CN110376379B - 一种分子印迹结合静默区内标sers技术高精度检测cea的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分子印迹结合生物分子拉曼静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其先制备带有内标的金银核壳纳米颗粒和带有标记信号的聚多巴胺包金核壳纳米颗粒，然后将金银核壳纳米颗粒组装到金板上作为SERS基底，并在SERS基底上制备一层含有CEA的分子印迹层，而得到能够特异性识别CEA的SERS分子印迹层，再利用CEA分子印迹去特异性捕获溶液中的CEA，然后用抗体修饰的SERS探针去标记捕获到的CEA，最后进行SERS检测，并根据SERS探针的静默区拉曼信号强度与SERS基底内标信号强度的比值，推算溶液中CEA的浓度。本发明可大大提高CEA的检测效率，实现高精度、特异性检测痕量CEA。

Description

一种分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的 方法
技术领域
本发明属于CEA分析检测技术领域，具体涉及一种利用分子印迹结合静默区内标比率的SERS技术高精度检测CEA的方法。
背景技术
根据2016年统计数据，癌症已经成为发达国家的第二大死亡原因，中国约有280万人死于癌症。癌症的早期筛查和有效的预后监测可以大大提高患者的五年生存率，这主要依赖于对肿瘤组织和体液（血液、唾液和尿液）样本中癌症生物标志物的超灵敏、可靠的定量检测。其中一些癌症生物标志物已广泛应用于临床常规癌症筛查。例如，糖蛋白之一的癌胚抗原（CEA）作为传统广谱的肿瘤标志物，具有反映结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌等多种癌症存在的能力。
目前检测CEA的传统方法有酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）、荧光偏振免疫分析法、自动化免疫分析法等。这些方法虽然有效，但需要使用相应的抗体-抗体或抗原偶联标签，这些标签存在一定的局限性。另一方面，这些技术不能满足现代生物医学科学的所有期望，因为它们耗时，检测限相对较低，有时需要远离生物条件的特殊环境。此外，放射性同位素可能造成健康危害，许多荧光和化学发光探针容易受到测试环境的干扰。因此，迫切需要能够克服上述缺点的快速、超灵敏、特异的检测方法。
在过去的十年中，基于纳米光学技术的表面增强拉曼光谱（SERS）吸引了很大的关注，其超灵敏的检测能力（甚至在单分子水平）为生物医学应用提供了一个新颖和强大的方法，特别是可用于对各种癌症生物标记物的检测。为了进一步提高表面分子印迹聚合物（SMIP）检测目标物的效率，目前已将SMIP与SERS技术相结合，开发出一种更强大的检测策略（SMIP-SERS），其中表面分子印迹聚合物具有更好的类抗体结合性能或可与模板聚合产生酶样活性，且该方法制备简便，成本低廉，与传统免疫SERS法相比具有显著优势。然而，目前SMIP-SERS虽然灵敏，前景广阔，但也存在一定的局限性：首先，这种方法使用的拉曼探针信号位于指纹区（300-1800 cm-1），因此很容易受到来自内源性生物分子的拉曼信号的干扰；其次，用于定量检测的SERS峰强度往往会由于激光功率和外部环境的变化而出现意想不到的波动。这两个因素都会影响定量检测的最终精度，极大地限制了该方法在复杂生物样品检测中的进一步应用。因此，开发一种无干扰、高精度的拉曼检测糖蛋白肿瘤标志物方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法。该方法以CEA为模板分子，首先根据模板分子的结构，设计并合成带拉曼信号内标的SERS纳米阵列，接着以多巴胺-氨基苯硼酸偶联为胶粘剂制备CEA-SMIP SERS传感器，该传感器具有稳定的SERS内标信号并且可以特异性识别CEA，然后加上SERS探针标记后进行SERS检测，可达到对CEA高精度地定性和定量的检测，为早期癌症筛查、治疗监测和预后评估提供一种可靠的临床辅助方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其包括如下步骤：
