JP3444630B2

JP3444630B2 - 表面増強ラマンスペクトルイムノアッセイ

Info

Publication number: JP3444630B2
Application number: JP22608493A
Authority: JP
Inventors: ピーター・ジエイ・ターシヤ; トーマス・イー・ロア; ジエイムス・ジエイ・マーカス; テレーゼ・コツトン; バーナード・ロスペンドウスキ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1992-09-11
Filing date: 1993-09-10
Publication date: 2003-09-08
Anticipated expiration: 2018-09-08
Also published as: TW240291B; CA2105782A1; DE69323459D1; GR3029912T3; ATE176727T1; EP0587008A1; JPH06174723A; KR940007533A; ES2129474T3; DE69323459T2; EP0587008B1; US5376556A; AU4625993A; US5567628A; DK0587008T3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試験混合物中の被分析
物質−媒介リガンド結合事象を観測することにより、試
験混合物中の被分析物質の存在または量を検出するため
の新規方法、組成物及びキットに関する。特に、本発明
は、試験サンプル、特異的結合メンバー、ラマン活性標
識及び表面増強（enhanced）ラマン散乱を誘発し得る表
面を有する粒子を含む試験混合物中での、表面増強ラマ
ン散乱スペクトルの違い及び変化を観測することによ
り、試験サンプル中の被分析物質の存在または量を検出
するための新規方法、組成物及びキットに関する。

【０００２】特定の分子（結合分子と称する）による他
の特異的分子（リガンドと称する）に対して示される結
合親和性は、サンプル中の特定の結合分子またはリガン
ドの量を測定するためのアッセイの基礎として通常利用
される。

【０００３】結合分子−リガンド複合体を形成する際に
関与する２個の分子は、特異的結合対とも称される。特
異的結合対の一方は、特異的結合メンバーと称される。
本発明は、検出方法として表面増強ラマン光散乱によっ
て、結合分子及びリガンドの特異的結合対を使用するア
ッセイを実施するための方法を包含する。本発明は、ア
ッセイを実施するのに使用する物質及びキットも包含す
る。

【０００４】アッセイとは、（１）サンプル中の物質の存在を検出するため、（２）サンプル中の物質を同定するため、及び/または（３）サンプル中の物質の量を測定するための方法であ
る。当業界の専門用語では、検出、同定または定量する
ためにアッセイ対象となる物質を「被分析物質：analyt
e」と呼称する。

【０００５】リガンド結合アッセイは、医療診断に特に
重要である。近代の診療に於いて、リガンド結合アッセ
イは、抗体、抗原、ホルモン、投薬、毒物（poison
s）、毒素（toxins）、違法薬（illegal drug）等の存
在を検出するために、患者の血液、尿、唾液等で日常的
に実施される。

【０００６】新規の、良好な、それ程高価でなく且つ迅
速なアッセイは、ヘルスケアのレベルを向上し得る。こ
のようなアッセイは、患者に関してより多く且つより優
れた情報を医者に提供することができ且つ穏当なコスト
で実施し得る。さらに、アッセイをより容易且つより安
価にすることにより、高レベルのヘルスケアを世界の発
展途上地域に伸展し得る。リガンド結合アッセイは、食
品、工業的生物学的方法及び生物学的研究の多くの領域
に於いて、地下水の汚染、毒素及び殺虫剤をモニターす
るのにも使用される。

【０００７】

【従来の技術】多くのアッセイでは、微量の特定の物質
（被分析物質）を、非常に多量の他の物質の存在下で検
出且つ測定しなければならない。このようなことは、結
合分子がリガンドに対して親和性が高く、他の物質の存
在に関係なく、その特定のリガンドに関して高度の結合
特異性が得られるため可能となる。最も一般的なリガン
ド結合アッセイは、イムノアッセイである。

【０００８】イムノアッセイに於いて、抗体は、抗原と
特異的に結合し、リガンドとして働く結合分子となり、
これにより特異的な結合対を形成する。抗体/抗原結合
量を測定するためには、特異的な結合対の一方を追跡可
能な物質で印をつけ、即ち標識化する。追跡可能な物質
の特徴的な性質によって、検出または測定すべきその存
在、即ち、これに結合する特異的な結合メンバーの存在
を検出または測定する。特異的な結合対の標識化部分
は、指示薬と呼称される。

【０００９】直接イムノアッセイでは、特定の結合対の
他方に結合した指示薬の量を測定する。間接イムノアッ
セイでは、被分析物質による、特異的結合対の他方に対
する指示薬の結合の阻害度を測定する。

【００１０】特異的結合対のそれぞれは、抗原または抗
体でなくてもよい。しかしながら、互いに親和性を有す
る任意の２個の分子は、特異的結合対を含み得、リガン
ド−結合アッセイの基礎を形成し得る。このような特異
的結合対の他の例としては、レクチン及びこれらが結合
する複合炭水化物、ホルモン及びそのレセプター、任意
のエフェクター分子及びそのレセプター、他の分子に特
異的に結合するように分子構造設定され且つ合成された
結合分子及び共通の親和性を有する他の分子（例えば、
アビジン及びビオチン）が挙げられる。

【００１１】２種類の一般的に使用されるイムノアッセ
イ方法としては、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び酵
素イムノアッセイ（EIA）があり、いずれも、指示薬と
して標識化特異的結合メンバーを使用する。RIAでは、
特異的結合メンバーに結合する追跡可能な物質として放
射性同位体を使用する。放射性同位体は非常に少量でも
検出可能なので、少量の被分析物質を検出または定量す
るのに使用し得る。しかしながら、RIAには実質的に多
くの欠点がある。これらの欠点としては、放射性物質の
取り扱い時に必要な特別な装置及び極度の注意、このよ
うな高価な試薬並びにその特別な廃棄条件が挙げられ
る。

