CN112014374B - 一种表面增强拉曼免疫分析平面传感器及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表面增强拉曼免疫分析平面传感器及制备方法和应用；传感器包括一SERS平面基底和一SERS标签；传感器的制备方法和应用于疾病标志物分子检测。SERS平面基底的制备为在二维纳米金阵列表面修饰多巴胺、待测物抗体以及牛血清白蛋白。SERS标签的制备为在纳米金颗粒表面修饰报告分子，牛血清白蛋白封装，多巴胺和待测物抗体修饰。该传感器的优势在于：①在样品检测中，通过淋洗对平面传感器进行清洗，方便快捷；②有序纳米金阵列产生均匀“热点”，信号重现性好；③SERS基底与标签的靠近可增强拉曼检测灵敏度；④免疫“夹心法”的特异性强，与SERS结合可实现对目标分子的定性及定量检测，响应灵敏，检测时间短。
Description
技术领域
本发明涉及一种表面增强拉曼免疫分析(Surface-Enhanced Raman ScatteringImmunoassay)传感器的制备和使用方法，属于生物传感和医学诊断领域。
背景技术
拉曼光谱(Raman Spectroscopy)技术是基于光的非弹性散射效应发展起来的一种光谱分析检测技术。表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)是待测物质分子吸附在金属溶胶颗粒(如金、银、铜)表面或者粗糙金属表面时，该分子的拉曼信号大大增强的一种现象，已在食品安全及环境污染检测方面得到了有效的发展。但是SERS技术在医学诊断方面仍面临很大挑战，这是因为通常疾病诊断中所面对的生物标志物分子浓度较低，而血清或尿液样本中组分复杂、干扰成分多，拉曼光谱本身对特定分子并没有选择性，使得传统SERS传感器的灵敏度和抗干扰性往往达不到要求。
将免疫分析法与表面增强拉曼检测方法相结合，开发表面增强拉曼免疫分析传感器有望解决拉曼检测在医学诊断中面临的实际问题。免疫分析法(Immunoassay)是一种基于生物分子之间的免疫亲和，即抗原-抗体之间特异性亲和作用的分析方法，是生物医学检测及疾病诊断中的有力手段。“夹心法”是免疫分析中的常用方法，其将特异性抗体吸附在固相载体上，然后加入待测溶液，若样品中有相应待测抗原，则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入经特殊标记的特异性抗体，后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体，最终通过检测标记物信号来确定待测溶液中的抗原含量。目前已有一些将夹心免疫分析法与表面增强拉曼检测相结合的报道，如：张茂峰等人公开了一种基于金核银壳纳米棒的“检测抗体-待测抗原-捕获抗体”夹心结构传感器(中国发明专利，申请号：201910856874.X)。游力军等人公开了一种基于磁性微球的表面增强拉曼免疫传感器的制备方法(中国发明专利，申请号：201910391964.6)。
上述方法均使用分散性的纳米颗粒作为SERS基底和SERS标签，检测过程中，当待测物与基底结合后以及再次结合SERS标签后，需要通过反复离心或引入磁场的方法对纳米粒子进行分离和洗涤，步骤繁琐，容易造成样品损耗。
发明内容
本发明针对上述问题，提出了一种基于平面结构的SERS传感器。当待测物与该平面基底结合后，可以通过简单的淋洗对结合了待测抗原的SERS基底进行清洗，当再次结合SERS标签后，同样可通过淋洗操作洗去过剩的SERS标签。
为实现上述目的，本发明提供了一种表面增强拉曼免疫分析平面传感器，其特征在于，包括一SERS平面基底，以及一SERS标签。
进一步地，所述SERS平面基底为二维纳米金阵列结构，其表面修饰特定检测物的抗体。
进一步地，所述SERS标签为纳米金颗粒结构，内嵌拉曼报告分子，其表面修饰特定检测物的抗体。
本发明还提供了这种表面增强拉曼免疫分析平面传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)SERS平面基底的制备：将含有纳米金颗粒的溶液离心，收集沉淀物并稀释到超纯水中，随后向其中加入水不溶性有机溶剂，形成有机-水两相界面，然后将乙醇加入该两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列；待上层有机溶剂挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列；将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，挑起玻璃片，在玻璃片上生成纳米金阵列；自然晾干后将玻璃片-纳米金阵列浸泡于盐酸多巴胺溶液中孵育，超纯水清洗后浸入缓冲液，加入抗体蛋白溶液，室温反应，再次超纯水清洗；随后浸入牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底。
(2)SERS标签的制备：将含有纳米金颗粒的溶液离心，收集沉淀物并稀释到超纯水中，得到纳米金浓缩液；将拉曼报告分子溶液及牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，室温搅拌反应后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，将沉淀物分散于缓冲液中，得到报告分子标记的纳米金溶液；依次加入盐酸多巴胺溶液和抗体蛋白溶液，室温继续孵育后，离心去除上清液，再次用用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签。
