CN108802139A - 一种检测谷胱甘肽的电致化学发光方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测谷胱甘肽的电致化学发光方法。本发明所述二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法是采用还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰纳米材料作为电致化学发光猝灭剂，利用谷胱甘肽与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，实现对谷胱甘肽含量的测定。在1.0×10‑11~1.0×10‑1 mol/L的浓度范围内谷胱甘肽浓度的对数值与相对电致化学发光强度变化值呈线性关系，检测限为2.9×10‑12 mol/L。并且，本发明操作简单、灵敏度高、重现性和选择性好，可用于实际样品中谷胱甘肽的检测，因而具有较好的应用前景。

Description

一种检测谷胱甘肽的电致化学发光方法
技术领域
本发明涉及一种二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
谷胱甘肽（glutataione，GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的生物活性三肽化合物，存在于身体每一个细胞的含有γ-酰胺键和巯基的低分子量非蛋白质生物分子。GSH是人体内一种非常重要的水溶性抗氧化剂，能将身体内的毒素通过生物转化变成无害的物质并排出体外，具有许多极其重要的生理功能以及医用保健价值，已被广泛应用于肝肾保护、解毒、抗癌等医学领域。正常的GSH是体内自由基的清除剂，也是一种解毒物质，能参与免疫调控、人体新陈代谢、能量运输等生理过程，用途广泛。通常，GSH的异常表达是一些疾病的征兆，比如癌症、免疫缺陷疾病（HIV）、神经退行性疾病、肝损伤以及心脏病等疾病，故GSH浓度可作为疾病临床诊断的依据。因此，在生物、临床检测等分析中，GSH含量的测定具有重要的意义。
GSH的检测方法目前主要有电化学法、荧光光谱法、酶联免疫法、表面增强拉曼光谱法、高效液相法（HPLC）和比色法等。然而荧光方法需要使用特殊的合成材料和外部光源，比色法敏度低，HPLC法和CV法操作时间长、样品制备过程繁杂。因此，需要研究开发一种简单、灵敏的GSH测定方法。电致化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）是近几年发展迅速的一种新型检测方法，该方法集成了化学发光灵敏度高与电化学分析技术可控性好的优点，又具有选择性好、重现性好、检测限低、动力学响应范围宽，还可进行原位检测等新优势，在医学、环境科学、生命科学和化学等领域引起了研究者极大的兴趣。
近年来，纳米技术己广泛用于化学、生物、医学、材料、电子等学科领域，形成了一个集前沿基础学科和高科技为一体的完整体系。新型纳米材料的开发与应用是纳米技术的重要研究内容。金纳米团簇作为新型纳米发光体，具有独特的光学、电学和化学性质，比如较低的毒性、灵敏度高、生物相容性好以及超小的尺寸和良好的稳定性等优点，己在生物医药、临床分析、传感检测和催化等领域广泛应用。
本发明以金纳米团簇为电致化学发光探针，以二氧化锰纳米片为猝灭剂，基于谷胱甘肽和二氧化锰之间的氧化还原反应建立了一种高灵敏、高选择、快速的谷胱甘肽测定新方法。具有较好的普适性，应用潜力巨大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以金纳米团簇为电致化学发光探针的谷胱甘肽测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光猝灭剂，进而将修饰电极浸入含有谷胱甘肽的样品中，谷胱甘肽与二氧化锰发生氧化还原反应，采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现谷胱甘肽的测定。
所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4 V~-2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min~1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30 min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述金纳米团簇为功能化修饰金纳米团簇，采用N-乙酰化-L-半胱氨酸-金纳米团簇或谷胱甘肽-金纳米团簇。
所述在电极表面修饰二氧化锰纳米材料的方法为电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-T法，在1:1 V/V 的KMnO4-H2SO4溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1 V~-0.5 V，时间为100 s~600 s，清洗，氮气吹干。
所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0 V，脉冲时间为10s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s，光电倍增管高压设置为600~800 V，检测电致化学发光辐射信号。
所述含有谷胱甘肽的样品的pH值为6.0；谷胱甘肽与二氧化锰发生氧化还原反应的时间为8 min。
上述采集修饰电极的电致化学发光信号的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4，过硫酸根离子浓度为0.1 mol/L。
上述电致化学发光强度变化值与谷胱甘肽浓度的对数值在1.0×10-11~1.0×10-1mol/L的范围内呈线性关系，检测限为2.9×10-12 mol/L，能用于血清样品中谷胱甘肽的检测。
具体地说，本发明是将金纳米团簇修饰在玻碳电极上，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，进而在电极表面电沉积二氧化锰纳米材料，并进一步将修饰电极浸入含有谷胱甘肽的样品溶液中，采集修饰电极的电致化学发光信号，利用谷胱甘肽与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现谷胱甘肽的测定。
上述金纳米团簇探针由以下方法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加不同负电位电压，进行恒电位还原处理，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇溶液与一定浓度的硼氢化钠溶液反应一定时间，离心清洗，得到金纳米团簇探针。或将金纳米团簇修饰玻碳电极泡在一定浓度的硼氢化钠溶液反应一定时间，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述的金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，如：N-乙酰化-L-半胱氨酸-金纳米团簇，牛血清白蛋白-金纳米团簇等。
所述的在电极表面电沉积二氧化锰纳米材料的方法为：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在KMnO4-H2SO4（1:1 V/V）溶液中，恒电位沉积制得二氧化锰纳米材料修饰电极。
所述的电致化学发光信号由以下方法采集：采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600 V ~ 800 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