【００１２】EIAでは、その基質が存在する場合、検出
可能な物質またはシグナルを齎す特異的な結合メンバー
に結合する標識として酵素を使用する。この酵素−標識
化特異的結合メンバーは指示薬として働き、その結合を
検出するのに酵素活性を利用する。EIAにはRIAが持つ欠
点の幾つかがないが、EIA方法は、検出可能な酵素反応
を誘発するために基質物質を添加しなければならない。
他の欠点としては、酵素安定性及び基質変異（turnove
r）速度は温度感受性であり、温度が上昇するにつれて
酵素安定性は低下し、基質変異速度は増加する点が挙げ
られる。

【００１３】これらのアッセイ構成（configuration）
の総てに共通の欠点は、被分析物質に結合するものと未
結合標識化試薬とを分離しなければならないということ
である。これは通常、アッセイを手動で実施するときに
は冗長な洗浄段階が必要で且つ自動化形式では込み入っ
たロボット工学が必要である。

【００１４】イムノアッセイは、自動化装置によっても
実施し得る。このような装置の例としては、本出願人か
ら市販されているTDx（商標）、IMx（商標）及びIMx SE
LECT（登録商標）アナライザーが挙げられる。これらの
装置を使用して、体液（例えば、血清、血漿及び全血）
に於いて被分析物質濃度を測定する。IMx（商標）及びI
Mx SELECT（登録商標）アナライザーは、Charles H.Kel
lerら,“The AbbottIMx（商標）及びIMx SELECT（登録
商標）システム”,J.Clin.Immunoassay,14,115,1991；
並びにM.Fioreら,“The Abbott IMx（登録商標）自動化
ベンチトップ免疫化学アナライザーシステム”,Clin.Ch
em.,34,1726,1988に記載されている。

【００１５】他の型のアッセイでは、所謂「試験片」及
び「フロースルー」方法を使用する。これらの方法を使
用して、試験サンプルを「試験片」または「フロースル
ー」装置に適用し、被分析物質の存在は、着色反応によ
り発生した視覚的に検出可能なシグナルにより表す。フ
ロースルー装置は通常、その上に層を形成したか、また
はその中に含まれるマトリックス上の捕獲部位で固定化
された試薬の付いた多孔性物質を使用する。試験サンプ
ルを装置に適用し、多孔性物質を通して流す。サンプル
中の被分析物質は、試薬と反応して多孔性物質上に検出
可能なシグナルを発生する。このような装置は、被分析
物質の存在を定量的に検出するのに有用であることが証
明された。

【００１６】近年、金属コロイド粒子を使用するアッセ
イ方法が開発された。標識すべき特異的結合部分を、吸
着により金属またはコロイド粒子上に被覆し、金属粒子
を標識とする。免疫反応によって固体支持体上にこれら
の標識化結合メンバーを局在化することにより、視覚的
に検出可能で且つ装置によって測定可能なシグナルを形
成し得る。

【００１７】蛍光及び可視染料及びスピン標識も、リガ
ンド結合アッセイで標識として使用されてる。

【００１８】これらの結合分子−リガンドアッセイは総
て、各々欠点を有する。標識化特異的結合メンバーの存
在を検出または測定する手段としてラマン光分散を使用
すると、以下に記載するようにこれらの欠点の幾つかを
避けられる。

【００１９】レイリー光分散従来より、特定の分子が、光ビーム（例えば、紫外、可
視または近赤外）によって照射されると、入射光量子の
小画分は幾つかの分子によって瞬間的に保持され、これ
らの分子の幾つかのエネルギー準位が電子の基底状態よ
りも高い振動準位に遷移することは公知であった。これ
らの高い振動準位は、仮の状態と呼称される。殆どの場
合、これらは弾性衝突であり、分子は光量子を放出する
ことによりその元の振動準位に戻る。光量子は入射光と
同一波長で全方向に放射（即ち、散乱）する。これをレ
イリー散乱と呼称する。

【００２０】ラマン光散乱 1928年、C.V.Ramanは、特定の分子に照射すると、光量
子を保持した分子のうちの少部分が、保持した光量子を
放出した後も元の振動準位に戻らず、電子の基底状態の
異なった振動準位に落ちることを発見した。従って、こ
れらの分子から放出された放射エネルギーは、異なるエ
ネルギー且つ異なる波長にある。これをラマン散乱と呼
称する。

【００２１】分子が電子の基底状態の高い振動準位に落
ちると、放出された光量子は、吸収したところよりも低
いエネルギー即ち長波長にある。これはストークス−シ
フトラマン散乱と呼称される。分子が光量子を吸収する
前に既に高い振動準位にあるとき、放出された光量子に
この過剰のエネルギーを付与し得るので、基底状態に戻
る。この場合、放出されたエネルギーは、高エネルギー
（且つ短波長）であり、反ストークス−シフトラマン散
乱と呼称される。通常条件下、任意のセットの分子に於
いて、基底状態の分子数は、常に励起状態の分子よりも
かなり多いので、励起分子と相互作用し且つ衝突時に持
っていた以上のエネルギーをもって散乱した光量子の確
率（odds）は非常に小さい。従って、入射光量子よりも
高い波長で散乱する光量子（反ストークス波長）は、入
射光量子よりも低い波長で散乱する光量子（ストークス
波長）に対して少ない。従って、通常分析されるのはス
トークス波長である。

【００２２】このようにして分子に対して損失したエネ
ルギー、即ちこれから得られたエネルギー量を量子化す
ると、不連続の波長シフトを持つ分散した光量子が得ら
れる。これらの波長シフトは、分光計により測定し得
る。ラマン散乱とは、特定の分子を識別するための分析
手法及び、分子構造を研究する手段として有用であると
考えられる。しかしながら、他の方法、例えば、赤外分
光法ほどではない。

【００２３】共鳴ラマン散乱ラマン分光法に於ける重要性は、光源としてレーザーを
使用することにより更新された。その強力な干渉光は、
ラマン分光法の感度の欠点の幾つかを克服した。さら
に、入射光の波長が分子の最大吸収波長またはその近く
であると、分子内に電子並びに振動遷移が生じ、共鳴ラ
マン散乱を観察し得ることが知見された。共鳴ラマン散
乱を使用すると、再放出された光量子は、ラマン散乱に
付随した振動エネルギーに違いを示す。しかしながら、
共鳴ラマン散乱を使用すると、電子振動吸収は約1000倍
も効率が高くなる。共鳴ラマン散乱からの増加シグナル
を使用しても、分析手法としてのその有用性は、まだ比
較的弱いシグナルのため限定されていた。しかしなが
ら、近年、表面増強効果が発見され、ラマン散乱強度を
さらに飛躍的に増強する手段が提供された。

