DE3117952C2

DE3117952C2 -

Info

Publication number: DE3117952C2
Application number: DE19813117952
Authority: DE
Inventors: Toshiro Kikuchi; Noboru Tsuruga Jp Mitsuhida
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1980-05-06
Filing date: 1981-05-06
Publication date: 1991-04-25
Also published as: JPS6262160B2; DE3117952A1; JPS56158097A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen angegebene Verfahren zur quantitativen Bestimmung von freier Fettsäure in Analysenproben.

Bekannte Methoden zur quantitativen Analyse von freier Fettsäure in Serum bestehen z. B. darin, die freie Fettsäure durch ein fettlösliches organisches Lösungsmittel zu extrahieren und durch eine Neutralisationstitration mit einem Alkali zu messen, was aber z. B. das Problem der verhältnismäßig schlechten Reproduzierbarkeit wegen der komplizierten Operationen mit organischen Lösungsmitteln, des nachteiligen Effektes beim Vorliegen von organischen Säuren und der unvermeidlichen technischen Fehler bei der Titrationsoperation mit sich bringt, oder die freie Fettsäure mit Kupfernitrat und Triethanolamin zur Bildung von deren Kupfersalz zu behandeln, das dann mit Chloroform extrahiert und mit einem Chelatbildungsmittel, wie Diethyldithiocarbamat zur Ausbildung einer Färbung umgesetzt wird, was aber z. B. Probleme wegen der komplizierten Operationen bei der Bildung der Kupfersalze mit organischen Lösungsmitteln und der möglichen schädlichen Wirkung auf den menschlichen Körper zur Folge hat.

Ein weiteres bekanntes Verfahren besteht darin, Acyl-CoA-Synthetase auf freie Fettsäure einwirken zu lassen und das so gebildete Adenosinmonophosphat (im nachfolgenden AMP genannt) durch die Verwendung von Myokinase, Pyruvat-kinase-System, zu messen (vgl. Takahashi et al, Rinsho Kagaku 4, 179, 1975). Diese Methode erfordert jedoch instabile Säurereagenzien, wie reduziertes Nikotinamid-adenin-dinucleotid (im nachfolgenden NADH genannt) und Phospho(enol) Pyruvat und vier Arten von Enzymen, was technische Schwierigkeiten bedingt und die praktische Anwendung bisher verhindert hat.

In Analytical Biochemistry, 108, 6-10 (1980) und DE-PS 29 44 498 werden Verfahren beschrieben, bei denen man Acyl-CoenzymA-Synthetase (im folgenden Acyl-CoA Synthetase genannt) auf freie Fettsäure in Gegenwart von Adenosintriphosphat (im nachfolgenden ATP genannt) und Coenzym A (im nachfolgenden CoA genannt) einwirken läßt, das so gebildete Acyl-CoA in Gegenwart von Sauerstoff mit Acyl-CoenzymA-Oxidase (im folgenden Acyl-CoA Oxidase genannt) reagieren läßt und die Menge von gemäß folgenden Reaktionen gebildetem Wasserstoffperoxid mißt.

worin (A) Acyl-CoA Synthetase, (B) Acyl-CoA Oxidase, RCOOH freie Fettsäure (worin R einen langkettigen Alkylrest mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet), ATP Adenosintriphosphat, CoA Coenzym A, RCO.CoA Acyl-CoA, AMP Adenosinmonophosphat, PPi Pyrophosphorsäure und R′-CH=CHCO.CoA Enoyl-CoA (worin R′ der gleiche Alkylrest ist, wie für R angegeben, aber nicht auch -CH₂-CH₂-) bedeuten.

Bei diesen Bestimmungen werden die erste und zweite Reaktion bei etwa pH 7,5 bis 8,0, d. h. beim pH-Optimum der verwendeten Enzyme durchgeführt.