1）合成金纳米颗粒（Au NPs）：在水中加入HAuCl4溶液，搅拌煮沸之后加入柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15 min至溶液颜色完全变为酒红色后，室温冷却，得到Au NPs溶胶；
2）合成带静默区SERS内标（4-巯基苯甲腈，MB）的金银核壳结构纳米颗粒（Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs）：在步骤1）所得Au NPs溶胶中加入MB溶液，搅拌反应1 h，得到Au@MB NPs溶胶；将其离心洗涤3次后重悬于超纯水中，并加入一定量的抗坏血酸，接着逐滴滴加AgNO3溶液，反应1 h，形成含有内标分子为MB的Au@MB@Ag NPs，接着加入对巯基苯胺（PATP）溶液和4-巯基苯硼酸（MPB）溶液（加入后体系中PATP和MPB的摩尔浓度比为1:75），搅拌反应1 h，制得Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，离心洗涤3次，浓缩后重悬于超纯水中；
3）合成Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs 阵列：将镀有金膜的板（GCMS）浸泡在多巴胺Tris盐酸缓冲溶液中，搅拌反应1 h，形成聚多巴胺包裹的金板（GCMS@PDA），用超纯水洗涤冲洗3次并晾干；用移液枪量取步骤2）制备的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，缓慢滴于GCMS@PDA上形成圆形液滴，然后放在湿盒中反应24 h，Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs会在带有氨基与聚多巴胺包裹在金板上的多巴胺醌发生迈克尔加层反应，形成一层Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs圆形阵列；
4）合成识别CEA的SERS传感表面分子印迹阵列（CEA-SMIP）：在步骤3）制得的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs阵列上滴加CEA溶液，湿盒孵育20 min，接着用PBS冲洗去除非特异吸附的CEA；接着将其浸泡在多巴胺、氨基苯硼酸和过硫酸铵组成的三元混合溶液中（其中多巴胺、氨基苯硼酸和过硫酸铵的质量比为5:4:3），摇晃振荡1 h，然后用PBS溶液冲洗3次，最终得到含CEA的SERS传感分子印迹；然后用乙酸和SDS的混合溶液（其中乙酸浓度为0.1mol/L，SDS的质量分数为10%）洗脱-振荡循环多次以除去CEA模板分子，直到用UV-Vis 光谱法检测不到洗脱液中含有CEA的特征吸收峰后，氮气吹干，得到CEA-SMIP，保存在干燥器中待用；
5）合成用作探针的抗体修饰带静默区SERS信号（苯乙炔，EB）的聚多巴胺（PDA）包裹金核壳纳米颗粒（Au@EB@PDA@Ab NPs）：在步骤1）合成的Au NPs溶胶中加入多巴胺Tris盐酸缓冲溶液和EB溶液，剧烈搅拌1 h，形成Au@EB@PDA NPs溶胶，用超纯水离心洗涤3次，并用滤膜过滤后，浓缩重悬于超纯水中；然后在血清瓶中加入Au@EB@PDA NPs溶胶，并加入癌胚抗体（Ab），4℃孵育12 h，接着用BSA溶液在室温下孵育1 h，封闭表面非特异识别的点位，制备得Au@EB@PDA@Ab NPs溶胶，储存于4℃环境备用；
6）探针标记：用PBS润洗活化步骤4）制得的CEA-SMIP，接着将一系列含已知浓度CEA标准品的PBS溶液分别滴加到CEA-SMIP上，湿盒孵育20 min，接着用PBS洗掉未吸附的CEA，然后量取步骤5）制得的Au@EB@PDA@Ab NPs 溶胶，滴加到CEA-SMIP上孵育5 min，然用后PBS洗掉未与CEA结合的Au@EB@PDA@Ab NPs；
7）CEA的检测：在一定测试条件（λ=785 nm，20倍镜，扫描波数范围为400-2400 cm-1，积分1次）下，用拉曼光谱仪测量具不同浓度CEA的Au@EB@PDA@Ab NPs探针与Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs内标信号，然后以CEA浓度的对数值作为横坐标，SERS光谱中EB在2024 cm-1峰位的强度与MB在2224 cm-1峰位的强度的比值I2024/I2224（静默区SERS探针与内标的信号强度比率）作为纵坐标，绘制标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线；
