CN114113062B - 一种无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程领域，公开了一种无酶、比色‑光热双模式体外检测尿酸纳米金材料及其制备方法和应用。本发明利用金硫键将4‑氨基‑6‑羟基‑2‑巯基嘧啶一水合物AHMP修饰到Au纳米粒子上，尿酸酰胺基之间的氢键相互作用与AHMP修饰的功能化金纳米粒子由于可能的共价键和疏水相互作用基本上可以减小粒子间距离，诱导溶液颜色发生变化，且由于AHMP具有更多的氨基，能够更好的识别尿酸分子。由于Au@AHMP与不同浓度UA反应后的不同聚集形态受660nm激光的照射会产生差异化的光热现象。基于以上两个特点，利用比色和光热双模式检测UA浓度，进一步增加检测的可靠性和检测下限，有望在尿酸检测领域获得广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料及其制备方法和应用。
背景技术
尿酸(UA)是一种人体内嘌呤核苷酸代谢的最终产物，血液中UA的含量长期处于高水平会引起痛风、关节炎等多种疾病。过高的尿酸会随着血液进入关节组织中，造成尿酸盐沉淀，引起关节病态，很多高尿酸患者，活动能力下降，骨骼纤维化而易发生骨折，高浓度尿酸还会导致患者肾功能减弱，直至坏死，表现为肾炎、肾衰竭。但是目前为止市面上针对高尿酸的药物还无法长期稳定降低尿酸，相关的药物大多价格昂贵且有副作用。总之，如果能够开发新型便携快速的尿酸检测方法将能够提前预防疾病的发生从而大大降低患者的痛苦。
1971年，Faulk和Taylor首次采用免疫金染色(immunogold staining，IGS)将兔抗沙门氏菌抗血清与纳米金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原，开创了纳米金免疫标记技术。之后，大量研究表明金纳米粒子能够稳定而迅速地吸附蛋白质，并且不会对其生物活性造成明显改变。它可以作为探针对细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位，也可以用于常规的免疫诊断，进行免疫组织化学定位，因而在临床诊断及药物检测等方面得到了广泛的应用。另外，金纳米粒子由于其独特的光学特性而被广泛用作金属离子、生物分子等物质的生物传感器。
目前临床阶段针对尿酸的检测方法是通过尿酸酶和过氧化物酶来实现的。许多新型的尿酸检测方法或多或少都有酶的参与(CN109632747A、CN110108656A)。然而由于天然酶自身对于温度和PH非常敏感，它的使用范围被大大限制了。另外色谱分析法、电化学法等检测方法具有灵敏度高、快速、安全的优势，目前国内使用的基本为此方法，但反应时间长且需使用成本高、不便携的大型仪器(CN110243894A、CN113008966B、CN112198203A、CN109270052A、CN107286928B)，这无疑增加了患者的医疗负担。所以开发可靠、廉价且便携的非酶方法来检测UA是非常有必要的。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料；该材料是利用金硫键将4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物(AHMP)修饰到Au纳米粒子上。
本发明的另一目的在于提供一种上述无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料的制备方法，包括以下步骤：将四氯金酸(HAuCl4)添加到去离子水中，然后在室温条件下加入4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物(AHMP)，搅拌后持续滴加冰冷、新制的硼氢化钠(NaBH4)溶液，得到酒红色产物，即为无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料。
优选地，所述室温为20℃；所述搅拌是转速4000rpm磁力搅拌5分钟。
优选地，所述四氯金酸、4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物、硼氢化钠摩尔比为63.4：1：9.9。
优选地，所述四氯金酸(HAuCl4)添加到去离子水中得到浓度1mol/L的溶液。
优选地，所述硼氢化钠溶液的浓度是以每100毫升加入12.5毫克干燥的硼氢化钠计。
优选地，所述硼氢化钠溶液的滴加速度为200μL/min，滴加时间为10min内。
一种由上述的制备方法制备得到的无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料。