本发明所述的一种基于金纳米团簇为电致化学发光探针的谷胱甘肽测定方法，包括如下步骤：1）将玻碳电极用Al2O3粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO3溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗，N2吹干；2）将金纳米团簇探针溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇探针修饰玻碳电极，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步制得二氧化锰纳米材料/金纳米团簇修饰电极；3）采用三电极体系进行测试，以二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有谷胱甘肽和共反应剂的缓冲溶液中，检测其电致化学发光信号值。采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600 V ~ 800 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号；4）以电致化学发光信号变化值对谷胱甘肽浓度的对数值作图得到标准曲线，在谷胱甘肽浓度为1.0×10-11~1.0×10-1 mol/L的范围内谷胱甘肽浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为2.9×10-12 mol/L。
上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1 mol/L，优选0.1 mol/L。
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为KCl或KNO3，浓度为0.01~1 mol/L。
本发明采用的具体技术方案如下：
（一）N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的制备
N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇合成步骤如下：将浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠与浓度为0.01~0.1 g/L氯金酸溶液加入到浓度为0.02~0.18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀后置于20~70 ℃恒温水浴恒温反应0~3.5小时。待反应结束后透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后可得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇材料粉末。
（二）金纳米团簇修饰电极的制备
将玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al2O3粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO3溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗3分钟，N2吹干。取5 μL金纳米团簇水溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇修饰玻碳电极。
（三）金纳米团簇探针制备
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加负电位电压（-1.4 V~-2 V范围内），进行恒电位还原处理5 min~1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针。
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5~30 min（优选0.1 mol/L硼氢化钠溶液反应5 min），得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
（四）二氧化锰纳米材料修饰方法
采用电化学沉积法修饰二氧化锰纳米材料，具体步骤如下：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在KMnO4-H2SO4（1:1 V/V）溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1 V~-0.5 V，沉积时间为100 s~600 s，优选300 s，之后用双蒸水冲洗干净，氮气吹干备用。
（五）电致化学发光信号采集方法
将电极抛光，再依次放入HNO3溶液、无水乙醇和去离子水中超声清洗，N2吹干。采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为600 V ~ 800 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
所述电极为玻碳电极、丝网印刷电极或ITO电极等。上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1 mol/L，优选0.1 mol/L。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为KCl或KNO3，浓度为0.01~1 mol/L，优选0. 1 mol/L。
（六）谷胱甘肽的测定
将上述二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入谷胱甘肽溶液中反应4~10 min，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。采集工作电极表面产生的电致化学发光信号，以电致化学发光信号对谷胱甘肽浓度作图绘制标准曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以高量子产率金纳米团簇探针为电致化学发光材料，以纳米二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，利用谷胱甘肽恢复其电致化学发光信号实现谷胱甘肽的检测。本发明对谷胱甘肽的检测灵敏度高、操作简单、特异性好、准确度高。并且，本发明成本低、制作简单、稳定性好、线性范围宽（1.0×10-11~1.0×10-1 mol/L），检测限低（2.9×10-12 mol/L），具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1为金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图2为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图3为加入谷胱甘肽后二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图4为传感器连续扫描10段的电致化学发光-时间曲线图。
图5为电致化学发光强度变化与反应时间之间的关系图。
图6为电致化学发光强度变化与谷胱甘肽浓度对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
实施例1
往4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠与0.4 mL浓度为20 mg/mL氯金酸溶液，混匀后置于37 ℃恒温水槽中孵育3 h。反应结束后的反应液用截留分子为3500的透析袋进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇粉末。
实施例2
将直径3mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N2吹干。取5 μL实施例1制备的 N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，得N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇修饰玻碳电极。将N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5 min，得到金纳米团簇探针修饰电极。将上述金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。