优选步骤1)所述的超纯水稀释后纳米金溶液浓度为1.0～1.5mmol/L。
优选步骤1)所述的水不溶性有机溶剂为正己烷、环己烷、乙酸乙酯或二氯甲烷，加入的水不溶性有机溶剂与纳米金溶液体积比为1:1～1:4。
优选步骤1)所述的加入的乙醇与纳米金溶液体积比为1:1～1:4
优选步骤1)所述的盐酸多巴胺溶液浓度为1～20mg/mL，盐酸多巴胺溶液中孵育时间为1～12h。
优选步骤1)所述的蛋白抗体为目标检测物的单克隆或多克隆抗体，抗体蛋白溶液浓度为10～100μg/mL，孵育时间为1～12h。
优选步骤1)所述的溶解抗体蛋白的缓冲液可为磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，甘氨酸-HCl缓冲液等，pH范围6.0～9.0，浓度为10～50mmol/L。
优选步骤1)所述的牛血清白蛋白溶液浓度为0.5％～7％(w/v)，封端时间为1～3h。
优选步骤2)所述的纳米金颗粒直径为10～50nm。
优选步骤2)所述的纳米金浓缩液浓度为0.5～10mmol/L。
优选步骤2)所述的拉曼报告分子为罗丹明B，或三聚氰胺，或4-氨基苯硫酚等，拉曼报告分子溶液浓度为0.5～5mmol/L，拉曼报告分子溶液与纳米金浓缩液体积比为1:50～1:10。
优选步骤2)所述的牛血清白蛋白溶液为0.5％～7％(w/v)，牛血清白蛋白溶液与纳米金浓缩液体积比为1:10～1:2。
优选步骤2)所述的拉曼报告分子，牛血清白蛋白与纳米金混合液搅拌反应时间为0.5～4h。
优选步骤2)所述的缓冲液可为磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，或甘氨酸-HCl缓冲液等，pH范围6.0～9.0，浓度为10～50mmol/L。
优选步骤2)所述的盐酸多巴胺溶液浓度为1～20mg/mL，盐酸多巴胺溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:2～1:10。
优选步骤2)所述的蛋白抗体为目标检测物的单克隆抗体或多克隆抗体，抗体蛋白溶液浓度为10～100μg/mL，抗体蛋白溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:2～1:10。
优选步骤2)所述的盐酸多巴胺，蛋白抗体与报告分子标记的纳米金混合液反应时间为0.5～5h。
本发明的表面增强拉曼免疫分析平面传感器应用于疾病标志物分子检测：
①标准曲线的建立：在缓冲液中配制一系列含有已知浓度目标分子的溶液，取相同体积分别滴加到SERS平面基底上，恒温孵育一段时间后分别用缓冲液和超纯水冲洗。之后将一定体积的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，恒温下孵育一段时间后，再次分别用缓冲液和超纯水冲洗；利用拉曼光谱仪进行光谱检测，依据拉曼报告分子特征峰强度值，建立针对该目标分子的定量标准曲线。
②实际样本检测：取一定体积的常规处理后的血清或尿液样本，滴加到SERS平面基底上，恒温孵育一段时间后分别用缓冲液和超纯水冲洗。之后将一定体积的SERS标签溶液滴加到该SERS基底上，恒温孵育一段时间后，再次分别用缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，测定拉曼报告分子特征峰强度值，依据标准曲线确定实际样本中目标物浓度。
优选缓冲液可为磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，或甘氨酸-HCl缓冲液等，pH范围7.0～7.5，浓度为10～50mmol/L。
优选滴加到SERS平面基底上的待测样品体积为2～15μL。
优选样品在基底上的孵育时间为10～60min，孵育温度为20～40℃。
优选加入的SERS标签溶液体积为5～20μL。
优选SERS标签在基底上的孵育时间为10～60min，孵育温度为20～40℃。
本发明的有益效果：
本发明所制备的传感器具有以下优势：
1)可以通过简单的淋洗对结合了待测抗原的SERS基底进行清洗，当再次结合SERS标签后，同样可通过淋洗洗去过剩的SERS标签，操作方便快捷。
2)SERS平面基底上的有序的纳米金阵列可在其平面一定距离之内产生均匀的“热点”，保证了样品在基底不同位置处拉曼光谱信号的一致性和重现性。
3)SERS标签中的纳米金颗粒与基底上的纳米金阵列相互靠近，产生“热点”，从而进一步激发SERS标签中的报告分子产生增强的拉曼信号，可以实现对较低浓度样品的灵敏测定。
4)利用“夹心法”，即“待测物抗体-待测物-待测物抗体”的免疫亲和作用可以对特定目标物分子进行特异性捕获，实现对特定疾病标志物分子的定性测定。利用本传感器可以实现对常见的小分子疾病标志物(如：甲状腺素，类固醇激素，羟基十八碳二烯酸，细菌及真菌荚膜多糖等)，和大分子蛋白类疾病标志物(如：C反应蛋白，免疫球蛋白，抗链球溶血素，抗胰蛋白酶等)的快速、灵敏检测。
附图说明
图1(a)：SERS平面基底的制备流程示意图；
图1(b)：SERS标签的制备流程示意图；
图1(c)：表面增强拉曼免疫分析平面传感器的使用流程示意图；
图2(a)：玻璃片-纳米金阵列的扫描电镜图像；
图2(b)：SERS平面基底的扫描电镜图；
图3：SERS标签的透射电镜图像；
图4(a)：在同一SERS平面基底上20个不同位置检测HIgG的拉曼光谱结果；
图4(b)：各拉曼光谱在特征峰1080cm-1处的强度；
图5(a)：HIgG检测标准曲线的拉曼光谱图及1080cm-1处特征峰强度；
图5(b)：HIgG浓度与拉曼特征峰强度之间关系的标准曲线；
图6：实际正常人血清样品中HIgG的检测效果。
具体实施方式
