nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensmaterialien jeweils in wäßriger Lösung und in den angegebenen Mengen pro Liter Lösung enthalten sind.

Patentanwälte Dlpl.-Ing. E. Eder

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