Bei der Bestimmung des in der zweiten Reaktion erzeugten Wasserstoffperoxids können jedoch in diesem Reaktionssystem die bisher bekannte Technik zur Umsetzung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase mit einem Wasserstoffdonor (Chromogen), der nach Oxidation eine Färbung ausbildet (Fluoreszenz) und die Messung der so gebildeten farbentwickelten Substanz (Fluoreszenzsubstanz) kaum in üblicher bekannter Weise durchgeführt werden. Da die erste Reaktion unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von CoA erfolgt, wird die Genauigkeit obiger Wasserstoffperoxidmeßmethoden unweigerlich durch das Vorliegen von solchen reduzierenden Substanzen wie CoA beeinträchtigt, weshalb gemäß den beiden letztgenannten Druckschriften Thiolgruppenblockierungsmittel, wie N-Ethylmaleimid (im nachfolgenden NEM genannt) zum Einsatz gelangen. Solche Thiolblockierungsmittel können jedoch nicht für längere Zeit in einem flüssigen Zustand gehalten werden und wenn die Bestimmung unter gleichzeitiger Durchführung der zweiten Reaktion erfolgt, kann keine vollständige Blockierung erwartet werden, und es treten Schwierigkeiten bei der Ausschaltung der Wirkung dieser Thiolreste auf.

In Barman, Th. E., Enzyme Handbook, Vol. I, EC 1.11.1.7, Springer Verlag, Berlin werden Reaktionskonstanten von Peroxidasen aus unterschiedlichen Quellen auf verschiedene Enzymsubstrate wie H₂O₂, MeOOH und EtOOH beschrieben, wobei die Messungen bei pH 4,7 erfolgen. Die Bestimmung von Wasserstoffperoxid unter Einsatz von chromogenhaltigen farbbildenden Mitteln und üblicherweise verwendeter, aus Meerrettich gewonnener Peroxidase wird jedoch in der Regel bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 6,5 durchgeführt, da dies das pH-Optimum dieses Enzyms ist. Auch höhere pH-Werte von über 7,5 sind üblich, wie sich aus den beiden genannten Druckschriften, welche die Verwendung von Thiolgruppen-Blockiermitteln lehren, ergibt.

Aus JP-Abstract 51-1 15 889 ist die Umsetzung von Wasserstoffperoxid, das z. B. aus Glucose, Harnstoff oder Cholesterin durch die entsprechenden Oxidasen gebildet wurde, mit 4-Aminoantipyrin und Dimethylanilin in Gegenwart von Peroxidase bei pH 3-6 bekannt. In einem derartigen Reaktionssystem liegt jedoch keine reduzierende Substanz wie Acyl-Coenzym A vor, dessen Einsatz bei Durchführung eines Fettsäurebestimmungsverfahrens des erfindungsgemäßen Typs unerläßlich ist und das gemäß aufgezeigten Stand der Technik die Blockierung der reduzierenden Thiolgruppen bei pH-Werten über 7,5 und die Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids bei gleichem pH als notwendig erscheinen ließ.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von freier Fettsäure anzugeben, bei dem unter der bekannten Verwendung von Acyl-CoenzymA-Synthetase und Acyl-CoenzymA-Oxidase das gebildete Wasserstoffperoxid genauer, mit höherer Empfindlichkeit und mit besserer Reproduzierbarkeit als bisher möglich gemessen werden kann, ohne eine Blockierung der vorhandenen Thiolgruppen und die damit verbundenen Nachteile in Kauf nehmen zu müssen.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß in der im kennzeichnenden Teil des Hauptanspruchs angegebenen Weise unter Einsatz eines sauren Reagens und unter Einhaltung der genannten pH-Werte.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Reaktionsflüssigkeiten können über lange Zeitspannen sicher gelagert werden.

Bei der erfindungsgemäß verwendeten Acyl-CoA Synthetase handelt es sich um Säure: CoA Ligase (AMP), die auch Fettsäurethiokinase (langkettig) genannt wird. Die Enzymcodenummer ist E.C. 6,2,1,3. Dieses Enzym wird in tierischen Organen wie Rattenleber, Hühnchenleber und dergleichen gefunden und auch in verschiedenen Mikroorganismen, die beispielsweise zu Escherichia coli, Genus Pseudomonas, Genus Bacillus, Genus Candida, Genus Nocardia und dergleichen gehören. Dies spielt eine Rolle in der ersten Stufe im Fettsäure-β-Oxidationssystem der Überführung von freier Fettsäure mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen, insbesondere 12 bis 18 Kohlenstoffatomen in Acyl-CoA. Der optimale pH-Wert wird mit etwa 7,5 bis 9,0 angegeben und die Km (Michaelis Konstante) ist kleiner 10^-4 M.

