CN111766287A - 一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)32+免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)32+免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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杜宇
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Abstract

一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，属于纳米材料领域与生物传感领域；基于去铁铁蛋白(apoferritin)形貌均一、耐水热、可控组装的结构特性与Ru(bpy)3 2+优异的电致化学发光性能，本发明首次提出一种热诱导法在apoferritin内部实现大量Ru(bpy)3 2+分子的高效、快速封装，成功制得一种具有优异生物相容性与高发光效率的复合物Ru(bpy)3 2+@apoferritin，此方法简单高效，可避免传统封装方法苛刻的酸碱度要求与复杂的材料合成步骤，创新性明显；在Ru(bpy)3 2+@apoferritin表面修饰抗体分子，研制一种无标记型的电致化学发光免疫传感器检测非小细胞肺癌疾病标志物CYFRA 21‑1，检出限低至31 pg/mL，线性范围100 pg/mL‑50 ng/mL，在同类检测方法中具有明显的潜在应用价值。

Description

一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)32+免疫传感器的制备方法 及应用
技术领域
本发明属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域。
背景技术
CYFRA 21-1是细胞角蛋白19的可溶性片段，被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌的诊断具有重要价值。如果肺部存在不清晰的环形阴影，同时血清CYFRA21-1浓度高于30 ng/mL，原发性支气管肺癌的可能性非常高，各类非小细胞肺癌阳性检出率为70%～85%，CYFRA21-1的血清浓度水平高低与肿瘤临床分期正相关，也可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发的有效指标，CYFRA 21-1的血清高浓度水平提示疾病处于进展期和预后不良，质量成功的标志是CYFRA 21-1的血清浓度迅速下降，反之则表示病灶未完全清除，CYFRA 21-1对各型肺癌诊断的敏感性依次为：鳞癌>腺癌>大细胞癌>小细胞癌。到目前为止，只有荧光法、电化学分析、色谱分析等几种分析方法得到了发展。因此，发展一种简单、快速、准确的测定方法，对于CYFRA 21-1的即时检测具有重要意义。
作为一门由生物、化学、医学、电子技术等多种学科相互交叉而兴起的研究热点，电致化学发光免疫分析是电致化学发光技术与免疫分析方法的有机结合，制得的免疫传感器具有成本低、选择性好、灵敏度高、分析速度快，易于自动化、微型化与集成化等优点，已被广泛应用于疾病标志物分析、食品安全分析、环境污染分析等领域。以电致化学发光性能优异的鲁米诺分子作为信号源，以过氧化氢作为共反应剂，可实现免疫传感器信号的高效、稳定输出，实现血清中CYFRA 21-1的快速灵敏检测。
由于Ru(bpy)3 2+在玻碳电极表面难以固定，导致其信号稳定性、重现性变差，传统体系通常会引入其他新型纳米材料来解决此问题，但这会使传感器的构建流程复杂繁琐，该类纳米材料生物相容性较差，不利于抗原抗体的孵化，进而对该传感器检测结果的准确性产生不利影响，难以实现临床推广应用。本发明以一种生物相容性极好的去铁铁蛋白apoferritin作为载体，通过一种新颖的热诱导法实现Ru(bpy)3 2+分子在其内部地高效封装，同时在其外部结合抗体分子作为信标物来构建免疫传感器，实现了CYFRA 21-1的高灵敏检测。
发明内容
本发明的技术任务之一是为了弥补现有Ru(bpy)3 2+封装方法的不足，创造性地提出热诱导法将Ru(bpy)3 2+高效地封装在去铁铁蛋白中，并有效保持其电致化学发光活性；
本发明的技术任务之二是提供所述免疫传感器的用途，构建了一种操作简单、成本低、信号响应迅速的免疫传感器，大大缩短了检测时间，节省了人力、物力、财力，检出限为31pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为5 ~ 15 mg/mL的CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的CYFRA 21-1抗原溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
2. 如权利要求1所述的一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，所述CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液按以下步骤制备：
室温下，将摩尔质量为5 ~ 10 nmol的去铁铁蛋白apoferritin与1 ~ 3 mL、浓度为3mmol/L的Ru(bpy)3 2+溶液混合搅拌15 ~ 45 min，得到均匀的混合溶液；在持续搅拌下，将反应温度匀速上升至60 °C保持2 ~ 4 h；反应停止，将溶液慢慢冷却到室温；通过超滤离心分离得到产物Ru(bpy)3 2+@apoferritin，将其分散至pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；取1 mL上述制备的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，向其中加入50 ~ 70 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入500 ~ 700 μL浓度为10 μg/mL的CYFRA 21-1抗体标准溶液，在4 °C下孵化12 ~ 24 h后，通过离心分离得到CYFRA 21-1抗体Ab标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，置于4 °C下储存备用。
3. 如权利要求1所述的制备方法制备的传感器用于CYFRA 21-1抗原浓度的检测。
4 如权利要求3所述的CYFRA 21-1抗原浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含25 ~ 45 mmol/L 三丙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1抗原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为31 pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度CYFRA 21-1的实际样品进行传感器测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的CYFRA 21-1浓度。
本发明的有益成果
（1）创造性地首次提出一种新颖的热诱导法在去铁铁蛋白内部的高效封装大量Ru(bpy)3 2+分子，充分利用去铁铁蛋白apoferritin优秀的生物相容性与Ru(bpy)3 2+分子优异的电致化学发光性能，基于此信标物研制了一种操作简单、成本低、信号响应迅速的无标记型电致化学发光免疫传感器；
（2）本发明针对CYFRA 21-1现有检测技术操作复杂、灵敏度低的弊端，首次基于电致化学发光技术，提出一种新颖的免疫传感方法用于CYFRA 21-1的灵敏检测，检出限为31 pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL，具有灵敏度高、重现好、制备简单、绿色环保等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1. 一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为5 mg/mL的CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 %的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的CYFRA 21-1抗原溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
实施例2. 1. 一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为10 mg/mL的CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的CYFRA 21-1抗原溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
实施例3. 1. 一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为15 mg/mL的CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的CYFRA 21-1抗原溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
实施例4. 所述CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液按以下步骤制备：
室温下，将摩尔质量为5 nmol的去铁铁蛋白apoferritin与1 mL、浓度为3 mmol/L的Ru(bpy)3 2+溶液混合搅拌15 min，得到均匀的混合溶液；在持续搅拌下，将反应温度匀速上升至60 °C保持2 h；反应停止，将溶液慢慢冷却到室温；通过超滤离心分离得到产物Ru(bpy)3 2+@apoferritin，将其分散至pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；取1 mL上述制备的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，向其中加入50 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入500 μL浓度为10 μg/mL的CYFRA 21-1抗体标准溶液，在4 °C下孵化12 h后，通过离心分离得到CYFRA 21-1抗体Ab标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例5. 所述CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液按以下步骤制备：
室温下，将摩尔质量为8 nmol的去铁铁蛋白apoferritin与2 mL、浓度为3 mmol/L的Ru(bpy)3 2+溶液混合搅拌30 min，得到均匀的混合溶液；在持续搅拌下，将反应温度匀速上升至60 °C保持3 h；反应停止，将溶液慢慢冷却到室温；通过超滤离心分离得到产物Ru(bpy)3 2+@apoferritin，将其分散至pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；取1 mL上述制备的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，向其中加入60 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入600 μL浓度为10 μg/mL的CYFRA 21-1抗体标准溶液，在4 °C下孵化18 h后，通过离心分离得到CYFRA 21-1抗体Ab标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例6. 所述CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液按以下步骤制备：
室温下，将摩尔质量为10 nmol的去铁铁蛋白apoferritin与3 mL、浓度为3 mmol/L的Ru(bpy)3 2+溶液混合搅拌45 min，得到均匀的混合溶液；在持续搅拌下，将反应温度匀速上升至60 °C保持4 h；反应停止，将溶液慢慢冷却到室温；通过超滤离心分离得到产物Ru(bpy)3 2+@apoferritin，将其分散至pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；取1 mL上述制备的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，向其中加入70 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入700 μL浓度为10 μg/mL的CYFRA 21-1抗体标准溶液，在4 °C下孵化24 h后，通过离心分离得到CYFRA 21-1抗体Ab标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例7. 将该免疫传感器用于CYFRA 21-1抗原浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含25 mmol/L 三丙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1抗原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为31 pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度CYFRA 21-1的实际样品进行传感器测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的CYFRA 21-1浓度。
实施例8. 将该免疫传感器用于CYFRA 21-1抗原浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含35 mmol/L 三丙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1抗原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为31 pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度CYFRA 21-1的实际样品进行传感器测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的CYFRA 21-1浓度。
实施例9. 将该免疫传感器用于CYFRA 21-1抗原浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含45 mmol/L 三丙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1抗原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为31 pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度CYFRA 21-1的实际样品进行传感器测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的CYFRA 21-1浓度。