【００２４】表面増強ラマン散乱分子を特定の金属表面に非常に近接（しかし、必ずしも
接触しない）させると、ラマン光散乱の強度が非常に増
加することが知見され得る。金属表面は、微細金属粒子
で“荒くする：roughened”か、または被覆しなければ
ならない。金属コロイドも、このシグナル増強効果を示
す。強度は数百万倍以上のオーダーに増加し得る。1974
年、Dr.Richard P.Van Duyneは、この効果を特徴的な現
象として最初に認識し、「表面増強ラマン散乱」（SER
S）という用語を作り出した。

【００２５】SERS効果の理由は完全には理解されていな
い。しかしながら、現在、少なくとも２つの別個の事実
がSERSに寄与すると考えられている。第１に、金属表面
は微細なでこぼこを含む。これらのでこぼこは、球体
（コロイドに於いては、回転楕円体であるかそれに近
い）として考えられる。入射光の波長の約1/10の直径の
これらの粒子が、最も効果的であると考えられる。入射
光量子は、金属の、非常に移動性電子を持つ粒子を介し
て電場を誘導する。

【００２６】金属表面または粒子の特定の形状に於いて
は、表面電子群は、印加された（applied）振動電磁場
に対して集合状態（collective fashion）で振動するよ
うに作成し得る。このような集合的振動電子群は、「プ
ラズモン：plasmon」と呼称される。入射光量子は、こ
の振動電磁場を供給する。入射光による分子中の振動双
極子モーメントの誘導は、ラマン散乱源である。表面プ
ラズモンの共鳴振動効果は、金属表面の近隣に於ける電
磁場強度を大きく増加させる。これにより双極子の振動
が増加して、分子の分散を誘発し、ラマン散乱光の強度
が増加する。この効果により、粒子近隣の入射光の強度
も見掛け上増加する。

【００２７】SERS効果に寄与すると考えられる第２の因
子は、分子イメージンングである。金属表面に非常に近
接した双極子モーメントを持つ分子は、反対の極性（即
ち、プラズモン上の影双極子）の表面上にそのイメージ
を誘導する。そのイメージが近接しているので、分子の
力を増加させて光を散乱させると考えられる。他方、表
面プラズモンに対して誘導または歪んだ双極子モーメン
トを持つ分子のこのカップリングは、励起の確率を非常
に高める。この結果、表面吸収分子により散乱されたラ
マン光の効率が非常に高まる。

【００２８】SERS効果は、共鳴ラマン効果と組み合わせ
ることにより増強し得る。表面増強ラマン散乱効果は、
励起光の波長が放射される分子の主要吸収帯と共鳴する
と、より強力になる。得られた表面増強共鳴ラマン散乱
（Surface Enhanced Resonance Raman Scattering；SER
RS）効果は、７桁以上大きいラマン散乱シグナル強度に
増強し得る。

【００２９】イムノアッセイへのSERSの適用 SERS効果は、分子表面構造及び動力学を研究するため
に、物理及び分析化学者により用いられて電極表面上で
化学反応を実施する。近年、ラマン活性補欠分子団（pr
ostheic groups）（例えば、ヘム）を含む生物学的分子
にも適用されている。

【００３０】今日まで、免疫診断に対してはSERS法は適
用されなかった。

【００３１】免疫診断に於いてこの方法を使用すると、
幾つかの特徴的な長所が得られる。SERSシグナルは好適
な表面の近接会合に強く依存するので、SERS活性表面上
または近くで固定化したこれらのリポーター分子のみが
強いシグナルに寄与し、溶液中に残ったシグナルの寄与
は無視し得る。異なる環境または異なる配向で結合した
分子は、異なるラマン分散特性を示し得る。

【００３２】

【発明の概要】本発明の一態様によれば、試験混合物
中、被分析物質、特異的結合メンバー、ラマン活性標識
及び、表面増強ラマン光散乱を誘発し得る表面を持つこ
とを特徴とする粒子の間に複合体を形成させることによ
り、試験サンプル、特異的結合メンバー、ラマン活性標
識及び粒子を含む試験混合物中の被分析物質−媒介リガ
ンド結合事象を観測し；複合体中のラマン活性標識に検
出可能なラマンスペクトルを生むのに十分な放射エネル
ギーを試験混合物に照射し；次いで、測定した表面増強
ラマン分散スペクトル中の、試験混合物中に存在する被
分析物質の量に依存する違いを観測することにより被分
析物質の存在または量をアッセイまたは測定する方法を
提供する。

【００３３】本発明のもう一つの態様では、試験サンプ
ル、特異的結合メンバーにより識別される被分析物質エ
ピトープを発現する被分析物質類似体分子を含み、媒介
分子を介して直接または間接的にラマン活性標識につな
がり、次いで粒子上の特異的な結合メンバーに標識化被
分析物質類似体を結合させる標識化被分析物質類似体で
あって、粒子上の特異的な結合メンバーへの標識化被分
析物質類似体の結合量は被分析物質の存在により影響さ
れる、標識化被分析物質類似体、及び表面増強ラマン光
散乱を誘発し得る表面を持つ粒子上に固定化された特異
的結合メンバーを含む粒状捕獲試薬を含む試験混合物を
形成することにより試験混合物中の被分析物質−媒介リ
ガンド結合事象を観測し；次いで試験混合物中の結合し
た標識化被分析物質類似体上のラマン活性標識に検出可
能なラマンスペクトルを生むのに十分な放射エネルギー
を試験混合物に照射し；次いで、試験混合物中に存在す
る被分析物質の量に依存する、検出した表面増強ラマン
散乱スペクトルに於ける違いを観測することにより試験
サンプル中の被分析物質の存在または量をアッセイまた
は測定する方法を提供する。