为了清楚了解本发明的技术方案，下面通过实施例和附图，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明的优选实施例详细描述如下，除详细描述的实施例外，还可以有其他实施方式。附图1(a)为SERS平面基底的制备流程示意图，附图1(b)为SERS标签的制备流程示意图，附图1(c)：为表面增强拉曼免疫分析平面传感器的使用流程示意图。
实施例1
1)SERS平面基底的制备：
将平均粒径10nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释至1.5mmol/L，以环己烷；纳米金溶液＝1:3的体积比向其中加入环己烷，形成有机-水两相界面，随后以乙醇：纳米金溶液＝1:1的体积比将乙醇快速加入该两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列。待上层环己烷挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列。将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，快速挑起玻璃片，生成负载纳米金阵列的SERS基底。自然晾干后将SERS基底浸泡于1mg/mL的盐酸多巴胺溶液中孵育12h,超纯水清洗后浸入20mmol/L,pH9.0的Tris-HCl缓冲液，加入100μg/mL的鼠抗人C反应蛋白抗体(CRP antibody)溶液，室温反应3h，再次超纯水清洗。随后将该SERS基底浸入0.5％的牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育3h，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底。
2)SERS标签的制备：
将平均粒径10nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释，得到10mmol/L的纳米金浓缩液。将0.5mmol/L的4-硝基苯硫酚溶液及0.5％牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，其中4-硝基苯硫酚溶液与纳米金浓缩液体积比为1:10，牛血清白蛋白溶液与纳米金浓缩液体积比为1:2，随后室温搅拌反应4h后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，用20mM，pH9.0的Tris-HCl缓冲液分散沉淀物，得到500μL报告分子标记的纳米金溶液。依次加入1mg/mL盐酸多巴胺溶液和100μg/mL的鼠抗人C反应蛋白抗体(CRP antibody)溶液，其中盐酸多巴胺溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:2，抗体蛋白溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:2，室温继续孵育0.5h后，离心去除上清液，再次用用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至20mM，pH9.0的Tris-HCl缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签。
3)表面增强拉曼免疫分析平面传感器应用于C反应蛋白抗体检测：
①标准曲线的建立：在50mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液中配制一系列含有C反应蛋白抗体(CRP)浓度目标分子溶液，取2μL相同体积分别滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育10min后分别用50mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液和超纯水冲洗。之后将15μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育60min后，再次分别用50mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，依据4-硝基苯硫酚在1336cm-1处特征峰强度值，建立针对CRP的定量标准曲线。
②实际样本检测：取2μL的常规处理后的血清或尿液样本，滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育10min后分别用50mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液和超纯水冲洗。之后将15μL的SERS标签溶液滴加到该基底上，37℃下孵育60min后，再次分别用50mM，pH7.5的Tris-HCl缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，测定4-硝基苯硫酚在1336cm-1处特征峰强度值，依据标准曲线确定实际样本中CRP浓度。
实施例2
1)SERS平面基底的制备：