8）基于血液样品的强度比率-浓度标准曲线的绘制：取一例待测血液样品，按步骤6）对待测血液样品进行标记，并用拉曼光谱仪在同一条件下进行测量，将得到的静默区SERS探针与内标的信号强度比率利用步骤7）绘制的标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线计算出血液样品中CEA的浓度；再采用加标法，按步骤6）标记后，用拉曼光谱仪在同一条件下精确测定加入一系列含已知浓度CEA标准品的血液样品，然后以血液样品中CEA浓度与加标浓度之和的对数值作为横坐标，静默区SERS探针与内标的信号强度比率作为纵坐标，绘制血液样品的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线；
9）未知血液样品中CEA检测：取其他未知CEA浓度的血液样品，按步骤6）对待测血液样品进行标记，并用拉曼光谱仪在同一条件下进行测量，将得到的静默区SERS探针与内标的信号强度比率利用步骤8）绘制的血液样品的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线计算出其中CEA的浓度。
本发明采用以上技术方案，利用金板作为基板，采用Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs作为表面增强拉曼散射（SERS）检测的基底，并且在基底上构建一层CEA分子印迹层用来特异性捕抓CEA分子，之后用Au@EB@PDA@Ab NPs去标记分子印迹上的CEA分子，发展出一种高选择性、高灵敏性和高精度的“三明治”结构检测肿瘤标志物CEA的方法。利用MB拉曼光谱中位于生物分子拉曼静默区峰位为2224 cm-1的SERS光谱强度作为内标对标记分子EB光谱信号进行强度归一化处理，能够避免生物分子指纹区拉曼信号对定量检测的影响，使得CEA溶液浓度与SERS强度的线性关系得到大大地提升，进一步提高该SERS光谱探针的检测灵敏度，其对血液样品中CEA的检测限可达5 pg/mL。其中，内标分子MB位于金核与银壳的中间层，拉曼标记分子EB位于金壳与聚多巴胺的中间层，从而保证了内标分子和标记分子的性质、空间结构和数量等不受检测环境的影响，进而确保检测结果的可靠性。因此，本发明所构建的CEA-SMIP-SERS传感器在癌症标志物高精度检测方面展现出巨大的潜力，为早期癌症筛查、治疗监测和预后评估提供一种可靠的临床辅助方法。
附图说明
图1中（A）为实施例合成的金纳米粒子（Au NPs）的透射电镜图（TEM）及其动态光散射粒径图；（B）为实施例合成的金银核壳结构纳米粒子（Au@EB@PDA）的透射电镜图（TEM）及其动态光散射粒径图；（C）为实施例合成的金银核壳结构纳米粒子（Au@MB@Ag）的透射电镜图（TEM）及其动态光散射粒径图；（D）实施例合成的Au NPs、Au@EB@PDA NPs、Au@MB NPs、Au@MB@Ag NPs的紫外-近红外吸收光谱。
图2为实施例合成的Au NPs、Au@EB@PDA NPs、Au@MB@Ag NPs、金板（GCMS）、聚多巴胺包裹金板（GCMS@PDA）、聚多巴胺包裹金板上组装Au@MB@Ag@PATA/MPB NPs阵列（CMSMNPs-coated GCMS@PDA）的拉曼光谱图。
图3中（A）为实施例中标准CEA溶液的浓度为0.1 pg/mL到100 µg/mL范围内的SERS光谱；（B）为实施例中以标记分子EB光谱中位于2024 cm-1处的峰值强度与浓度在0.1 pg/mL到100µg/mL范围内的CEA的标准曲线；（C）为实施例中以内标记分子MB光谱中位于2224 cm-1处的峰值强度对SERS光谱进行归一化处理后，用标记分子EB光谱中位于2024 cm-1处的峰值强度与浓度在0.1 pg/mL到100µg/mL范围内的CEA的标准曲线。
图4中（A）为待测血液中CEA溶液的浓度为5 pg/mL到1 ng/mL范围内的SERS光谱；（B）为以标记分子EB光谱中位于2024 cm-1处的峰值强度与浓度在5 pg/mL到1 ng/mL范围内的CEA的标准曲线，其中C0代表未加标的血液样品中CEA的浓度，C1代表加标CEA的浓度，C0+C1代表加标后血液样品中CEA的浓度；（C）为以内标记分子MB光谱中位于2224 cm-1处的峰值强度对SERS光谱进行归一化处理后，用标记分子EB光谱中位于2024 cm-1处的峰值强度与浓度在5 pg/mL到1 ng/mL范围内的CEA的标准曲线。
