DE2237940A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeure - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeure

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Description

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH 1836
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen photometrischen Bestimmung von Harnsäure, welches vollenzymatisch durchgeführt werden kann, wobei die Ergebnisse im nahen UV-Bereich eines Photometers abgelesen werden.
Es sind bisher grundsätzlich zwei Methoden zur Harnsäurebestimmung bekannt geworden.
Im einen Fall wird Harnsäure durch Phosphor-Wolframsäure oxidiert und das bei der Reaktion entstandene Phosphor-Wolfram-Blau kolorimetrisch gemessen. Bei diesem Verfahren können naturgemäß andere reduzierende Stoffe/ wie z.B. Medikamente oder reduzierende Metaboliten stören.
Im zweiten Fall (Harnsäurebestimmung nach Praetorius) wird Harnsäure mittels Uricase zu Allantoin abgebaut, wobei die Absorptionsabnahme der Harnsäure im Bereich von 293 mp ein Maß für deren Konzentration darstellt. Dieses Verfahren ist, wie die meisten Enzymreaktionen recht spezifisch, jedoch stört die Eigenabsorption des Proteinanteils des Enzyms ebenso, wie andere in der Probe.enthaltenen Eiweißstoffe, so daß falsche Ergebnisse auftreten können.
Um den genannten Nachteilen zu entgehen, ist vorgeschlagen worden, das bei der enzymatischen Umsetzung der Harnsäure mittels Uricase entstehende Wasserstoffperoxid kolorimetrisch zu bestimmen (Bernt und Lorentz; Anal. Biochem. 1969) . Die Bestimmung beruht auf der Oxidation von O-Dianisidin mittels Peroxidase zu einem Farbstoff.
309886/0765
Obwohl hierbei die Extinktion im günstigen sichtbaren -Bereich des Spektrums gemessen werden kann, besitzt das Verfahren Nachteile, die es für die Praxis ungeeignet machen. Zum einen wird die Verwendung von Dianisidin heute wegen der Gefahr cancerogener Wirkung vermieden und zum anderen wird auch dieses Verfahren durch Proteine gestört, so daß sich eine Enteiweißung vor der Bestimmung nicht vermeiden läßt.
Weiterhin ist ein Verfahren bekannt geworden (DOS 2 149 675), in dem Methanol durch das enzymatisch gebildete Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase zu Formaldehyd oxidiert wird, der dann in Gegenwart eines Ammoniumsalzes nach der Hantzsch1sehen Reaktion mit Acetylaceton zu 3, 5-Diacetyl-1,4-dihydrolutidin umgesetzt wird. Die der Harnsäure-Konzentration proportionale Konzentration des gelben Farbstoffs kann bei 410 nyti kolorimetrisch bestimmt werden. Das Verfahren stellt zwar eine Verbesserung vorbekannter Bestimmungsraethoden dar, ist jedoch im Hinblick auf die Einhaltung bestimmter Reaktionsparameter umständlich. So ist z.B. ein auf 37°C thermostasiertes Bad erforderlich, in dem zur Entwicklung des Lutidinfarbstoffs mindestens 30 Minuten, praktisch jedoch über eine Stunde, inkubiert werden muß. Außerdem erfolgt der letzte Schritt nicht enzymatisch und kann deshalb durch reduzierende oder oxidierende Bestandteile der Probe, welche mit dem empfindlichen Formaldehyd reagieren, gestört werden.
Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, einen Harnsäurenachweis zu entwickeln, der vollenzymatisch durchgeführt werdet kann und der in kurzer Zeit, ohne umständliche Inkubation ein von Störsubstanzen unbeeinflußtes quantitatives Ergebnis liefert.