上述的无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料在制备检测尿酸产品中的应用。
所述检测尿酸的方法按照以下步骤：
(1)用PBS配置不同浓度的标准尿酸溶液；所述标准尿酸溶液浓度为0mM、0.003mM、0.007mM、0.015mM、0.03mM、0.06mM、0.12mM、0.25mM、0.5mM、1mM；
(2)将体外检测尿酸纳米金材料分别与标准尿酸溶液混合，反应10分钟后观察颜色变化和测定660nm可见光吸光度，以尿酸浓度为横坐标X，以吸光度为纵坐标Y1，得出吸光度随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式Y1＝0.34575+(-0.1736)*exp(-X/0.10064)，R2＝0.97103；
或者将体外检测尿酸纳米金材料分别与标准尿酸溶液混合反应10分钟后照射660nm激光5分钟，测定和计算溶液在激光照射前后的温度差，以尿酸浓度为横坐标X，以温度差为纵坐标Y2，得出温度差随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式Y2＝7.15947X+45.13908，R2＝0.97313；
所述体外检测尿酸纳米金材料和标准尿酸溶液的体积比为5：1；
(3)将体外检测尿酸纳米金材料与待测尿酸溶液混合，反应10分钟后观察颜色变化和测定660nm可见光吸光度，将吸光度代入步骤(2)所述吸光度随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式，计算得出待测尿酸溶液的浓度；
或者将体外检测尿酸纳米金材料与待测尿酸溶液混合反应10分钟后照射660nm激光5分钟，测定和计算溶液在激光照射前后的温度差，将温度差代入步骤(2)所述温度差随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式，计算得出待测尿酸溶液的浓度；
所述体外检测尿酸纳米金材料和待测尿酸溶液的体积比为5：1；
所述方法不包含疾病治疗与诊断目的。
所述660nm激光的功率为1W。
本发明的原理是：
本发明基于纳米金的综合测定，用于在不使用任何酶和其他特殊试剂的情况下对不同浓度的UA进行比色检测和光热检测。我们利用金硫键将4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物(AHMP)修饰到Au纳米粒子上，UA酰胺基之间的H键相互作用，AHMP修饰的功能化金纳米粒子由于共价键和疏水相互作用进而减小粒子间距离，诱导溶液颜色发生变化，且由于AHMP具有更多的氨基，能够更好的识别尿酸分子。另外，由于Au@AHMP与不同浓度UA反应后的不同聚集形态受660nm激光的照射会产生差异化的光热现象。基于以上两个特点，发明人利用比色-光热双模式检测UA浓度，进一步增加检测的可靠性和检测下限。比色-光热双模式检测法是根据在波长660nm处，反应体系吸光度的高低与样本中尿酸的浓度成正比、反应体系颜色深度与样本中尿酸的浓度成正比、反应体系温度差的大小与样本中尿酸的浓度成正比，得到尿酸的浓度。
本发明和现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明不需要任何天然酶和特殊试剂即可实现高特异性尿酸检测，成本低廉；
(2)本发明具有传统尿酸检测所不具备的高稳定性，能够适应不同的温度和PH环境；
(3)本发明采用比色测定和光热反应双模式验证提高检测的准确性，只需简易的温度计或比色装置即可裸眼量化尿酸水平；
(4)本发明反应时间快，10～15分钟即可完成样品中尿酸的检测，且实验易操作；
(5)本发明纳米材料的合成路线简便，可重复性高，原材料成本低，既可以在实验室合成也适合大批量生产。
附图说明
图1为Au@AHMP与不同浓度尿酸溶液混合10分钟或混合10分钟再照射660nm激光5分钟后溶液颜色变化图。
图2为实施例2中Au@AHMP与不同浓度尿酸溶液混合10分钟后可见光(650nm)吸光度标准曲线。
图3为实施例3中Au@AHMP与不同浓度尿酸溶液混合10分钟之后照射660nm激光5分钟后温度差标准曲线图。
图4为实施例4制备得到的Au@AHMP与不同干扰物质+尿酸溶液混合后的可见光吸光度变化图；
图5为实施例5制备得到的Au@AHMP在不同温度和PH环境下与尿酸溶液混合后的颜色变化图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料的制备：
