CN110441295A - 一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域；本发明利用pH引导的蛋白解聚/重组法，在去铁铁蛋白Ft内部封装大量三(2‑苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3分子得到Ft‑Ir(ppy)3作为电致化学发光ECL能量供体，以玻碳电极表面修饰纳米金作为ECL能量受体，首次基于Ir(ppy)3优异的ECL性能及其与纳米金的ECL共振能量转移原理提出了一种制备简单、成本低、反应能耗低、绿色环保、灵敏度高的生物传感器制备方法，并将其应用于类胰蛋白酶的实际样品检测，检出限低至1.3 fg/mL，线性范围宽至5 fg/mL‑100 ng/mL，灵敏度高、重现性好，具有较大的潜在应用价值。

Description

一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法
技术领域
本发明属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域。
背景技术
作为一门由生物、化学、医学、电子技术等多种学科相互交叉而兴起的研究热点，电致化学发光ECL免疫分析技术是电化学、化学发光以及免疫分析技术的有机结合，具有成本低、选择性好、灵敏度高、分析速度快，易于自动化、微型化与集成化等优点，已被广泛应用于疾病标志物分析、食品安全分析、环境污染分析等领域。
类胰蛋白酶是人机体发生过敏反应时产生的一种特异性蛋白酶，可作为过敏反应的一种指示标志物，它的灵敏检测可为人体过敏反应进行有效的早期预警，及时控制病情，避免过敏性休克甚至死亡的发生。目前，类胰蛋白酶的浓度主要是通过一些价格昂贵的大型色谱、原子发射光谱等仪器进行检测，往往需要专业人员进行检测且检测费用昂贵，因此研制微型、便携、操作简单的生物传感器成为了研究热点。电致化学发光技术结合了化学发光与电化学两种技术的优势，具有易于操作、可控性强、响应速度快、灵敏度高、检测限低的优势，可见，这为类胰蛋白酶检测新方法的提出提供了一种更为强有力的技术支持，本发明正是基于电致化学发光技术而提出的一种生物传感器的制备方法，旨在为弥补现有检测方法的不足，为类胰蛋白酶的早期临床检测提供一种全新的检测方法。
发明内容
本发明的技术任务之一是为了弥补现有检测技术的不足，以铁蛋白封装Ir(ppy)3作为能量供体，以纳米金作为能量受体，基于Ir(ppy)3与纳米金的共振能量转移原理，实现了对Ir(ppy)3 ECL激发的有效调控，提出了一种操作简单、绿色环保无污染、成本低、信号响应迅速的生物传感技术，可以超灵敏地指示类胰蛋白酶的浓度变化，大大缩短了检测的时间，省时省力。
本发明的技术任务之二是提供所述生物传感器的用途，该传感器能够快速检测类胰蛋白酶，具有灵敏度高、重现性好、便携和操作简单的优点，检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将玻碳电极进入1 ~ 3%氯金酸溶液中电沉积一层纳米金作为传感基底，在表面滴加6 μL、浓度为10 ug/mL的捕获抗体Ab1溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C孵化12 h；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL 类胰蛋白酶的标准溶液或未知浓度的类胰蛋白酶溶液，37 °C下孵化0.5~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干;
（5）滴加6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕。
2. 如权利要求1所述的一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，所述检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，按以下步骤制备：
将3 ~ 5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与0.5 ~ 2.5 mL、浓度为10 mmol/L的Ir(ppy)3溶液混合，用0.1 mol/L的HCl溶液调节溶液pH至3.2，搅拌1 h后，用向上述混合溶液中加入50 ~ 150 uL、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2 h后得到黄色的Ft-Ir(ppy)3溶液，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，继续加入100 ~ 300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化6 ~ 18 h，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，置于4 °C下储存备用。
3. 如权利要求1所述的制备方法制备的生物传感器用于类胰蛋白酶浓度的检测。
4. 如权利要求4所述的类胰蛋白酶浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.2 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含45 ~ 75 mmol/L 三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度类胰蛋白酶时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度的类胰蛋白酶实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的类胰蛋白酶浓度。
本发明的有益成果
（1）本发明利用pH引导的蛋白解聚/重组法，在去铁铁蛋白Ft内部封装大量三(2-苯基吡啶)合铱Ir(ppy)3分子得到Ft-Ir(ppy)3作为电致化学发光ECL能量供体，以玻碳电极表面修饰纳米金作为ECL能量受体，首次基于Ir(ppy)3优异的ECL性能及其与纳米金的ECL共振能量转移原理提出了一种高灵敏的生物传感器制备方法。
（2）本发明弥补了现有检测技术操作复杂、灵敏度低、便携性差的问题，将该传感器应用于类胰蛋白酶的样品检测，检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL，具有响应速度快、灵敏度高、重现好、制备简单、成本低、绿色环保、便携的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1. 一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将玻碳电极进入1% 氯金酸溶液中电沉积一层纳米金作为传感基底，在表面滴加6μL、浓度为10 ug/mL的捕获抗体Ab1溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C孵化12 h；
（3）滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL 类胰蛋白酶的标准溶液或未知浓度的类胰蛋白酶溶液，37 °C下孵化0.5~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干;
（5）滴加6 μL、浓度为2 mg/mL检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕。
实施例2. 一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将玻碳电极进入2 % 氯金酸溶液中电沉积一层纳米金作为传感基底，在表面滴加6μL、浓度为10 ug/mL的捕获抗体Ab1溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C孵化12 h；
（3）滴加3 μL、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL 类胰蛋白酶的标准溶液或未知浓度的类胰蛋白酶溶液，37 °C下孵化0.5~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干;
（5）滴加6 μL、浓度为3 mg/mL检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕。
实施例3. 一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将玻碳电极进入3 % 氯金酸溶液中电沉积一层纳米金作为传感基底，在表面滴加6μL、浓度为10 ug/mL的捕获抗体Ab1溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C孵化12 h；
（3）滴加3 μL、质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL 类胰蛋白酶的标准溶液或未知浓度的类胰蛋白酶溶液，37 °C下孵化0.5~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干;
（5）滴加6 μL、浓度为4 mg/mL检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕。
实施例4. 所述检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，按以下步骤制备：
将3 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与0.5 mL、浓度为10 mmol/L的Ir(ppy)3溶液混合，用0.1 mol/L的HCl溶液调节溶液pH至3.2，搅拌1 h后，用向上述混合溶液中加入50 uL、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2 h后得到黄色的Ft-Ir(ppy)3溶液，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，继续加入100 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化6h，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例5. 所述检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，按以下步骤制备：
将4 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与1.5 mL、浓度为10 mmol/L的Ir(ppy)3溶液混合，用0.1 mol/L的HCl溶液调节溶液pH至3.2，搅拌1 h后，用向上述混合溶液中加入100uL、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2 h后得到黄色的Ft-Ir(ppy)3溶液，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，继续加入200 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化12 h，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例6. 所述检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，按以下步骤制备：
将5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与2.5 mL、浓度为10 mmol/L的Ir(ppy)3溶液混合，用0.1 mol/L的HCl溶液调节溶液pH至3.2，搅拌1 h后，用向上述混合溶液中加入150uL、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2 h后得到黄色的Ft-Ir(ppy)3溶液，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，继续加入300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化18 h，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例7. 类胰蛋白酶浓度的检测步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.2 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含45 mmol/L 三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度类胰蛋白酶时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度的类胰蛋白酶实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的类胰蛋白酶浓度。
实施例8. 类胰蛋白酶浓度的检测步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.2 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含55 mmol/L 三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度类胰蛋白酶时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度的类胰蛋白酶实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的类胰蛋白酶浓度。
实施例9. 类胰蛋白酶浓度的检测步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.2 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含75 mmol/L 三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度类胰蛋白酶时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度的类胰蛋白酶实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的类胰蛋白酶浓度。