【００３４】本発明のもう一つの態様では、試験混合物
中の被分析物質−媒介リガンド結合事象を観測すること
により、試験サンプル中の被分析物質の存在または量を
アッセイまたは測定するための方法であって、表面増強
ラマン光散乱を誘導し得る表面及び、ラマン活性標識も
有する粒子に接合した特異的結合メンバーを含む粒子状
捕獲試薬と被分析物質を含む試験サンプルから試験混合
物を形成し；次いで被分析物質に結合し得且つ捕獲部位
に固定化された捕獲試薬を含む、近位端及び遠位端を持
つクロマトグラフィー物質上に試験混合物を載置し；次
いでキャピラリー作用により近位端から遠位端へ試験混
合物を移動させ；次いで検出可能なラマンスペクトルを
生むのに十分な放射エネルギーを捕獲部位に照射し；次
いで試験混合物中に存在する被分析物質の量に依存す
る、検出した表面増強ラマン散乱スペクトルに於ける違
いを観測する該方法を提供する。

【００３５】本発明のさらにもう一つの態様では、表面
増強ラマン光散乱を誘発し得る表面を持ち且つラマン活
性標識で標識した粒子を含む、試験混合物中の被分析物
質−媒介リガンド結合事象を観測することにより、試験
サンプル中の被分析物質の存在または量を測定するのに
使用すべき組成物を提供する。

【００３６】本発明のもう一つの態様では、試験混合物
中の被分析物質−媒介リガンド結合事象を観測すること
により、試験サンプル中の被分析物質の存在または量を
測定するためのキットであって、ラマン活性標識；表面
増強ラマン光散乱を誘発し得る表面を持つ粒子；及び被
分析物質用の特異的結合メンバーを含む該キットを提供
する。

【００３７】

【好ましい態様の説明】上記の如く、本発明は、試験サ
ンプル、特異的結合メンバー、ラマン活性標識及び、表
面増強ラマン光散乱を誘導し得る表面を持つ粒子を含
む、試験混合物の表面増強ラマン散乱スペクトルに於け
る違い及び変化を観測することによる、試験サンプル中
の被分析物質の存在または量を検出するためのアッセイ
方法、組成物及びキットを包含する。分散した粒子状混
合物中に被分析物質が存在すると、混合物から得られる
ラマンスペクトルに影響すると考えられる。

【００３８】本発明の種々の態様の記載に進む前に、多
くの用語を定義する。

【００３９】定義本明細書中で使用する「被分析物質：Analyte」という
用語は、本発明によって試験サンプル中で検出される物
質である。被分析物質は、天然に存在する特異的結合メ
ンバー（例えば、抗体）または特異的結合メンバーを製
造し得る任意の物質であり得、被分析物質はアッセイ中
で１つ以上の特異的結合メンバーと結合し得る。「被分
析物質」は、任意の抗原物質、ハプテン、抗体及びその
組み合わせも含む。被分析物質としては、蛋白質、ペプ
チド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビ
タミン、診療目的で投与したもの並びに違法目的（illi
cit purposes）で投与したものを含む薬剤、微生物、ウ
イルス及び上記任意物質に対する抗体または代謝物質を
含み得る。

【００４０】本明細書中で使用する「被分析物質類似
体」という用語は、被分析物質特異的結合メンバーと交
差反応する物質を指すが、被分析物質に比べその交差反
応性は大きくても小さくてもよい。被分析物質類似体
は、被分析物質類似体が当該類似体と共通の少なくとも
１つのエピトープ部位を持つ限り、改質被分析物質並び
に被分析物質分子のフラグメント化または合成部分を含
み得る。

【００４１】本明細書中で使用する「被分析物質エピト
ープ」という用語は、特異的結合事象時に、特異的リガ
ンド結合対の一方と接触する被分析物質の一部を指す。
特異的結合事象時に被分析物質のエピトープと接触する
特異的な結合対の一方のその部分は、「パラトープ：pa
ratope」と呼称される。

【００４２】本明細書中で使用する「被分析物質−媒介
リガンド結合事象」という用語は、結合量が被分析物質
の存在及び量により影響される、特異的リガンド結合対
の双方間の特異的結合事象を指す。この影響は通常、被
分析物質が構造、または構造と似ているか同一のエピト
ープ、若しくは特異的リガンド結合対の一方により含ま
れるエピトープを含むため、特異的結合事象で特異的リ
ガンド結合対の他方によりその識別がなされる。結果と
して、被分析物質は、特に特異的リガンド結合対の一方
に結合し、これにより、特異的リガンド結合対の他方に
結合することはなくなる。

【００４３】本明細書中で使用する「補助的な特異的結
合メンバー」という用語は、捕獲試薬及び指示薬の特異
的結合以外に使用される特異的結合メンバーであり、最
終結合複合体の一部となる。１つ以上の補助的な特異的
結合メンバーは、アッセイで使用し得る。例えば、補助
的な特異的結合メンバーは、指示薬が補助的な特異的結
合メンバーに結合し、引き続き被分析物質に結合し得る
アッセイで使用し得る。

【００４４】「凝集：agglutination」は、液体中に懸
濁した粒子が固まりに集まる反応を意味する。

【００４５】本明細書中で使用する「会合した：associ
ated」とは、２個以上の分子及び/または粒子の状態が
互いに近接保持されている事を意味する。

【００４６】本明細書中で使用する「捕獲試薬：captur
e reagent」とは、実質的に固体の物質に直接または間
接的につなぎ得る、被分析物質または指示薬と結合し得
る特異的結合メンバーである。固相捕獲試薬複合体は、
アッセイの結合及び非結合成分を分離するために使用し
得る。

【００４７】本明細書中で使用する「コンジュゲート：
conjugate」とは、一方の部分と他方が化学結合するこ
とにより形成した物質を指す。このような種の例として
は、ウシ血清アルブミンと化学的に活性化したテオフィ
リン分子の反応生成物及び、化学的に活性化したラマン
活性標識と、蛋白質分子（例えば、抗体）またはリガン
ド（例えば、ビオチン）との反応生成物が挙げられる。