实施例3
将直径3 mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al2O3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N2吹干。取5 μL实施例1制备的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用计时电流法，在KMnO4-H2SO4（1:1 V/V）溶液中，电沉积二氧化锰，电位为-0.2 V，沉积时间为300 s，所得到的电极为二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极，之后用双蒸水冲洗干净，N2气轻轻吹干备用。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图2）。
实施例4
将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有0.1 mol/L 谷胱甘肽反应8 min后，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干，再将上述吹干的电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1mol/L、pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到的电化学发光信号比未加谷胱甘肽的溶液明显增大（见图3）。
实施例5
将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有0.1 mol/L 谷胱甘肽反应8 min后，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干，再将上述吹干的电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1mol/L、pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，连续扫描27段，该传感器的ECL信号基本保持不变，相对标准偏差（RSD）为0.5%（见图4）。
实施例6
将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有0.1 mol/L 谷胱甘肽和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH6.0 的磷酸盐缓冲溶液中反应8 min后，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干，再将上述吹干的电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750 V，分别在反应0 min，1 min，2 min，3 min，4 min，6 min，8min和10 min后检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到最佳反应时间为8 min（见图5）。
实施例7
将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有不同浓度谷胱甘肽的pH 6.0 的磷酸盐缓冲溶液中反应8min后，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干，再将上述吹干的电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，在缓冲溶液中加入不同浓度谷胱甘肽存在的条件下分别检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。在谷胱甘肽浓度为1.0×10-11~1.0×10-1 mol/L的范围内谷胱甘肽浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为2.9×10-12 mol/L（见图6）。
实施例8
取新鲜的血清样品，在4 ℃下，10000 rpm转速离心分离10 min，取所得上清液2 µL，用pH 6.0 的磷酸盐缓冲溶液至20 mL。将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入稀释后的血清样品溶液中反应8min后，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干，再将上述吹干的电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。测得血清中谷胱甘肽加标回收率在92.3~107.8 %之间，相对标准偏差在5.7~9.9 %之间，见表1。
表1为血清中谷胱甘肽的加标回收实验结果。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光猝灭剂，进而将修饰电极浸入含有谷胱甘肽的样品中，谷胱甘肽与二氧化锰发生氧化还原反应，采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现谷胱甘肽的测定。
2.根据权利要求1所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4 V~-2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min~1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30 min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
3.根据权利要求1、2所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是所述金纳米团簇为功能化修饰金纳米团簇，采用N-乙酰化-L-半胱氨酸-金纳米团簇或谷胱甘肽-金纳米团簇。
4.根据权利要求1所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是所述在电极表面修饰二氧化锰纳米材料的方法为电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-T法，在1:1 V/V 的KMnO4-H2SO4溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1 V~-0.5 V，时间为100 s~600 s，清洗，氮气吹干。
5.根据权利要求1所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s，光电倍增管高压设置为600~800 V，检测电致化学发光辐射信号。
6.根据权利要求1所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是所述含有谷胱甘肽的样品的pH值为6.0；谷胱甘肽与二氧化锰发生氧化还原反应的时间为8 min。
7.根据权利要求5所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是采集修饰电极的电致化学发光信号的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4，过硫酸根离子浓度为0.1 mol/L。
8.根据权利要求1所述的一种基于二氧化锰/金纳米团簇修饰电极的谷胱甘肽电致化学发光检测方法，其特征是电致化学发光强度变化值与谷胱甘肽浓度的对数值在1.0×10-11~1.0×10-1 mol/L的范围内呈线性关系，检测限为2.9×10-12 mol/L，能用于血清样品中谷胱甘肽的检测。
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