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Das Ziel der Erfindung wird nun dadurch erreicht, daß man das bei der Allantoin-Reaktion in der Harnsäure freiwerdende Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Katalase mit Äthanol umsetzt. Der dabei gebildete Acetaldehyd wird von NADH in Anwesenheit von Alkoholdehydrogenase zu Äthanol rückreduziert, wobei die Abnahme der NADH-Konzentration, die spektrophotometrisch in dem günstigen Bereich von 340 bzw. 366 nyu gemessen werden kann, dem Harnsäuregehalt der Probe proportional ist.
Es handelt sich hier zwar um an sich bekannte Einzelschritte, die jedoch bisher nicht kombiniertvmrden, weil angenommen werden mußte, daß sich die Reaktionen gegenseitig stören. Zur besseren Übersicht wird der Reaktionsweg im folgenden schematisch aufgezeichnet.
A: Harnsäure + 2H0O + 0o Allantoin + EnOn + C0_ B: H0O2 + Äthanol Acetaldehyd + 2H3O C: Acetaldehyd + NADH + H* Alkoholdehydrogenase^ Äthanol + NAD
Es ist bekannt, daß die drei Schritte bei verschiedenen pH-Optima ablaufen: A: pH 9,3; B: pH 7,0; C: pH 6,5. Besonders kritisch ist das relativ alkalische pH-Optimum der Uricasereaktion (A) im Hinblick auf die bekanntermaßen stark pH-abhängige Gleichgewichtseinstellung der Reaktion C.
Es ist ferner bekannt, daß die Reaktion C durch in der Probe vorhandenes Äthanol gestört wird. Weiterhin weiß man, daß Katalase kein ausschließlich peroxidatisch wirkendes Enzym ist, sondern, vor allem bei gefingen Alkoholkonzentrationen, aus Wasserstoffperoxid vorwiegend direkt Sauerstoff freimacht, der als solcher nicht in der Lage ist, mit Äthanol zu reagieren.
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Da nun einerseits die Reaktion B für einen quantitativen Umsatz des Wasserstoffperoxids eine hohe Alkoholkonzentration erfordert, wohingegen gerade Äthanol auf den Ablauf der Reaktion C inhibierend wirkt (vgl. Methoden der enzymatischen Analyse von H.U. Bergmeyer, 1962, Seite 292), ist es als überraschend anzusehen, daß kritische Bedingungen gefunden werden konnten, die es ermöglichen, die Verfahrensschritte B und C zu kombinieren, ohne den quantitativen Ablauf der Gesamtreaktion wesentlich zu beeinflussen. Durch zusätzliche Kombination der Schritte B und C mit dem Verfahrensschritt A werden die Verhältnisse naturgemäß noch unübersichtlicher.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man den entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase mit NADH zu Äthanol rückreduziert und die Abnahme der NADH-Konzentration durch spektrophotometrxsche Bestimmung mißt, wobei das Verfahren bei einem pH von 6,8 - 7,1, vorzugsweise 7,0, durchgeführt wird und dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration die Grenzen von 0,3 - 0,7 Vo1.% nicht überschreitet.
Bei Einhaltung der obengenannten Bedingungen lassen sich überraschenderweise die Verfahren A, B und C kombinieren · man erhält ausgezeichnet korrelierende Ergebnisse und die Reaktion wird weder durch Eiweiß noch durch Fremdstoffe nennenswert gestört. Da entstandener Acetaldehyd auch bei Raumtemperatur sofort von NADH reduziert und so aus dem Gleichgewicht entfernt wird, ist die Reaktion auch gegen reduzierende Störsubstanzen relativ unempfindlich.
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Die optimale Alkoholkonzentration liegt bei 0,5 VoI.%.
Als Puffer hat sich besonders ein Phosphat-Puffer, bestehend aus 3,522 g Kaliumdihydrogenphosphat und 7,268 g Dinatriumhydrogenphosphat,gelöst in 1000 ml Wasser bewährt. Er puffert bei pH 7,0.