将平均粒径20nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释至1.3mmol/L，以乙酸乙酯：纳米金溶液＝1：1的体积比向其中加入乙酸乙酯，形成有机-水两相界面，随后以乙醇：纳米金溶液＝1:4的体积比将乙醇快速加入该两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列。待上层乙酸乙酯挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列。将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，快速挑起玻璃片，生成负载纳米金阵列的SERS基底。自然晾干后将SERS基底浸泡于20mg/mL的盐酸多巴胺溶液中孵育1h,超纯水清洗后浸入50mmol/L,pH8的甘氨酸-HCl缓冲液，加入10μg/mL的鼠单克隆抗体EB-A2(曲霉菌半乳甘露聚糖抗体)溶液，室温反应12h，再次超纯水清洗。随后将该SERS基底浸入7％的牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育1h，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底。
2)SERS标签的制备：
将平均粒径20nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释，得到5mmol/L的纳米金浓缩液。将5mmol/L的罗丹明B溶液及7％牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，其中罗丹明B溶液与纳米金浓缩液体积比为1:50，牛血清白蛋白溶液与纳米金浓缩液体积比为1:10，随后室温搅拌反应2h后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，用50mmol/L,pH8的甘氨酸-HCl缓冲液分散沉淀物，得到500μL报告分子标记的纳米金溶液。依次加入20mg/mL盐酸多巴胺溶液和10μg/mL的鼠单克隆抗体EB-A2(曲霉菌半乳甘露聚糖抗体)溶液，其中盐酸多巴胺溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:10，抗体蛋白溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:5，室温继续孵育3h后，离心去除上清液，再次用用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至50mmol/L,pH8的甘氨酸-HCl缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签。
3)表面增强拉曼免疫分析平面传感器应用于曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测：
①标准曲线的建立：在10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中配制一系列含有曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(GM)浓度目标分子溶液，取15μL相同体积分别滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育1h后分别用10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。之后将20μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育1h后，再次分别用10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，依据罗丹明B在1646cm-1处特征峰强度值，建立针对GM的定量标准曲线。
②实际样本检测：取15μL的常规处理后的血清或尿液样本，滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育1h后分别用10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。之后将20μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育1h后，再次分别用10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，测定罗丹明B在1646cm-1处特征峰强度值，依据标准曲线确定实际样本中GM浓度。
实施例3
1)SERS平面基底的制备：
将平均粒径50nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释至1mmol/L，以二氯甲烷：纳米金溶液＝1:4的体积比向其中加入二氯甲烷，形成有机-水两相界面，随后以乙醇：纳米金溶液＝1:3的体积比将乙醇快速加入该两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列。待上层二氯甲烷挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列。将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，快速挑起玻璃片，生成负载纳米金阵列的SERS基底。自然晾干后将SERS基底浸泡于10mg/mL的盐酸多巴胺溶液中孵育6h,超纯水清洗后浸入30mmol/L,pH6的磷酸盐缓冲液，加入60μg/mL的人甲状腺素(T4)抗体溶液，室温反应8h，再次超纯水清洗。随后将该SERS基底浸入4％的牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育2h，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底。