图5为与CEA-SMIP相互作用后未知CEA浓度的待测血液样品的SERS检测光谱。
图6为CEA-SMIP抗干扰SERS测试结果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例
1. 试剂：氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸钠（Na3C6H5O7）、苯乙炔（EB）、4-对巯基苯甲腈（MB）、对氨基苯硫酚（PATP）、4-巯基苯硼酸（MPB）、氨基苯硼酸（APBA）、过硫酸铵（APS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、抗坏血酸、硝酸银（AgNO3）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.2和8.5）、多巴胺Tris盐酸缓冲液（pH=8.5）、牛血清白蛋白（BSA）、冰醋酸（HAc）、癌胚抗原（CEA）和抗体（Ab）、金板（GCMS）、葡萄糖（Glucose）、甲胎蛋白（AFP）。
2. 纳米颗粒的合成
1）合成金纳米颗粒（Au NPs）：在锥形瓶中加入99 mL的超纯水，1 mL 1%的HAuCl4溶液，搅拌煮沸之后，加入1 mL 1% 的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15 min，室温冷却，得到Au NPs溶胶。
2）合成带静默区SERS内标（4-巯基苯甲腈，MB）的金银核壳结构纳米颗粒（Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs）：在锥形瓶中加入10 mL步骤1）合成的Au NPs溶胶，随后加入10 μL 10mM MB溶液，搅拌反应1 h得到Au@MB NPs溶胶；离心洗涤3次后重悬于10 mL超纯水中，然后加入2 mL 0.1 M的抗坏血酸溶液，接着逐滴滴加2.5 mL 1 mM AgNO3溶液，反应1 h，形成含有内标分子MB的Au@MB@Ag NPs；接着加入4 μL 1 mM 对巯基苯胺（PATP）溶液和30 μL 10mM 巯基苯硼酸（MPB）溶液，反应1 h，制备得Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，离心洗涤3次，浓缩重悬于200 μL超纯水中。
3）合成用作探针的抗体修饰带静默区SERS信号（苯乙炔，EB）的聚多巴胺（PDA）包裹金核壳纳米颗粒（Au@EB@PDA@Ab NPs）：在锥形瓶中加入5 mL 步骤1）合成的Au NPs溶胶，接着加入5 mL 0.2 mg/mL的多巴胺Tris盐酸缓冲溶液（pH=8.5）和10 μL 100 mM EB溶液，剧烈搅拌1 h，形成Au@EB@PDA NPs溶胶，然后用超纯水离心洗涤3次，并用0.22 μm 的滤膜过滤，浓缩重悬于1 mL超纯水；然后在2 mL血清瓶中加入300 μL Au@EB@PDA NPs溶胶，并加入2.5 μL的癌胚抗体（CEA Ab)，在4℃孵育12 h，接着加入5 μL 10%的牛血清白蛋白（BSA）溶液，在室温下孵育1 h 封闭非特异识别的点位，制得Au@EB@PDA@Ab NPs溶胶，储存于4℃环境备用。
3. 组装SERS基底阵列和合成CEA分子印迹
1）金板上组装Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs阵列
将镀有金膜的板（Au plate）浸泡在5 mL 0.2 mg/mL的多巴胺Tris盐酸缓冲溶液（pH=8.5）中，搅拌反应1 h超纯水洗涤冲洗3次并晾干，形成聚多巴胺包裹的金板Au plate@PDA；用移液枪取8 μL制备好的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs缓慢滴在Au plate@PDA上形成直径4 mm的圆形液滴，放在湿盒中24 h，然后用超纯水冲洗，去除未反应的纳米颗粒，形成一层Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs圆形阵列。
2）合成识别CEA的SERS传感表面分子印迹阵列（CEA-SMIP）