【００４８】本明細書中で使用する「エンハンサー：en
hancer」とは、試験混合物中に存在するとき、溶液また
は懸濁液中の粒子または溶解性物質の中の結合（bindin
g）、会合（association）または凝集を助ける任意の物
質である。エンハンサーは、液体媒質のpH、イオン性、
溶媒または凝集特性を変化させることによってまたは他
の機構により作用する。エンハンサーの例としては；
塩、例えば、塩化ナトリウム；所望のpHを保持するため
に働く任意の型の緩衝液；糖；及びポリマー、例えば、
ポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定
されない。

【００４９】本明細書中で使用する「指示薬」は、特異
的結合メンバーまたは金属表面に直接または間接的につ
いた検出可能な標識を含む。

【００５０】本明細書中で使用する「媒介分子：interv
ening molecule」とは、特異的結合対部位及びラマン活
性標識の両方がついている任意の物質である。

【００５１】本明細書中で使用する「粒子」とは、液体
中に分散可能で、且つ表面増強ラマン光散乱（SERS）ま
たは表面増強共鳴ラマン光散乱（SERRS）の現象を支持
する任意の物質である。粒子の例としては、金若しくは
銀のコロイド；金、銀、銅、若しくは伝導帯電子（cond
uctance band electrons）を示す任意の物質の粒子また
はフレークが挙げられるが、これらに限定されない。粒
子表面はSERS及びSERRS効果と関連するので、伝導帯電
子を示す物質で被覆した伝導帯電子を示さない物質のフ
レークまたは粒子も好適な粒子となる。

【００５２】本明細書中で使用する「放射エネルギー：
radiation」という用語は、試験混合物に適用すると、
その中のラマン活性標識によりラマンスペクトルを発生
させ、且つ粒子表面と会合した金属表面もラマン活性標
識により表面増強ラマン光散乱させる、電磁波の形のエ
ネルギーである。

【００５３】本明細書中で使用する「ラマン活性標識」
という用語は、適当な波長の放射エネルギーを照射する
とき、存在する他の成分のラマンスペクトルと識別可能
な検出可能でラマンスペクトルを出す任意の物質を指
す。ラマン活性標識の他の用語としては、染料及びリポ
ーター分子を含む。

【００５４】SERS活性表面で吸着質がレーザー励起波長
と共鳴状態にあるとき、「SERRS（表面増強共鳴ラマン
散乱）」が起きる。共鳴及び表面増強の結果、散乱が増
強される。

【００５５】「SERS（表面増強ラマン散乱）」は、特定
の金属表面の近隣の特定の分子により示されるラマン散
乱に於ける増加を意味する。

【００５６】本明細書中で使用する「特異的結合メンバ
ー（specific binding member）」とは、特異的結合対
の一員、即ち、分子の一方が、化学的または物理的手段
により第２の分子に特異的に結合する２個の異なる分子
である。抗原及び抗体−特異的結合対以外に、他の特異
的結合対としては、ビオチン及びアビジン、炭水化物及
びレクチン、相補的ヌクレオチド配列（ターゲット核酸
配列を検出するためのDNAハイブリダイゼーションアッ
セイで使用するプローブと捕獲された核酸配列とを含
む）、相補的ペプチド配列、エフェクター及びレセプタ
ー分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害剤及び酵素等が
挙げられる。さらに、特異的結合対としては、元の特異
的結合メンバーの類似体であるものも含み得る。例え
ば、被分析物質の誘導体またはフラグメント、即ち、被
分析物質類似体は、被分析物質と共通の少なくとも１個
のエピトープを持つ限り使用し得る。免疫反応性特異的
結合メンバーとしては、抗原、ハプテン、抗体及びその
複合体（組換えDNA法またはペプチド合成により形成し
たものを含む）が挙げられる。

【００５７】本明細書中で使用する「安定剤」とは、添
加剤として、懸濁液中では粒子が会合する傾向を下げる
ように働く粒子（コロイドを含む）と一緒に使用する物
質である。安定剤の典型例としては、Tween 20、Brij 3
5、Triton-X 100、ポリエチレングリコール及びウシ血
清アルブミンが挙げられる。

【００５８】本明細書中で使用する「試験混合物」と
は、試験サンプル中の被分析物質を検出するために本発
明に適用するために使用する試験サンプルと他の物質と
の混合物を指す。これらの物質の例としては、特異的結
合メンバー、補助的な結合メンバー、被分析物質類似
体、ラマン活性標識、緩衝液、希釈液及び表面活性ラマ
ンスペクトルを発生し得る表面を持つ粒子等が挙げられ
る。

【００５９】本明細書中で使用する「試験サンプル」と
は、本発明を用いて検出及びアッセイすべき被分析物質
を含むサンプルを指す。試験サンプルは被分析物質以外
に他の成分を含み得、液体、または固体の物理的特質を
持ち得、任意の大きさまたは容積（例えば、液体の移動
流を含む）であり得る。試験サンプルは、他の物質が特
異的結合メンバーの特異的結合または被分析物質若しく
は被分析物質類似体を干渉しない限り、被分析物質以外
の任意の物質を含み得る。試験サンプルの例としては、
血清、血漿、唾液、精液、尿、他の体液及び環境サンプ
ル、例えば、地下水若しくは廃水、土壌抽出物及び殺虫
剤残渣を含むが、これらに限定されない。

【００６０】略語 HABA．2-［4-ヒドロキシフェニルアゾ］安息香酸． DAB．p-ジメチルアミノアゾベンゼン． IgG．免疫グロブリンＧ． HTSH．ヒト甲状腺刺激ホルモン． PBS．リン酸塩で緩衝させた生理食塩水． BSA．ウシ血清アルブミン． TNBSA．2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸． DAB-ITC．4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-イソチオ
シアナート． DMF．ジメチルホルムアミド． I.U．国際単位．ビオチン−BSA−DAB ビオチニル化ウシ血清アルブミン
と4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-イソチオシアナー
トとのコンジュゲート． DNP ジニトロフェニル． DNP−BSA ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン． DNB ジニトロベンゼン．