量取四氯金酸添加到去离子水中，然后在室温20℃条件下加入4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物(AHMP)，磁力搅拌(2000rpm)5分钟后持续滴加冰冷、新制的硼氢化钠溶液，最终产物颜色变为酒红色，即为无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料(Au@AHMP)；
所述四氯金酸(HAuCl4)添加到去离子水中得到浓度1mol/L的溶液；
所述硼氢化钠溶液以每100毫升加入12.5毫克干燥的硼氢化钠计；
所述四氯金酸、4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物、硼氢化钠摩尔比为63.4：1：9.9；
所述硼氢化钠溶液使用冰冷的去离子水配置并保存在冰水浴环境中；
所述硼氢化钠溶液滴加速率为200μL/min。
实施例2
(1)用PBS配置不同浓度的标准尿酸溶液；所述标准尿酸溶液浓度为0mM、0.003mM、0.007mM、0.015mM、0.03mM、0.06mM、0.12mM、0.25mM、0.5mM、1mM；
(2)将实施例1所得无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料(Au@AHMP)分别与标准尿酸溶液混合，反应10分钟后观察颜色变化(如图1)和测定660nm可见光吸光度，以尿酸浓度为横坐标X，以吸光度为纵坐标Y1，得出吸光度随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式Y1＝0.34575+(-0.1736)*exp(-X/0.10064)，R2＝0.97103；标准曲线如图2所示；所述尿酸浓度的单位为mM/L；所述体外检测尿酸纳米金材料和标准尿酸溶液的体积比为5：1；所述660nm激光功率为1W。
实施例3
(1)用PBS配置不同浓度的标准尿酸溶液；所述标准尿酸溶液浓度为0mM、0.003mM、0.007mM、0.015mM、0.03mM、0.06mM、0.12mM、0.25mM、0.5mM、1mM；
(2)将实施例1所得无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料(Au@AHMP)分别与标准尿酸溶液混合反应10分钟后照射660nm激光5分钟，观察颜色变化(如图1)，测定和计算溶液在激光照射前后的温度差，以尿酸浓度为横坐标X，以温度差为纵坐标Y2，得出温度差随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式Y2＝7.15947X+45.13908，R2＝0.97313；标准曲线如图3所示；所述尿酸浓度的单位为mM/L；所述体外检测尿酸纳米金材料和标准尿酸溶液的体积比为5：1；所述660nm激光功率为1W。
实施例4
将实施例1所得Au@AHMP分别与PBS配置的含不同干扰物质的尿酸溶液混合，所述Au@AHMP和尿酸溶液的体积比为5：1，尿酸溶液中尿酸的浓度为1mM/L，尿酸溶液中干扰物质的浓度均为0.25mmol/L；混合反应10分钟后，观察颜色变化和测定660nm可见光吸光度，如图4所示，Au@AHMP具有良好的抗干扰性；
所述干扰物质分别为葡萄糖(Glu)、抗坏血酸(AA)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)、丙氨酸(L-DOPA)、4-乙酰氨基酚(AP)、多巴胺(DA)。
实施例5
将实施例1所得Au@AHMP与PBS配置的不同温度或不同pH尿酸溶液混合，所述Au@AHMP和尿酸溶液的体积比为5：1，尿酸溶液中尿酸的浓度为1mM/L；混合反应30分钟后，观察颜色变化，如图5所示，颜色并无改变，所以表明材料能够稳定地识别尿酸，Au@AHMP具备良好的稳定性，能够适用不同的温度或pH环境；所述不同温度尿酸溶液分别为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃；所述不同pH尿酸溶液分别为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，使用HCl溶液和NaOH溶液调节。
实施例6
将实施例1所得无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料(Au@AHMP)与待测尿酸溶液混合，所述体外检测尿酸纳米金材料和待测尿酸溶液的体积比为5：1，反应10分钟后观察颜色变化和测定660nm可见光吸光度0.244，将吸光度代入实施例2所述吸光度随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式，计算得出待测尿酸溶液的浓度为0.04mM/L。
实施例7