Die verwendete Acyl-CoA Oxidase ist ein Enzym solchen Typs, das bei der Einwirkung auf Acyl-CoA in Gegenwart von Sauerstoff Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid erzeugen kann. Hochgradig gereinigte Acyl-CoA Oxidase wurde nur aus Rattenleber erhalten (Proceedings of Japanese Conference of the Biochemistry of Lipids Vol. 20, 1978). Es ist jedoch nunmehr auch gelungen, hochgradig gereinigte Acyl-CoA Oxidase aus Mikroorganismen zu erhalten, insbesondere aus Hefe, welche zum Genus Candida (vgl. DE-OS 30 07 399.5).

Erfindungsgemäß wird in der ersten Stufe freie Fettsäure mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen mit Acyl-CoA Synthetase in Gegenwart von ATP und CoA, vorzugsweise auch in Gegenwart von Magnesiumionen behandelt, um Acyl-CoA, AMP und Pyrophosphorsäure zu bilden. Die Acyl-CoA Synthetase ist vorzugsweise ein hochgradig gereinigtes Präparat. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und bei einem pH im Bereich von 6 bis 9,5 durchgeführt. In diesem Reaktionssystem kann Dithiothreitol, Mercaptoethanol, Glutathion (reduzierte Form) oder dergleichen als Antioxidans vorliegen.

In der zweiten Reaktionsstufe wird das so gebildete Acyl-CoA mit Acyl-CoA Oxidase in Gegenwart von Sauerstoff behandelt, um Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Die Acyl-CoA Oxidase kann aus Rattenleber gewonnen sein, stammt jedoch vorzugsweise von Genus Candida und insbesondere von Candida Lipolytica, in hochgradig gereinigter Form.

Die Reaktionsbedingungen werden vorzugsweise so gewählt, daß eine Temperatur von 20 bis 40°C und ein pH von 6,5 bis 7,5 eingehalten werden. FAD (Flavin-Adenin-Dinucleotid) kann in diesem Reaktionssystem ebenfalls vorliegen. Die erwähnte erste und zweite Reaktion können in einer Stufe oder in zwei getrennten Stufen durchgeführt werden und das so gebildete Wasserstoffperoxid wird dann gemäß einer quantitativen Analysenmethode bestimmt.

Für die quantitative Analyse von Wasserstoffperoxid gibt es kolorimetrische Methoden, die z. B. eines der folgenden Chromogene in Gegenwart von Peroxidase benutzen:

(a) 4-Aminoantipxyrin (im nachfolgenden 4-AA genannt) und Phenol (oder ein Phenolderivat),
(b) 3-Methyl-2-benzthiazolinon-hydrazon (im nachfolgenden MBTH genannt) und Dimethylanilin oder ein Derivat davon (im nachfolgenden DMA genannt),
(c) 4-AA und DMA oder Diethylanilin oder ein Derivat davon (im nachfolgenden DEA genannt).

Natürlich sind die verwendbaren Chromogene nicht auf die oben angegebenen beschränkt und jeder brauchbare Wasserstoffdonor (Chromogen), der zur Färbung durch die Oxidationswirkung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase befähigt ist, kann zufriedenstellend verwendet werden. Somit kann die Bestimmung von Wasserstoffperoxid durchgeführt werden, indem man von der oben erwähnten Reaktion zur Farbausbildung Gebrauch macht, die nach Beendigung oder gleichzeitig mit der erwähnten zweiten Reaktion durchgeführt werden kann.

Gemäß vorliegender Erfindung wird die kolorimetirsche Bestimmung von Wasserstoffperoxid mit einem Farbbildungsmittel durchgeführt, das ein saures Reagens enthält.

Als saures Reagens dient eine saure Substanz, die bei Zugabe zur zweiten Reaktionsflüssigkeit durch die vorhandene reduzierende Substanz nicht schädlich beeinflußt wird und dazu befähigt ist, den pH-Wert der Lösung in kurzer Zeit zu erniedrigen. Erfindungsgemäß verwendet werden Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure.