2)SERS标签的制备：
将平均粒径50nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释，得到0.5mmol/L的纳米金浓缩液。将3mmol/L的三聚氰胺溶液及4％牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，其中三聚氰胺溶液与纳米金浓缩液体积比为3:50，牛血清白蛋白溶液与纳米金浓缩液体积比为1:6，随后室温搅拌反应0.5h后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，用30mmol/L,pH6的磷酸盐缓冲液10mM分散沉淀物，得到500μL报告分子标记的纳米金溶液。依次加入8mg/mL盐酸多巴胺溶液和60μg/mL的人甲状腺素(T4)抗体溶液，其中盐酸多巴胺溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:4，抗体蛋白溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:10，室温继续孵育5h后，离心去除上清液，再次用用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至30mmol/L,pH6的磷酸盐缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签。
3)表面增强拉曼免疫分析平面传感器应用于人甲状腺素检测：
①标准曲线的建立：在20mM，pH7.2的甘氨酸-HCl缓冲液中配制一系列含有人甲状腺素(T4)浓度目标分子溶液，取10μL相同体积分别滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育1h后分别用20mM，pH7.2的甘氨酸-HCl缓冲液和超纯水冲洗。之后将5μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育10min后，再次分别用20mM，pH7.2的甘氨酸-HCl缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，依据三聚氰胺在710cm-1处特征峰强度值，建立针对人甲状腺素(T4)的定量标准曲线。
②实际样本检测：取10μL的常规处理后的血清或尿液样本，滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育1h后分别用20mM，pH7.2的甘氨酸-HCl缓冲液和超纯水冲洗。之后将5μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育10min后，再次分别用20mM，pH7.2的甘氨酸-HCl缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，测定三聚氰胺在710cm-1处特征峰强度值，依据标准曲线确定实际样本中人甲状腺素(T4)浓度。
实施例4
1)SERS平面基底的制备：
将平均粒径30nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释至1.5mmol/L，以正己烷：纳米金溶液＝1:2的体积比向其中加入正己烷，形成有机-水两相界面，随后以乙醇：纳米金溶液＝1:2的体积比将乙醇快速加入该两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列。待上层正己烷挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列。将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，快速挑起玻璃片，生成负载纳米金阵列的SERS基底。自然晾干后将SERS基底浸泡于5mg/mL的盐酸多巴胺溶液中孵育1h,超纯水清洗后浸入10mmol/L,pH8.8的Tris-HCl缓冲液，加入50μg/mL的兔抗人免疫球蛋白(RA-HIgG)溶液，室温反应1h，再次超纯水清洗。随后将该SERS基底浸入2％的牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育1h，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底。
2)SERS标签的制备：
将平均粒径30nm的纳米金颗粒溶液离心，收集沉淀物并用超纯水稀释，得到2mmol/L的纳米金浓缩液。将1mmol/L的4-氨基苯硫酚溶液及1％牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，其中4-氨基苯硫酚溶液与纳米金浓缩液体积比为3:50，牛血清白蛋白溶液与纳米金浓缩液体积比为1:5，随后室温搅拌反应1h后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，用10mM，pH8.8的Tris-HCl缓冲液分散沉淀物，得到500μL报告分子标记的纳米金溶液。依次加入5mg/mL盐酸多巴胺溶液和50μg/mL的RA-HIgG溶液，其中盐酸多巴胺溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:5，抗体蛋白溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:5，室温继续孵育1h后，离心去除上清液，再次用用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至10mM，pH8.8的Tris-HCl缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签。