将实施例1所得无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料(Au@AHMP)与待测尿酸溶液按照体积比5：1混合反应10分钟后照射660nm激光(功率为1W)5分钟，测定和计算溶液在激光照射前后的温度差48.3℃，将温度差代入步骤(2)所述温度差随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式，计算得出待测尿酸溶液的浓度为0.04mM/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，特征在于：采用比色测定和光热反应双模式验证提高检测的准确性；所述检测尿酸的方法按照以下步骤：
（1）用PBS配置不同浓度的标准尿酸溶液；所述标准尿酸溶液浓度为0mM、0.003mM、0.007mM、0.015mM、0.03mM、0.06mM、0.12mM、0.25mM、0.5mM、1mM；
（2）将体外检测尿酸纳米金材料分别与标准尿酸溶液混合，反应10分钟后观察颜色变化和测定660nm可见光吸光度，以尿酸浓度为横坐标X，以吸光度为纵坐标Y1，得出吸光度随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式Y1 = 0.34575+(-0.1736)*exp(-X/0.10064)，R2=0.97103；
并将体外检测尿酸纳米金材料分别与标准尿酸溶液混合反应10分钟后照射660nm激光5分钟，测定和计算溶液在激光照射前后的温度差，以尿酸浓度为横坐标X，以温度差为纵坐标Y2，得出温度差随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式Y2=7.15947X +45.13908，R2=0.97313；
所述尿酸浓度的单位为mM/L ；所述体外检测尿酸纳米金材料和标准尿酸溶液的体积比为5：1；
（3）将体外检测尿酸纳米金材料与待测尿酸溶液混合，反应10分钟后观察颜色变化和测定660nm可见光吸光度，将吸光度代入步骤（2）所述吸光度随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式，计算得出待测尿酸溶液的浓度；
并将体外检测尿酸纳米金材料与待测尿酸溶液混合反应10分钟后照射660nm激光5分钟，测定和计算溶液在激光照射前后的温度差，将温度差代入步骤（2）所述温度差随尿酸浓度变化的标准曲线回归方程公式，计算得出待测尿酸溶液的浓度；
所述体外检测尿酸纳米金材料和待测尿酸溶液的体积比为5：1；
所述方法不包含疾病治疗与诊断目的；
所述无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料按照以下步骤制备得到：将四氯金酸添加到去离子水中，然后在室温条件下加入4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物，搅拌后持续滴加冰冷、新制的硼氢化钠溶液，得到酒红色产物，即为无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料。
2.根据权利要求1所述的一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，其特征在于：所述660nm激光的功率为1W。
3.根据权利要求1所述的一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，其特征在于：所述室温为20℃；所述搅拌是转速4000rpm磁力搅拌5分钟。
4.根据权利要求1所述的一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，其特征在于：所述四氯金酸、4-氨基-6-羟基-2-巯基嘧啶一水合物、硼氢化钠摩尔比为63.4：1：9.9。
5.根据权利要求1所述的一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，其特征在于：所述四氯金酸添加到去离子水中得到浓度1mol/L的溶液。
6.根据权利要求1所述的一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，其特征在于：所述硼氢化钠溶液的浓度是以每100毫升加入12.5毫克干燥的硼氢化钠计。
7.根据权利要求1所述的一种利用无酶、比色-光热双模式体外检测尿酸纳米金材料检测尿酸的方法，其特征在于：所述硼氢化钠溶液的滴加速度为200μL/min，滴加时间为10min内。
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