Der benutzte Farbbildner ist ein Wasserstoffdonor, der durch Wasserstoffperoxid oxidiert wird unter sauren Bedingungen, um eine Färbung auszubilden (Fluoreszenz). Beispiele solcher Farbbildner sind die Reagentien, die schon in Verbindung mit den kolorimetrischen Methoden unter Verwendung der Kobminationen von 4-AA und Phenol MBTH und DMA und von 4-AA und DMA als Chromogene aufgeführt wurden.

Der Farbbildner und das saure Reagens können der zweiten Reaktionsflüssigkeit gleichzeitig in Form des fertigen Farbbildungsmittels zugesetzt werden oder es kann das saure Reagens zuerst und der Farbbildner danach zugegeben werden.

Falls das saure Reagens und der Farbbildner gleichzeitig zur zweiten Reaktionsflüssigkeit zugesetzt werden, ist es notwendig, daß das Reaktionssystem nach dieser Zugabe bei pH 3,5 bis 6 gehalten wird. Wenn der pH-Wert geringer ist als 3,5, ist eine quantitative Analyse von freier Fettsäure im Probenmaterial nicht möglich wegen der geringeren Aktivität oder schlechteren Stabilität von Peroxidase und der verminderten Empfindlichkeit der Farbausbildung. Wenn der pH-Wert nach dieser Zugabe mehr als 6,0 beträgt, ist die erhaltene Lösung sehr stabil und bildet vorzeitig eine Färbung aus und es ist dann recht schwierig, die Menge an freier Fettsäure im Probenmaterial zu bestimmen. Da das System außerdem leicht durch reduzierende Substanzen mit beispielsweise Thiolgruppen nachteilig beeinflußt wird, ist eine genaue Ablesung stark erschwert.

Wird das saure Reagens zuerst zur zweiten Reaktionsflüssigkeit zugesetzt und der Farbbildner hinterher zugegeben, so ist es notwendig, daß das Reaktionssystem nach der Zugabe des sauren Reagens einen pH-Wert von 3 bis 5 hat. Wenn der pH-Wert geringer als 3 ist, ist die Durchführung der quantitativen Analyse von Fettsäure wegen der geringeren Aktivität von Peroxidase und der verminderten Empfindlichkeit für die Farbbildung schwierig. Wenn der pH-Wert mehr als 5 beträgt, besteht die Schwierigkeit der geringen Farbausbildungsgeschwindigkeit.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die wesentlichen Bestandteile des Reagens in den folgenden Anteilen vorliegen:

ATP\|0,5-200 mM
CoA	0,005-10 mM
Acyl-CoA Synthetase	0,01-10 mg/ml
Acyl-CoA Oxidase	0,01-10 mg/ml

Als bevorzugtes Beispiel für ein Farbbildungsmittel, welches ein saures Reagens enthält, können die folgenden Systeme genannt werden:

Das erste, zweite und dritte oben erwähnte System können bei den folgenden Bedingungen zur Reaktion gebracht werden:

Erste Reaktion
pH 6-9,5, 20-40°C
Zweite Reaktion	pH 6,5-7,5, 20-40°C
Dritte Reaktion (Farbbildung oder Entwicklung)	pH 3,5-6, 20-40°C.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Es wird teilweise auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, worin darstellen:

Fig. 1 eine Kalibrierungskurve (durchgezogene Linie) zu der Zeit, wo Natriumpalmitat durch Verwendung der vorliegenden Reagenszusammensetzung zur Fettsäurebestimmung benutzt wird, und eine Kalibrierungskurve (gestrichelte Linie) zu der Zeit, wo Wasserstoffperoxid durch Verwendung der gleichen Farbbildungslösungen A und B gemäß vorliegender Erfindung gemessen wird.

Fig. 2 eine Kurve, welche die Beziehung zwischen dem pH eines 1 : 1 Gemisches von Farbbildungslösungen A und B und der Farbausbildungsgeschwindigkeit zeigt.