【００６１】もう一つの好ましい態様１．表面多くの金属物質及び形態を、SERS活性表面のために使用
し得る。これらの物質（例えば、銀、金、銅、プラチナ
等）は、平坦な表面（電極、ストリップ、スライド等）
若しくは粒子（例えば、分散したコロイド、粒子、液
滴、即ち水銀）、フレーク、または他の比較的小さい個
々の構造体とするか、あるいはシリカ、プラスチック、
ガラス、紙若しくは巨視的には平坦若しくは織（textur
ed）構造（裁断した、腐食させた、凹みをつけた若しく
は成形した）片、スライド、ストリップ若しくは球体な
どの他の物質、または上記のラマン散乱の表面増強を支
持するように活性物質（例えば、銀、金等）で被覆した
繊維の形であってもよい、金属のための不活性支持構造
体の形状を取り得た。増強できる表面または層は、特異
的な結合メンバーがついた別の１種の物質（シリカ、プ
ラスチック、酸化物など）で被覆し得る。

【００６２】光励起可能な表面プラズモンの存在は、通
常、表面増強に必要であると考えられる。表面に強力な
SERS効果を与えるためには、その表面プラズモンは、そ
の内在エネルギーが分散しないように局在化しなければ
ならない。これは、導電性金属（通常、銀または金）を
小さな粒子に分割することにより達成し得る。実際に
は、金属の固体片の表面を電気化学的に「粗面化」し得
る。以下の実施例に示すように、銀粒子は、溶液から支
持体に沈積し得るか、銀は、蒸発若しくはスパッタコー
ティングにより支持体上に沈積し得る。銀被覆したレプ
リカ格子（grating）は、衝撃若しくは杭で荒くし、ま
たは球体で被覆し、次いで銀で被覆した銀被覆表面と同
様に強いSERS増強が可能である。

【００６３】本発明に特に合致したSER（R）Sベースの
アッセイに都合のよい表面は、金属コロイド形の粒子で
ある。金属コロイドは、非常に強力なSER（R）S活性
と、容易に取り扱い得る液体媒質の長所を持ち合わせて
いる。SER（R）Sの読取とコロイド試薬を組み合わせる
と、現在の臨床化学分析で使用するのと同様の方法でア
ッセイを実施することができる。

【００６４】本発明で使用する金属コロイドは、元素状
の銀または金から構成されているが、これらの金属に限
定されない。例えば、銅やその他の金属から構成されて
いるコロイドも、SERS及びSERRS効果を提供することが
公知である。金属の分散液は、所与の金属の希釈塩溶液
を還元することにより製造し得る。種々の還元剤、例え
ば、アスコルベート、シトレート、水素化ホウ素または
水素ガスを使用し得る。製造法は、得られたSERSまたは
SERRSスペクトルの様相及び強度に影響し得る。しかし
ながら、これは本発明を限定する因子ではない。従っ
て、実施例２０は、シトレート還元及び水素ガス還元に
より製造したコロイドの別個のサンプルに吸着させた２
種類のラマン活性標識、即ち染料メチレンブルー及びオ
キサジン725の20：1混合物のSERRSスペクトルによれ
ば、粒子及びスペクトルが異なっていても使用し得るこ
とを示している。

【００６５】通常、これらの還元法で製造したコロイド
は、特に、還元剤を除去するか、還元剤が低濃度である
場合、還元剤及びその酸化副生成物、特に酸化金属アニ
オン由来のアニオンに由来する負に帯電した表面を持っ
ている。これらの場合にコロイドの安定化機構は、静電
的であると考えられる。このような機構の詳細は、Paul
C．Hiemenz，Principles of Colloid and Surface Che
mistry，Marcel Dekker，1977，第９〜11章に適切に記
載されている。懸濁液中のコロイド粒子の安定化の他の
機構は、立体安定化（steric stabilization）と呼称さ
れている。立体安定化は、安定化部分が帯電していない
という点で静電的安定化（electrostatic stabilizatio
n）とは区別される。これらの部分は、殆ど通常、本質
的にポリマー性であり、分散液の連続（即ち、溶媒）相
に少なくとも膨潤可能であるかまたは溶解性である。こ
の場合、「ポリマー性」という用語は、合成ポリマー分
子（例えば、ポリスチレン若しくはポリエチレンオキシ
ド）、または天然高分子（例えば、蛋白質、ポリペプチ
ド若しくは炭水化物）を指す。実際には、安定化部分
は、コロイド粒子の表面に結合している。この機構の簡
単には、その表面についた溶解性安定化部分を持つ２個
の粒子に関して説明できる。この２個の粒子が互いに接
近すると、安定化剤濃度は、その分離距離の関数として
２個の粒子の間の領域で増加する。これにより、この領
域に於ける溶解性鎖の配列の度合いが増加する。これら
の出来事は、浸透圧及びエントロピー的観点から好まし
くなく、従って、これらの作用を克服し得る力がないと
粒子を合体または会合させる傾向が低下する。構造安定
化の有効性を低下できた力の例としては、熱が挙げら
れ、これにより粒子の動力学エネルギーが増加し、安定
化部分を懸濁媒質中にそれほど溶解性でないようにでき
た。ポリエチレンオキシドが水中に懸濁したコロイド粒
子に固定した安定化部分である場合、この一例が発生す
る。温度を室温から50〜70℃に上昇させると、安定剤の
溶解性は低下し、従ってその有効性も低下する。混和性
非-溶媒懸濁液を添加すると、同様の非-安定化効果が得
られる。構造安定化は、安定剤の溶解特性に大きく作用
しない限り、通常、連続相のイオン強度に敏感でない。
立体安定化の原理は、Donald H.Napper,“Steric Stabi
lization,”J.Colloid Interface Sci.,58,390 1977に
より適切に記載されている。