Obwohl der Verfahrensschritt C im Falle üblicher Acetaldehydbestimmungen normalerweise nur nach Enteiweißung der Probe durchgeführt wird, hat es sich unerwartet gezeigt, daß sich beim erf indungsgemäßen Verfahren ein Enteiweißungsschritt erübrigt . (vgl. auch Fig. II). .
Die Extinktion von NADH wird im nahen UV bei 340 bzw. 366 mp gemessen. . *
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wobei eine Thermostatisierung entfallen kann. Das Analysenergebnis liegt bereits nach ca. 20 Minuten vor.
Gegenüber der einfachen Harnsäure-Bestimmung nach Praetorius muß das erhaltene Ergebnis zwar mit einem zusätzlichen" Korrektur faktor versehen werden. Da es sich aber um. eine sich konstant ergebende mittlere Differenz handelt, wird die Genauigkeit kaum beeinträchtigt. .
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfordert nur sehr kleine Probemengen (0,1 ml Serum), so daß auch . Bestimmungen im Kapillarplasma möglich sind.
in Figur I ist eine Eichkurve dargestellt, die mit einer wässrigen Harnsäurelösung erstellt wurde.
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In Figur II ist eine Eichkurve dargestellt, die mittels eines Standardserums mit einem Sollgehalt von 5,9 mg% Harnsäure ermittelt wurde.
Aus den Figuren I und II ist die Linearität der Beziehung Extinktion-Harnsäurekonzentration ersichtlich.
In den Tabellen 1 und 2 sind die aus menschlichem Serum erhaltenen Harnsäurewerte nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit den durch Absorptionsmessung nach Praetorius erhaltenen Werten verglichen.
Im folgenden Beispiel soll die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert werden.
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Beispiel
ä. Reagenzien und Reagenzlösungen '
1. Phosphat-Puffer: 3,522 g Kaliumdihydrogenphosphat und 7,268 g Dinatrium-hydrogenphosphat-dihydrat werden in 1000 ml bidestilliertem Wasser gelöst.
2. NADH-Lösung: 25 mg NADH werden in 10 ml einer einprozentigen Natriurribicarbonatlösung. gelöst. Die Lösung ·.' ist ca. 10 Tage haltbar.
3. Äthanol (absolut)
4. Alkohol-Dehydrogenase_jBoehringer2Mannheim)_
Kristallsuspension in 3,2 M Ammoniumsulfatlösung, • pH ca. 6,Sp.Aktivität 200U/mg (25°C) .
5. Katalase (Boehringer Mannheim) . .
' Lösung in 30 % Glycerin/10 % Äthanol« Sp .Aktivität 260 000U /ml (25°C) '
6. üricase (Boehringer-Mannheim) " - -
Lösung in 50 % Glycerin pH 10,2 50 mM Glycin* 0,13 M Natriumcarbonat. Sp.Aktivität 4,5 U/mg (25°C)
7. Harnsäure-Standardlösung (5 mg/100 ml) 5 rag Harnsäure werden mit 0,1 η-Natronlauge gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.
8· 5§£5§§B-E§z§£§il§i£öserum (5,9 mg/100 ml) Es wurde ein Standardserum der Firma Nyegaard (Seronor: eingesetzt. \
b. Durchführung der Harnsäure-Bestimmung .
In eine lcm-Küvette werden nacheinander 2,0 ml Phosphatpuffer (1), 0,15 ml NADH-Lösunjg (2), 0,01 ml Äthanol, . 0, Ol ml Alkohol-dehydrogenase, 0,005 ml Katalase und schließlich 0,1 ml der Probe pipettiert.
309886/07G5
22379AOl
Es wird nach jedem Pipettieren kurz gemischt und der erste Extinktionswert (E^) bei 366 ταμ 10 Minuten nach Zugabe der Probe abgelesen. Unmittelbar nach dem Ablesen von E^ werden 10 μΐ Uricase einpipettiert. Nach weiteren 10 Minuten wird der zweite Extinktionswert (E ) bei derselben Wellenlänge abgelesen. Der Leerwert (L) wird gegen Wasser bestimmt.