Fig. 3 eine Kalibrierungskurve (ausgezogene Linie) zu der Zeit, wo Natriumpalmitat durch Verwendung einer herkömmlichen Reagenszusammensetzung zur Fettsäurebestimmung (Farbbildungslösungen C und D) gemessen wird und eine Kalibrierungskurve (gestrichelte Linie) zu der Zeit, wo Wasserstoffperoxid unter Verwendung der gleichen Mittel gemessen wird.

Fig. 4 die Variation mit der Zeit von Reagenszusammensetzungen zu Fettsäurebestimmungen, die jeweils verschiedenen pH-Wert haben.

Die in diesen Beispielen benutzten Enzyme sind wie folgt:

Acyl-CoA Synthetase

Ein Stamm (Pseudomonas aeruginosa IFO 12689, ATCC 10145, DSM 50071) des Genus Pseudomonas wird in Bernsteinsäuremedium gezüchtet und die Zellen gesammelt und mittels Glasperlen zerstört. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und wiederholt mit DEAE-Zellulose, Sephadex G 150 und dergleichen gereinigt.

Acyl-CoA Oxidase

Candida lypolytica IFO 1548, ATCC 18942 wird in einem Ölsäuremedium gezüchtet und die Zellen werden gesammelt und mittels Glasperlen zerstört. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt, wärmebehandelt und dann wiederholt mit DEAE-Zellulose, Sephadex G-150 und dergleichen gereinigt.

Beispiel 1

Die nachstehend erwähnte Reagenszusammensetzung wurde zur Bestimmung von freier Fettsäure zubereitet.

Reaktionsgemisch:
100 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2-ethansulfonsäurepuffer (pH 6,8)
1 mM EDTA · 3 Na
10 mM FAD (Falvin-adenin-dinucleotid)
0,5 mM CoA
10 mM ATP
10 mM MgCl₂

Acyl-CoA Synthetase
0,5 E/ml
Acyl-CoA Oxidase	0,5 E/ml
0,2% Triton X-100

Farbbildungslösung A:
12 ml Essigsäure, 25 mg MBTH, 0,25 ml DMA und ein saures Reagens wurden miteinander vermischt und das Gemisch mit destilliertem Wasser bis auf ein Volumen von 1000 ml aufgefüllt (pH 3,0).

Farbbildungslösung B:
5000 E (Einheiten) Peroxidase wurden in 1000 ml 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung gelöst (pH 6,5).

Unter Verwendung der obigen Reagenszusammensetzung zur Fettsäurebestimmung wurde die freie Fettsäure in Probenmaterial wie folgt bestimmt:
20 µl Natriumpalmitatlösung (1% Triton X-100 Lösung) wurden in ein Reagenzglas pipettiert und 0,5 ml des Reaktionsgemisches (pH 6,8) zugefügt.

Nach Umsetzung bei 37°C für 20 min wurde das Gemisch mit 2,0 ml einer 1 : 1-Mischung von Farbbildungslösung A (saures Reagens) und B versetzt und bei pH 4,3 die Färbung entwickelt. Nach 10minütigem Stehen wurde die Absorption bei OD₅₉₀ unter Verwendung von Wasser als Bezugslösung gemessen. Als Blindprobe wurde eine 1%ige Triton X-100 Lösung anstatt Natriumpalmitatlösung benutzt und das gleiche Verfahren wiederholt. Die Kalibrierungskurve ist in Fig. 1 gezeigt. Diese Kalibrierungskurve stimmte mit der Kalibrierungskurve überein, die unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als Standardsubstanz und Bestimmung mit der obigen Reaktionsmischung, jedoch unter Ausschluß von CoA davon, und Farbbildungslösungen A und B, erhalten wurde. In Fig. 1 ist die feste Linie diejenige für Natriumpalmitat und die gestrichelte Linie für Wasserstoffperoxid.