在制得的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs阵列上滴加3 μL 10 μg/mL的CEA溶液，在湿盒孵育20 min，接着用PBS（pH=7.4）冲洗去除非特异吸附的CEA；接着将其浸泡在含2.0 mg/mL多巴胺、1.6 mg/mL氨基苯硼酸和1.2 mg/mL过硫酸铵的PBS溶液（pH=8.5）中，摇晃振荡1 h，然后用PBS溶液（pH=8.5）冲洗3次，最终得到含CEA的SERS传感分子印迹；然后用含0.1 M 乙酸和质量分数为10% SDS的混合溶液洗脱-振荡循环多次以除去CEA模板分子，洗脱时间为20-180 min（优选为180 min），直到用UV-Vis 光谱法检测不到洗脱液中含有CEA的特征吸收峰，最后氮气吹干，得到CEA-FMIP，保存在干燥器中待用。
4. 探针标记
用PBS（pH=8.5）润洗制得的CEA-SMIP，接着将一系列3 μL已知浓度CEA标准品的PBS溶液分别滴加到CEA-SMIP上，湿盒孵育20 min，接着用PBS洗掉未吸附的CEA，然后在其上滴加3 μL制得的Au@EB@PDA@Ab NPs溶胶，孵育5 min，然后用PBS去掉未结合的Au@EB@PDA@Ab NPs。
5. CEA检测
在一定测试条件下（λ = 785 nm，20倍镜，扫描波数范围为400-2400 cm-1，积分1次），用拉曼光谱仪分别测量不同浓度CEA的SERS探针信号，然后以CEA浓度的对数值作为横坐标，SERS光谱中EB在2024 cm-1峰位的强度与MB在2224 cm-1峰位的强度的比值I2024/I2224（静默区SERS探针与内标的信号强度比率）作为纵坐标，绘制标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线。
6. 标准曲线的绘制
取一例待测血液样品，按“4. 探针标记”对待测血液样品进行标记，并用拉曼光谱仪进行测量，将得到的静默区SERS探针与内标的信号强度比率利用绘制好的标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线计算出血液样品中CEA的浓度，然后采用加标法，再按“4. 探针标记”后用拉曼光谱仪精确测量加入一系列含已知浓度CEA标准品的加标后血液样品，然后以血液样品中CEA浓度与加标浓度之和的对数值作为横坐标，静默区SERS探针与内标的信号强度比率作为纵坐标，绘制血液样品的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线。
7. 抗干扰测定
以10 μg/mL的葡萄糖（Glucose）、甲胎蛋白（AFP）或牛血清白蛋白（BSA）作为干扰物质加入到PBS溶液中，按“4. 探针标记”对干扰样品进行标记，并用拉曼光谱仪进行测量，将得到的静默区SERS探针与内标的信号强度比率与浓度为10 μg/mL CEA的检测结果进行比较。
如图1中所示，通过柠檬酸钠还原氯金酸制得的Au NPs较均一，粒径约为30 nm（A），其最大紫外吸收峰位于526 nm左右（D）。利用多巴胺在碱性环境下可聚合成聚多巴胺的特性，将苯乙炔包裹在金核外层，形成的核壳结构Au@EB@PDA NPs较均匀统一，粒径约为37 nm（B），其最大紫外吸收峰位于533 nm左右（D）。结合图2拉曼表征可见，合成的Au@BE@PDA NPs在静默区2024 cm-1具有非常强的信号，可作为无生物拉曼“指纹区”信号干扰的SERS探针。在Au NPs表面修饰内标分子MB后，其最大紫外吸收峰变为529 nm。利用抗坏血酸还原硝酸银，形成的Au@MB@Ag核壳胶体尺寸较均一，粒径约为40 nm，并可以明显看出其核壳结构，其紫外最大吸收峰由526 nm移到521 nm处（C），而在418 nm处的峰包是银的吸收峰（D）。结合图2拉曼表征可见，合成的Au@MB@Ag在生物拉曼静默区2224 cm-1具有非常强的信号，可作为带内标的SERS基底，避开生物拉曼指纹区信号的干扰。