【００６６】コロイド粒子の安定化の第３の機構は、空
乏（depletion）安定化である。この方法は、溶解性安
定化部分も使用するが、これらは、コロイド粒子の表面
にある必要がない。この種の安定化は、非イオン性ポリ
マーを分散媒質中に溶解させるだけで実施し得る。これ
らが非常に近接していると、粒子の表面間の遊離ポリマ
ー種の濃度の空乏から安定化が生じる。この方法は、Ro
bert I.Feign及びDonald H.Napper,“Depletion Stabil
ization and Depletion Flocculation,”J.Colloid Int
erface Sci.,75,525,1980に適切に記載されている。

【００６７】本質的にコロイドである粒子は、本発明で
使用するのに最も好ましい。これらのコロイド粒子は、
各々の安定化機構によりそれぞれ異なった影響を受け
る。例えば、本発明は、構成成分として、ラマン活性標
識に接合するか、または会合する、「染料またはリポー
ター分子」とも参照される金属コロイドを使用し得る。
これらの標識は、簡単な疎水性吸着または化学吸着によ
り金属につけることができ、これにより、標識上の特異
的な官能基への金属の特異的な化学的相互作用が起き
る。金属に対する化学吸着の一例としては、銀−硫黄化
学吸着結合を形成する銀表面へのチオール基の相互作用
がある。還元条件下で合成した金属コロイドでは、ジス
ルフィド部分をコロイドに添加可能であり、多くは金属
表面で還元されてチオールを形成し、これが金属表面で
化学吸着される。アミノ基も、特定の金属表面上に親和
性を有し得るが、チオールよりも弱い相互作用であると
通常考えられている。標識を負に帯電した金属コロイド
に添加すると、この標識が反対の電荷の基（例えば、ア
ミノ基）を含んでいると、電荷の中和が起きてコロイド
が凝集する。これらの場合、分散媒質に安定剤を添加す
るのが望ましく、これが粒子に付着して、立体安定化を
提供できたり、溶液中で独立したままなので、空乏安定
化となり得る。これらの安定化段階は通常、イオン効果
に対して感受性ではない。実際、市販の非イオン安定剤
（例えば、Tween 20若しくはBrij 35）または天然の安
定剤（例えば、アルブミン、γ-グロブリン若しくはイ
ムノアッセイで特異的な結合成分としても作用し得る特
異的なγ-グロブリン）は、ラマン活性標識または染料
の添加前に添加し得る。

【００６８】P.K.Aravind、A.Nitzan及びH.MetiuらのSu
rface Sci.,110，189，1981の計算では、短い距離で隔
てられている２個の小さな（レイリー限界）球体に関す
る励起スペクトル及び局部電界（local field）は、単
球としての挙動の明らかな重複とは非常に異なることを
示している。新しい共鳴は単球の場合よりも低い周波数
に現れ、球の間の局部電界の二乗は銀の場合、単球より
も一桁は大きい範囲である。H.Metiuの“Surface Enhan
ced Spectroscopy”,Progress in Surface Science,vo
l.17,pp.153-320,1984の総説では、その238ページにこ
の場合、放射増強は10倍増加すると考えられており、２
個の銀球の間に配置された分子の増強ラマンスペクトル
は、単球付近に配置された分子よりも100倍以上であっ
たことを記載している。H.Metiuは、粒子の凝集は、コ
ロイド系の電気力学的挙動を根本的に変更し得、単球理
論の実証を志す測定では避けるべきであると指摘してい
る。

【００６９】本研究に於いて、特異的結合メンバーと会
合した金属コロイドの表面の近くに配置された、即ちこ
れに会合したラマン活性標識のSERRSスペクトルは、そ
の相補的特異的結合メンバーを添加することにより影響
を受けた。従って、以下のアッセイ実施例に於いて記載
されているような懸濁液の電気力学的挙動が、染料標識
のSERRS挙動により検出可能な方法で変化することは推
測し得る。これは、コロイド表面で固定化されるその結
合部分と被分析物質との相互作用により加減されたコロ
イド粒子の会合によるものであろう。

【００７０】２．SERS−活性表面への特異的結合メンバ
ーの接続直接吸着、媒介分子若しくはリンカーアームを介する接
続、特異的結合メンバーへの共有結合的接続により、ま
たは直接若しくはリンカーアームを介してSERS−活性表
面上に被覆された特異的結合メンバーの共有結合的接続
により、若しくはリンカーアームの遠位部分の増強表面
への挿入により、SERS−活性表面に特異的結合メンバー
を接続し得る。

【００７１】３．ラマン活性標識ラマン活性標識は、特有のラマン散乱パターンを有する
多くの分子であれば、いずれでもよい。酵素イムノアッ
セイで使用する酵素と異なり、これらの標識種は、必要
により化学的に修飾し得る安定で、簡易で、安価な分子
であり得る。

【００７２】以下の特徴は、この適用に於ける標識の効
率を高める。（ａ）レーザー励起波長の近傍にある強い吸収帯（励起
係数は10４に近い）であること；（ｂ）特異的な結合メンバーに共有結合し得る官能基で
あること；（ｃ）光安定性であること；（ｄ）十分な表面及び共鳴増強により、サブナノグラム
範囲の検出限界を有すること；（ｅ）標識化特異的結合メンバーと未標識化特異的結合
メンバーとの間の結合相互作用の干渉が最小であるこ
と；（ｆ）使用した励起−波長での強い蛍光放射が最小であ
ること；（ｇ）幾つかの強いピークを伴う比較的簡単な散乱パタ
ーンであること；及び/または（ｆ）散乱パターンを持つ標識が互いに干渉せず、幾つ
かの指示分子を同時に分析し得ること。

【００７３】以下の、4-（4-アミノフェニルアゾ）フェ
ニルアルソン酸一ナトリウム塩、アルセンアゾ I、塩基
性フクシン、シカゴスカイブルー、ダイレクトレッド8
1、ディスパーズオレンジ３、HABA（2-(4-ヒドロキシフ
ェニルアゾ）-安息香酸）、エリトロシンＢ、トリパン
ブルー、ポンソーＳ、ポンソーSS、1,5-ジフルオロ-2,4
-ジニトロベンゼン、クレシルバイオレット及びp-ジメ
チルアミノアゾベンゼンなどが列挙されるが、これらが
ラマン活性標識の有能な候補の総てではない。選択した
標識は、当該特異的結合メンバーに共有結合的に接続す
るか、または付着若しくは会合し得る。