Vergleichsbeispiel 1

Fig. 2 ist eine Kurve, welche die Beziehung zwischen dem pH der 1 : 1-Mischung von Farbbildungslösungen A und B und der Farbbildungsgeschwindigkeit (Farbentwicklung) zeigt. Wenn der pH-Wert der 1 : 1-Mischung von Farbbildungslösungen A und B über 6.0 stieg, wurde diese Mischung sehr instabil und bildete leicht eine Färbung aus. Daher konnte eine solche Mischung nicht zur Bestimmung von freier Fettsäure im Probenmaterial benutzt werden. Wenn der pH-Wert weniger als 3,0 betrug, war die Mischung selbst stabil, jedoch war die Peroxidaseaktivität oder -stabilität gering und die Empfindlichkeit der Farbausbildung war schlecht und das Gemisch konnte daher nicht zur Bestimmung der freien Fettsäure im Probenmaterial benutzt werden. In dieser Figur bedeutet die Ziffer 1 den Fall, wo das pH der 1 : 1-Mischung der Farbbildungslösungen A und B 4,7 war, die Ziffer 2 ist der Fall mit pH 4,2, Ziffer 3 ist der Fall mit pH 4,1, Ziffer 4 ist der Fall mit pH 3,8, Ziffer 5 ist der Fall mit pH 3,0 und Ziffer 6 ist der Fall mit pH 2,5.

Vergleichsbeispiel 2

Es wurde ein Fettsäurebestimmungsreagens der folgenden Zusammensetzung zubereitet:

Reaktionsgemisch:
Gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 1.

Farbbildungslösung C:
5 mM NEM (pH 7,0)

Farbbildungslösung D:
30 mg 4-Aminoantipyrin
300 mg p-Chlorphenol
aufgefüllt auf 100 ml mit 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,5).

Unter Verwendung der obigen Reagenszusammensetzung wurde die freie Fettsäure im Probenmaterial wie folgt bestimmt: 50 µl Natriumpalmitatlösung (1% Triton X-100 Lösung) wurden in ein Reagensglas pipettiert und 0,5 ml des Reaktionsgemisches zugefügt. Nach 20minütiger Umsetzung bei 37°C wurde das Gemisch mit 2,0 ml einer 1 : 1-Mischung der Farbbildungslösungen C und D versetzt und die Farbentwicklung bei pH 7,5 durchgeführt. Nach 10minütigem Stehen wurde die Absorption bei OD₅₀₀ gemessen, wobei Wasser als Bezugslösung verwendet wurde. Als Blindprobe wurde 1%ige Triton X-100 Lösung anstelle von Natriumpalmitatlösung benutzt und die gleiche Arbeitsweise wiederholt. Die Kalibrierungskurve ist in Fig. 3 angegeben. Diese Kurve zeigt, daß die Ergiebigkeit bei Palmitinsäure nur 81% der Kalibrierungskurve mit Wasserstoffperoxid erreicht. In Fig. 3 ist die ausgezogene Linie diejenige mit Natriumpalmitat als Standardsubstanz und die gestrichelte Linie ist diejenige mit Wasserstoffperoxid. In letzterem Fall wurde Wasserstoffperoxid bestimmt, indem das gleiche Reaktionsgemisch wie oben erwähnt benutzt wurde, jedoch unter Ausschluß von CoA und Farbbildungslösungen C und D.

Beispiel 2

Mit den gleichen Reaktionsgemischen wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, jedoch jeweils mit unterschiedlichem pH-Wert wurde die Variation mit der Zeit in jedem Fall untersucht. Die pH-Werte dieser Reaktionsgemische waren 6,5; 7,0; 7,5 und 8,0. Die Reaktionsgemische mit pH 6,5 und 7,0 wurden hergestellt unter Verwendung von 100 mM N-2-Hydroxyäthylpiperazin- N′-2-äthansulfonsäurepuffer und die Reaktionsgemische von pH 7,5 und 8,0 wurden mit 100 mM Tris-HCl-Puffer hergestellt, wobei die anderen Bedingungen identisch mit denen von Beispiel 1 waren. 20 µl Natriumpalmitatlösung (100 mM/l) wurden in ein Reagensglas pipettiert und 0,5 ml des obigen Reaktionsgemisches wurden zugefügt. Nach Umsetzung bei 37°C für 0, 10, 15, 20 oder 30 min wurden 2,0 ml des 1 : 1-Gemisches der Farbbildungslösungen A und B zugefügt und das Gemisch bei etwa pH 4,3 der Farbausbildung unterzogen. Danach wurde die Absorption wie in Beispiel 1 gemessen. Die Variation mit der Zeit in jedem Fall ist in Fig. 4 angegeben, worin ○-○ die Reaktionsmischung mit pH 6,5 bedeutet, - pH 7,0, ∆-∆ pH 7,5 und x-x pH 8,0. Wie sich aus dieser Figur ergibt, ist bei Reaktionsgemischen mit pH 6,5 bis 7,5 das Wasserstoffperoxidniveau ziemlich konstant, variiert jedoch mit der Zeit beim Reaktionsgemisch mit pH 8,0.