Der Harnsäuregehalt wird wie folgt berechnet:
(E1 -E2I-L=^E
Δε χ 131 = mg% Harnsäure
Der Faktor 131 wurde empirisch bestimmt (vgl. Tabelle 2).
Verqleichsversuche
1. Es wurden je 10 Proben desselben Serums parallel nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren nach Praetorius bestimmt.
Tabelle 1
Harnsäurebestimmung von 10 Proben
A: nach Praetorius
(1 cm Küvette, 293 mju)
B: nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (1 cm Küvette, 366 nyu)
1 3 2 2 3 4 4 5 2 6 3 7 3 8 3 9 2 10 PROBE
A 5, 5, 5, 5,5 5, 5, 5, 5, 5, 5,2 mg %
1 O 2 2 3 ,1 4 5 ,3 6 1 7 ,0 8 2 9 ,2 10 PROBE
B 5? 5, 5 5 5, 5 5, 5 •β,ο mg %
309886/0765
Aus der Tabelle 1 läßt sich für das erfindungsgemäße Verfahren statistisch ein Variationskoeffizient von 2,0 % berechnen, während sich aus dem Verfahren nach Praetorius ein Koeffizient von 1,86 % ergibt,
32 verschiedene menschliche Seren mit unterschiedlichem Harnsäuregehalt wurden parallel nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren nach Praetorius bestimmt. In der Tabelle 2 sind die Ergebnisse wiedergegeben, aus denen sich eine prozentuale Fehlerbreite der zu beobachtenden Abweichungen von 12,6 - 14,06 % ergab. Daraus errechnete sich der Faktor 131 (mittlerer Fehler 13 %).
Die Berechnung der linearen Regression ergab danach einen Koeffizienten von 1 = 0,99.
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22379A0
Tabelle Harnsäurebestimmunq im menschlichen Serum
Erqebnisse der Be Ergebnisse: der Ergebnisse der Be
stimmung nach grafischen Aus rechnung mit dem
PRAETORIUS wertung nach dem Faktor 131 nach
(mg %) erfindungsgemäßen dem erfindungsge
Verfahren mäßen Verfahren
* · (mg %) (mg %)
3,0 3i4 3,3
4,3 4,1 3,9
5,8 5,5 .5,2
5,3 5,5 5,2
■ 6,2 6,2 5,9
■6,6 6,5 6,2
• 7rl 7,0 6,7
6,2 6,2 5,9
4,3 4,5 4,3
7,9 8,0 7,6
5,3 5,5 5,2
4,6 5,0 4,9
7,9 8,1 7,7
9,3 9,5 9,1
5,7 5,5 5,2
7,5 7,3 7,0
9,5 9,6 9,2
7,0 6,9 6,6
11,0 10,4 10,0
6,2 6,5 6,2
5,7 5,8 5,5
6,2 6,2 5,9
6,6 7,0 6,7
7,5 8,0 7,5
4,7 4,7 4,5
6,6 6,8 6,4
3,4 •3,7 3,5
3,8 3,8 3,7
6,8 6,2 6,0
2,9 3,3 3,1
4,1 4,4 4,2
4,3 • 4,5 4,3
309886/0765

Claims (4)

-.11 - Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man den entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase mit NADH zu Äthanol rückreduziert und.die Abnahme der NADH-Konzentration durch spektrophotometrische Bestimmung mißt, wobei das Verfahren bei einem pH von 6,8 - 7,1 durchgeführt wird und dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration, die Grenzen von 0,3 - 0,7 VoI.% nicht überschreitet.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einem pH von 7,0' durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß. die Äthanol-Konzentration 0,5 VoI.% beträgt.
4. Verfahren gemäß Ansprucli Ϊ, dadurch gekennzeichnet, daß
es ohne Thermostatisierung bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
30988S/076S
eerseite
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