Claims (4)

1.一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为5 ~ 15 mg/mL的CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液为传感基底，将其置于37 °C晾干；
（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
（4）滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的CYFRA 21-1抗原溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
2.如权利要求1所述的一种基于去铁铁蛋白封装Ru(bpy)3 2+免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，所述CYFRA 21-1抗体标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液按以下步骤制备：
室温下，将摩尔质量为5 ~ 10 nmol的去铁铁蛋白apoferritin与1 ~ 3 mL、浓度为3mmol/L的Ru(bpy)3 2+溶液混合搅拌15 ~ 45 min，得到均匀的混合溶液；在持续搅拌下，将反应温度匀速上升至60 °C保持2 ~ 4 h；反应停止，将溶液慢慢冷却到室温；通过超滤离心分离得到产物Ru(bpy)3 2+@apoferritin，将其分散至pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；取1 mL上述制备的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，向其中加入50 ~ 70 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入500 ~ 700 μL浓度为10 μg/mL的CYFRA 21-1抗体标准溶液，在4 °C下孵化12 ~ 24 h后，通过离心分离得到CYFRA 21-1抗体Ab标记的Ru(bpy)3 2+@apoferritin溶液，置于4 °C下储存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的传感器用于CYFRA 21-1抗原浓度的检测。
4.如权利要求3所述的CYFRA 21-1抗原浓度的检测，其特征在于，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电致化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 0.6 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含25 ~ 45 mmol/L 三丙胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光测试，得到孵化不同浓度CYFRA 21-1抗原时对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为31 pg/mL，线性范围100 pg/mL-50 ng/mL；
（3）将孵化未知浓度CYFRA 21-1的实际样品进行传感器测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的CYFRA 21-1浓度。
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