3)表面增强拉曼免疫分析平面传感器应用于人免疫球蛋白检测：
①标准曲线的建立：在10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液中配制一系列含有人免疫球蛋白(HIgG)浓度目标分子溶液，取10μL相同体积分别滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育0.5h后分别用10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。之后将10μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育0.5h后，再次分别用10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，依据4-氨基苯硫酚在1080cm-1处特征峰强度值，建立针对HIgG的定量标准曲线。
②实际样本检测：取10μL的常规处理后的血清或尿液样本，滴加到SERS平面基底上，37℃下孵育0.5h后分别用10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。之后将10μL的SERS标签溶液滴加到该SERS平面基底上，37℃下孵育0.5h后，再次分别用10mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液和超纯水冲洗。利用拉曼光谱仪进行光谱检测，测定4-氨基苯硫酚在1080cm-1处特征峰强度值，依据标准曲线确定实际样本中HIgG浓度。
测试例及测试结果
以实施例4为测试例详细叙述本发明技术效果。
1)SERS平面基底的制备效果
附图2(a)为玻璃片-纳米金阵列的扫描电子显微镜图像，从图中可以看出，玻璃片-纳米金阵列表面呈现金纳米颗粒紧密排列的阵列结构，这种粗糙表面更利于抗体结合，同时也为IgG蛋白的拉曼检测提供更多的“热点”。附图2(b)为SERS平面基底的扫描电镜图像。SERS平面基底是将玻璃片-纳米金阵列进行抗体修饰和牛血清白蛋白封闭后得到的，从扫描电子显微镜图像中可以明显看出玻璃片-纳米金阵列表面包覆了一层较薄的膜层，说明了抗体和牛血清白蛋白的成功修饰。
2)SERS标签的制备效果
附图3所示为SERS标签的透射电子显微镜图像，从图中可以看出纳米金颗粒粒径在30nm左右，周围包覆了2nm左右的半透明膜层，这表明了纳米金颗粒的成功合成以及修饰。
3)均一性检测效果
为了考察本发明中传感器的均一性，随机选取同一个SERS平面基底的20个不同位置，以同样的方法测定10μg/mLHIgG的拉曼光谱图。附图4(a)展示了20个不同位置的拉曼光谱图，从图中可以看到光谱数据的峰位置和峰强度保持了良好的均一性。附图4(b)为各谱图中报告分子1080cm-1特征峰处拉曼强度的比较，其相对标准偏差为6.46％，表明SERS传感器具有良好的均一性和重现性。
4)不同浓度的HIgG拉曼光谱检测效果
附图5(a)是0.1μg/mL-200μg/mL HIgG的拉曼光谱检测效果，报告分子4-ATP的拉曼信号强度随着HIgG浓度的增加而增加，当HIgG溶液的浓度低至0.1μg/mL时，该方法仍能检测出探针分子的特征峰，并且可以与只加入磷酸盐缓冲液的空白对照组显著区分。这一结果说明在此实验条件下，该方法对HIgG的检测较灵敏，且检测下限可达到0.1μg/mL。
附图5(b)是以HIgG溶液的浓度作为横坐标，以1080cm-1处的特征峰强度作为纵坐标，建立了特征峰强度与HIgG浓度之间的关系式。在0.1～200μg/mL浓度范围内，拉曼特征峰强度与HIgG浓度之间存在良好的线性关系，所得线性方程为拉曼强度＝183.12*[HigG浓度]+649.42，线性相关系数R2>0.99，，证明了该方法可以用于HIgG的定性与定量检测。
5)正常人血清样品HIgG的特异性拉曼光谱测试结果
图6是正常人血清样品中HIgG的拉曼光谱测试结果。向正常人血清样品中加入20mg/mL，40mg/mL浓度的HIgG，并将样品稀释1000倍后进行拉曼光谱测试。随着HIgG的加入以及加入量的增加，HIgG在1080cm-1处的特征峰强度逐渐增强。利用在PBS缓冲液中测得的HIgG标准曲线(拉曼强度＝183.12*[HigG浓度]+649.42)，可以计算出人血清样品中HIgG的含量为9.70±0.45mg/mL，据报道正常人血清中HIgG的含量范围是6-16mg/mL，实验结果与实际区间相符合，并且加标后样品1080cm-1处特征峰强度的增量也满足标准曲线。血清检测结果表明，该SERS传感器具有良好的特异性以及抗干扰能力，可以应用于实际样品的检测。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种表面增强拉曼免疫分析平面传感器，其特征在于，包括一SERS平面基底和一SERS标签；SERS平面基底为二维纳米金阵列结构，其表面修饰特定检测物的抗体；SERS标签为纳米金颗粒结构，内嵌拉曼报告分子，其表面修饰特定检测物的抗体；制备方法包括以下步骤：