为了进一步验证Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs是否成功组装到金板上，用拉曼技术表征金板（GCMS）、多巴胺包裹金板（GCMS@PDA）及组装Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs的金板（CMSM-coated GCMS@PDA）的拉生曼信号变化，如图2所示，GCMS@PDA的拉曼信号可以观察到1000-1500 cm-1产生两个峰包，证明了在金板上成功包裹了PDA；CMSM-coated GCMS@PDA的拉曼信号证明了Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs成功组装到金板上，并且带有静默区2224 cm-1拉曼峰。
本发明中利用所设计的CEA-SMIP-SERS结构，通过分子印迹-抗原-抗体进行特异性识别，在标准溶液中检测不同浓度CEA，可以得到CEA从0.1 pg/mL到100 µg/mL的一系列SERS光谱。如图3中（A）所示，在能检测到内标分子MB的SERS谱峰的同时，也可以检测到标记分子EB的光谱信号（MB的SERS光谱特有的特征峰是在2224 cm-1处，而峰位2024 cm-1是EB所特有的拉曼峰）。为了准确证明CEA的浓度对SERS强度的影响，我们监测了位于2024 cm-1和2224 cm-1处的SERS峰位的强度。由图3中可以看出，在未用内标2224 cm-1做谱峰归一化校准时，随着抗原浓度从0.1 pg/mL增加到10 µg/mL，以光谱中标记分子2024 cm-1峰位处的SERS强度做标准曲线是y = 339.2654 X+565.4371，计算所得的相关系数R2 = 0.93918，而利用内标分子2224 cm-1 SERS峰位的强度做归一化处理，将EB光谱中2024 cm-1峰位的SERS强度与MB光谱中2224 cm-1峰位的SERS强度相比，所得的比值作为纵坐标，可以观察到抗原浓度从0.1 pg/mL增加到10 µg/mL的过程中比值I2024/I2224的变化，且其计算所得的相关系数是R2 =0.99173，即此时R2显著提高，表明了CEA浓度与SERS强度呈现一个良好的线性关系。
为了验证构建的CEA-SMIP-SERS结构用于实际血液样品检测的实用性，血液样品在进行该方法检测之前，先用ECLIA检测，血液样品中CEA浓度为小于0.2 ng/mL。之后，用上述方法检测，并利用所得标准曲线y = 0.0438 X+0.0566计算得出血液样品中CEA浓度为0.52 pg/mL。取同一血液样品，加入CEA标准品制得CEA血液样品，然后把组装的CEA-SMIP分别与加标浓度（C1）为5 pg/mL到1 ng/mL的CEA血液样品相互作用后，再连接Au@BE@PDANPs，得到一系列的光谱。如图4所示，在未用内标2224 cm-1做谱峰归一化校准时，随着加标抗原浓度从5 pg/mL增加到1 ng/mL，以光谱中标记分子2024 cm-1峰位处的SERS强度做标准曲线是y = 461.9678 X+456.5204，计算所得的相关系数R2 = 0.9717（其中C0+C1代表加标后血液样品中CEA的浓度）。利用内标分子2224 cm-1 SERS峰位的强度做归一化处理。将EB光谱中2024 cm-1峰位的SERS强度与MB光谱中2224 cm-1峰位的SERS强度相比，所得的比值作为纵坐标，可以观察到抗原浓度从5 pg/mL增加到1 ng/mL的过程中比值I2024/I2224的变化，且其计算所得的相关系数是R2 =0.9743，即此时的R2具有显著的提高，也表明了CEA浓度与SERS强度呈现一个良好的线性关系。
然后，把组装的CEA-SMIP与1例未知CEA浓度的血液样品相互作用后，再连接Au@BE@PDA NPs，得到的光谱如图5所示。将EB光谱中2024 cm-1峰位的SERS强度与MB光谱中2224cm-1峰位的SERS强度相比（I2024/I2224），所得的比值为y=0.213，代入y = 0.06042 X+0.03107，解得X=3.011，进一步将X值代入公式X=log C（C为CEA浓度），解得C=1.027 ng/mL。而将该血液样品用ECLIA检测，得出该血液中CEA浓度为1.05。结果表明CEA-SMIP SERS方法与ECLIA检测方法得出的测试值较为接近。
此外，为进一步证明CEA-SMIP的特异性，将CEA-SMIP分别与干扰物结合进行SERS检测，结果如图6所示。由图中可见，在同一浓度下干扰物葡萄糖（Glucose）、甲胎蛋白（AFP）、牛血清白蛋白（BSA）静默区的SERS比率值远小于CEA静默区的SERS比率值，表明本发明构建的CEA-SMIP具有很好的特异性。