Claims (4)

1.一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将玻碳电极进入1 ~ 3%氯金酸溶液中电沉积一层纳米金作为传感基底，在表面滴加6 μL、浓度为10 ug/mL的捕获抗体Ab1溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C孵化12 h；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL类胰蛋白酶的标准溶液或未知浓度的类胰蛋白酶溶液，37 °C下孵化0.5~ 2 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干;
（5）滴加6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕。
2.如权利要求1所述的一种基于铁蛋白封装Ir(ppy)3的生物传感器制备方法，其特征在于，所述检测抗体Ab2标记的铁蛋白封装的三(2-苯基吡啶)合铱Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，按以下步骤制备：
将3 ~ 5 mL、浓度为5 μg/mL的铁蛋白溶液与0.5 ~ 2.5 mL、浓度为10 mmol/L的Ir(ppy)3溶液混合，用0.1 mol/L的HCl溶液调节溶液pH至3.2，搅拌1 h后，用向上述混合溶液中加入50 ~ 150 uL、质量分数50%的戊二醛溶液，持续搅拌2 h后得到黄色的Ft-Ir(ppy)3溶液，经过透析、纯化除去多余的Ir(ppy)3后，继续加入100 ~ 300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化6 ~ 18 h，离心后分散到1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中得到Ft-Ir(ppy)3-Ab2溶液，置于4 °C下储存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的生物传感器用于类胰蛋白酶浓度的检测。
4.如权利要求4所述的类胰蛋白酶浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.2 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含45 ~ 75 mmol/L 三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度类胰蛋白酶时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为1.3 fg/mL，线性范围5 fg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度的类胰蛋白酶实际样品的电致化学发光传感器进行测试得到相应的信号强度，据此根据工作曲线计算即可得到该试剂样品中的类胰蛋白酶浓度。
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