（1）SERS平面基底的制备：将含有纳米金颗粒的溶液离心，收集沉淀物并稀释到超纯水中，随后向其中加入水不溶性有机溶剂，形成有机-水两相界面，然后将乙醇加入有机-水两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列；待上层有机溶剂挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列；将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，挑起玻璃片，在玻璃片上生成纳米金阵列；自然晾干后将玻璃片-纳米金阵列浸泡于盐酸多巴胺溶液中孵育，超纯水清洗后浸入缓冲液，加入抗体蛋白溶液，室温反应，再次超纯水清洗；随后浸入牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底；
（2）SERS标签的制备：将含有纳米金颗粒的溶液离心，收集沉淀物并稀释到超纯水中，得到纳米金浓缩液；将拉曼报告分子溶液及牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，室温搅拌反应后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，将沉淀物分散于缓冲液中，得到报告分子标记的纳米金溶液；依次加入盐酸多巴胺溶液和抗体蛋白溶液，室温继续孵育后，离心去除上清液，再次用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签。
2.如权利要求1所述表面增强拉曼免疫分析平面传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）SERS平面基底的制备：将含有纳米金颗粒的溶液离心，收集沉淀物并稀释到超纯水中，随后向其中加入水不溶性有机溶剂，形成有机-水两相界面，然后将乙醇加入有机-水两相溶液，使得纳米金颗粒在两相界面处形成整齐排列的阵列；待上层有机溶剂挥发后，在水-空气两相界面形成有序的纳米金阵列；将洁净干燥的玻璃载玻片倾斜插入纳米金阵列液面以下，挑起玻璃片，在玻璃片上生成纳米金阵列；自然晾干后将玻璃片-纳米金阵列浸泡于盐酸多巴胺溶液中孵育，超纯水清洗后浸入缓冲液，加入抗体蛋白溶液，室温反应，再次超纯水清洗；随后浸入牛血清白蛋白溶液中进行封端，室温孵育，最终用超纯水冲洗干燥后，得到修饰抗体分子的SERS平面基底；
在SERS平面基底的制备中超纯水稀释后纳米金溶液浓度为1.0~1.5 mmol/L；在SERS平面基底的制备中所用的水不溶性有机溶剂为正己烷、环己烷、乙酸乙酯或二氯甲烷，加入的水不溶性有机溶剂与纳米金溶液体积比为1:1~1:4；在SERS平面基底的制备中加入的乙醇与纳米金溶液体积比为1:1~1:4；在SERS平面基底的制备中所用的盐酸多巴胺溶液浓度为1~20 mg/mL，盐酸多巴胺溶液中孵育时间为1~12 h；
SERS标签的制备：将含有纳米金颗粒的溶液离心，收集沉淀物并稀释到超纯水中，得到纳米金浓缩液；将拉曼报告分子溶液及牛血清白蛋白溶液依次加入分散均匀的纳米金浓缩液中，室温搅拌反应后，离心去除上清液，沉淀物用超纯水清洗数次后，将沉淀物分散于缓冲液中，得到报告分子标记的纳米金溶液；依次加入盐酸多巴胺溶液和抗体蛋白溶液，室温继续孵育后，离心去除上清液，再次用超纯水清洗沉淀物数次，最终将沉淀物分散至缓冲液中，得到修饰抗体分子的SERS标签；
在SERS标签的制备中盐酸多巴胺溶液浓度为1~20 mg/mL，盐酸多巴胺溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:2~1:10；在SERS标签的制备中蛋白抗体为目标检测物的单克隆抗体或多克隆抗体，抗体蛋白溶液浓度为10~100 μg/mL，抗体蛋白溶液与报告分子标记的纳米金溶液体积比为1:2~1:10；在SERS标签的制备中盐酸多巴胺，蛋白抗体与报告分子标记的纳米金混合液反应时间为0.5~5h。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征是：在SERS平面基底的制备中所用的蛋白抗体为目标检测物的单克隆抗体或多克隆抗体，抗体蛋白溶液浓度为10~100 μg/mL，孵育时间为1~12 h；在SERS平面基底的制备中所用的牛血清白蛋白溶液浓度为0.5%~7%（w/v），封端时间为1~3h。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征是：在SERS平面基底的制备中所用的缓冲液可为磷酸盐缓冲液，Tris-HCl 缓冲液，甘氨酸-HCl缓冲液，pH范围6.0~9.0，浓度为10~50 mmol/L。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征是：在SERS标签的制备中所用的纳米金颗粒直径为10~50nm；纳米金浓缩液浓度为0.5~10 mmol/L；在SERS标签的制备中所用的拉曼报告分子为罗丹明B，或三聚氰胺，或4-氨基苯硫酚，拉曼报告分子溶液浓度为0.5~5 mmol/L，拉曼报告分子溶液与纳米金浓缩液体积比为1:50~1:10；在SERS标签的制备中所用的牛血清白蛋白溶液为0.5%~7%（w/v），牛血清白蛋白溶液与纳米金浓缩液体积比为1:10~1:2；在SERS标签的制备中拉曼报告分子，牛血清白蛋白与纳米金混合液的搅拌反应时间为0.5~4h。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征是：在SERS标签的制备中缓冲液为磷酸盐缓冲液，Tris-HCl 缓冲液，或甘氨酸-HCl缓冲液，pH范围6.0~9.0，浓度为10~50 mmol/L。
7.如权利要求1所述的表面增强拉曼免疫分析平面传感器应用于疾病标志物分子检测。
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