综上，验证了本发明分子印迹结合静默区内标法SERS技术高精度检测CEA的方法，具有重要实际运用价值。

Claims (3)

1. 一种CEA-SMIP-SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述传感器包括用于识别CEA的SERS传感表面分子印迹阵列CEA-SMIP和用作探针的抗体修饰带静默区SERS信号的聚多巴胺包裹金核壳纳米颗粒Au@EB@PDA@Ab NPs；
所述用于识别CEA的SERS传感表面分子印迹阵列CEA-SMIP的制备包括如下步骤：
1）合成金纳米颗粒Au NPs：在水中加入HAuCl4溶液，搅拌煮沸之后加入还原剂柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15 min，室温冷却，得到Au NPs溶胶；
2）合成带静默区SERS内标的金银核壳结构纳米颗粒Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs：在步骤1）所得Au NPs溶胶中加入内标4-巯基苯甲腈溶液，搅拌反应1 h，得到Au@MB NPs溶胶；将其离心洗涤后重悬于超纯水中，并加入抗坏血酸，接着逐滴滴加AgNO3溶液，反应1 h，形成Au@MB@Ag NPs，接着加入对巯基苯胺溶液和4-巯基苯硼酸溶液，搅拌反应1 h，制得Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，离心洗涤浓缩后重悬于超纯水中；
3）合成Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs 阵列：将镀有金膜的板浸泡在多巴胺Tris盐酸缓冲溶液中，搅拌反应1 h，形成聚多巴胺包裹的金板；用移液枪量取步骤2）制备的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，缓慢滴于聚多巴胺包裹的金板上形成圆形液滴，然后放在湿盒中反应24 h，形成一层Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs圆形阵列；
4）合成识别CEA的SERS传感表面分子印迹阵列CEA-SMIP：在步骤3）制得的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs阵列上滴加CEA溶液，湿盒孵育20 min，接着用PBS冲洗去除非特异吸附的CEA；接着将其浸泡在三元混合溶液中，摇晃振荡1 h，然后用PBS溶液冲洗3次，最终得到含CEA的SERS传感分子印迹；然后用乙酸和SDS的混合溶液洗脱-振荡循环多次以除去CEA模板分子，直到用UV-Vis 光谱法检测不到洗脱液中含有CEA的特征吸收峰后，氮气吹干，得到CEA-SMIP，保存在干燥器中待用；所述三元混合溶液为多巴胺、氨基苯硼酸和过硫酸铵的PBS溶液，其中，多巴胺、氨基苯硼酸和过硫酸铵的质量比为5:4:3；
所述用作探针的抗体修饰带静默区SERS信号的聚多巴胺包裹金核壳纳米颗粒Au@EB@PDA@Ab NPs的制备包括如下步骤：
a）合成金纳米颗粒Au NPs：在水中加入HAuCl4溶液，搅拌煮沸之后加入还原剂柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15 min，室温冷却，得到Au NPs溶胶；
b）在步骤a）合成的Au NPs溶胶中加入多巴胺Tris盐酸缓冲溶液和苯乙炔溶液，剧烈搅拌1 h，形成Au@EB@PDA NPs溶胶，离心洗涤过滤后重悬于超纯水中；然后在血清瓶中加入Au@EB@PDA NPs溶胶，并加入癌胚抗体Ab，4℃孵育12 h，接着用BSA溶液封闭表面非特异识别的点位，制备得Au@EB@PDA@Ab NPs溶胶。
2.根据权利要求1所述的CEA-SMIP-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤2）对巯基苯胺溶液和4-巯基苯硼酸溶液加入后体系中对巯基苯胺和4-巯基苯硼酸的摩尔浓度比为1:75。
3. 根据权利要求1所述的CEA-SMIP-SERS传感器的制备方法，其特征在于，步骤4）所述乙酸和SDS的混合溶液中乙酸浓度为0.1 mol/L，SDS的质量分数为10%。
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