Beispiel 3

Unter Variieren des pH-Werts der Farbbildungslösung A (saures Reagens) von Beispiel 1 wurde die Farbausbildungsgeschwindigkeit und die Stabilität dieser Lösung A bei 30°C untersucht.

Die Farbbildungslösung A (saures Reagens) wurde hergestellt durch Auflösen von 25 mg MBTH und 0,25 ml DMA in 1/5 M Acetat Puffer und Einstellung des pH auf 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 oder 6,0 mit Salzsäure. Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wurden 20 µl Natriumpalmitatlösung (1%ige Triton X-100 Lösung) in ein Reagensglas pipettiert und 0,5 ml des Reaktionsgemisches der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 zugefügt. Danach wurde das Gemisch 20 min bei 37°C umgesetzt, mit 1,0 ml der Farbbildungslösung A versetzt (saures Reagens) die jeweils verschiedenen pH-Wert hatte, und 5 min später mit der Farbbildungslösung B (gleiche Zusammensetzung wie die von Beispiel 1) und umgesetzt. Unter Anwendung der gleichen Arbeitsweise wie schon beschrieben wurde die Absorptionsmessung durchgeführt.

Unter der Annahme einer Farbbildungsgeschwindigkeit der Farbentwicklungslösung A von pH 3,0 als 100% wurden die Relativwerte der anderen Lösungen mit verschiedenen pH-Werten berechnet, wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 angeführt sind.

Tabelle 1

Wie aus der Tabelle ersichtlich zeigen die Farbbildungslösungen von pH 3 bis 5 ausgezeichnete Farbbildungsgeschwindigkeiten.

Die Variation in der Wirkung der Farbbildungslösung A (pH 2,0; 3,0 und 4,0) mit der Zeit ist in Tabelle 2 gezeigt. In dieser Tabelle wird die Farbbildungsgeschwindigkeit der Lösung vom pH 3,0 als 100% angenommen.

Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von freier Fettsäure in einer Analysenprobe durch (i) Zugabe einer ersten Reaktionsflüssigkeit, enthaltend Adenosintriphosphat, Coenzym A und Acyl-Coenzym A-Synthetase, zur Probe unter Bildung von Acyl-Coenzym A, Adenosinmonophosphat und Pyrophosphorsäure, (ii) Einwirkenlassen einer zweiten Reaktionsflüssigkeit, enthaltend Acyl-Coenzym A-Oxidase, auf das gebildete Acyl-Coenzym A in Gegenwart von Sauerstoff und (iii) Einwirkenlassen eines sauren Reagens und eines farbbildenden Mittels auf das gebildete Wasserstoffperoxid unter Farbentwicklung, die kolorimetrisch bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) als saures Reagens Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure dient,
(b) bei gleichzeitiger Zugabe von saurem Reagens und farbbildendem Mittel zum die zweite Reaktionsflüssigkeit enthaltenden Medium der pH-Wert des Reaktionssystems nach der Zugabe bei 3,5-6 gehalten wird, oder
(c) bei Zugabe von zunächst saurem Reagens zum die zweite Reaktionsflüssigkeit enthaltenden Medium und anschließend farbbildendem Mittel der pH-Wert des Reaktionssystems nach der Zugabe des sauren Reagens bei 3 bis 5 gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das farbbildende Mittel Chromogene bestehend aus (1) 4-Aminoantipyrin und Phenol oder einem Phenolderivat, (2) 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon und Dimethylanilin oder ein Derivat desselben, oder (3) 4-Aminoantipyrin und Dimethylanilin oder Diethylanilin oder ein Derivat desselben, aufweist.