【００７４】４．励起源好ましい態様に於いて、レーザーは励起源として作用す
る。レーザーは、安価な型（例えば、ヘリウム−ネオン
またはダイオードレーザー）であってもよい。このよう
なレーザーの使用寿命は50,000時間以上であり得る。

【００７５】一態様に於いて、ダイオードレーザーを使
用して、IRスペクトルまたは近IRスペクトルで励起し、
蛍光干渉を最小とする。使用した励起源は、必ずしも単
色光である必要はなく、高強度である必要もない。ラン
プも使用し得る。

【００７６】SERS効果は、表面の直接放射により、また
はプラズモン−活性表面の下の導波管から消失（evansc
ent）波長により励起され得る。

【００７７】５．コンジュゲート数種の異なるコンジュゲートを、種々の特性を持つ特異
的結合メンバーから製造でき、異なるラマン活性標識を
持つその各々は、別個の散乱パターンを持つ。これらの
接合をアッセイで混合すると、同一サンプル中にある数
種の異なる被分析物質を同時分析できる。

【００７８】６．検出ラマン散乱を検出するには、数種の方法を使用し得る。
これらは通常、種々の型の分光計を用い得る。SERSに於
いて、基本装置は、特定の波長に於ける光散乱強度を測
定するものである。SERSは、励起ビーム由来の強いバッ
クグラウンドの存在下で、波長がずれた散乱の強度を測
定しなくてはならない。ストークスシフトの大きいラマ
ン活性物質を使用すると、この測定が容易である。

【００７９】読取装置をさらに簡易化するための幾つか
の概念が提案された。これらの例としては、波長選択的
ミラー、フィルタまたは散乱した光を集めるためのホロ
グラフ光学素子を使用することも包含する。

【００８０】SERSを使用すると、表面への入射光ビーム
の角度も検出器の位置も重要ではない。通常は、垂直に
対し60°にレーザービームが入射する平坦な表面を使用
して実施されており、ビームに対して90°か180°での
検出が標準である。SERS励起は、近赤外領域で実施可能
であり、これによりサンプル固有の蛍光をカットする。
光学導波管により得た消失波を使用するSERS-ベースの
リガンド結合アッセイを実施することも可能である。

【００８１】照射時に読取が直ちに開始するので、シグ
ナルの発生（develpoment）時間は必要なく、励起光が
非常に強力で化学的変化が起きない限り、シグナルの遅
延なく所望の間、データを収集し得る。シグナルは、光
学吸収に依存する系に於いては重複できない。蛍光読取
系と異なり、SERSリポーター基は、自己−消光（self-q
uench）ではないので、シグナルは、プローブ分子上の
ラマンリポーター基数を増加させることにより増強し得
る。SERS−活性表面近くの蛍光分子は、実際に表面消光
される。

【００８２】７．数量構成本発明は自動分析器に適用きる。本装置は別個のストー
クス−シフトスペクトル線を観測するので、精巧な単色
系の必要はない。光学技術に於ける近年の進歩（例え
ば、ホログラフ光学素子）により、研究室グレードの装
置よりも安価なコスト及びより簡素で好適な分光計の設
計が可能である。

【００８３】SERSの結果として光学読取エネルギーは、
超高感受性光量子計数装置を必要とする。実際、現在使
用されている数種のSERRS分光計は、シリコンフォトダ
イオード検出器を含む。研究室グレードの分光計で使用
されている典型的な単色光の光学効率（optical effien
cy）は、10%未満である。上記した光学物質及び成分の
進歩により、幾つかの特異的スペクトル線のみを測る簡
単な分光器の光学効率を２〜３倍増加し得る。これは、
先の主要な問題の一つ、レイリー散乱線の遮蔽にも関す
る。10−９のオーダーの遮蔽能力の新しいフィルター
を、典型的な単色光系の１段階以上のフィルタの代わり
にすると、かなりコストを削減できる。

【００８４】８．分析用装置クロマトグラフ結合アッセイにより試験サンプル中の被
分析物質を分析する通常技術は、従来公知である。例え
ば、Deutschらは、クロマトグラフ試験ストリップ装置
について米国特許第4,094,647号、同第4,235,601号及び
同第4,361,537号に記載している。これらの文献は、本
明細書中参照として含まれる。Deutschらの装置に対す
る変形は、米国特許第4,366,241号及び同第4,186,146号
に記載されている。Zukら、“Enzyme Immunochromatogr
aphy，A quantitative Imunoassay Requiring No Instr
umentation”,Clin.Chem.，31，1144，1985は、アッセ
イ原理についてさらに記載している。米国特許第4,298,
688号、同第4,517,288号、同第4,740,468号及び同第4,3
66,241号、欧州特許第88,636号、同第259,157号及び同
第267,006号も重要である。

【００８５】

【実施例】実施例１銀表面の製造支持体表面 −銀フィルム用の支持体は、顕微鏡スライド
から切り出した平坦なつや消ししたガラス片または４イ
ンチ×４インチ×20ミルの水晶基材（GeneralElectric
Type 124）から切り出した水晶片であった。

【００８６】化学的沈着−Ni及びCotton（Anal.Chem.，
58，3159，1986）により既に記載された硝酸銀を化学還
元することにより支持体表面に銀を沈着させた。Tollen
試薬を使用して銀を沈着させた。Tollen試薬は、小さな
ビーカー中、10mL ２〜３%AgNO３溶液に新しい５%NaOH
溶液を約10滴添加することにより製造したもので、濃茶
色のAgOH沈澱が形成した。この段階の次に、濃NH４OHを
滴下添加すると、この時点で沈澱が再溶解した。透明な
Tollen試薬を含むビーカーを氷浴中に設置した。予め硝
酸及び蒸留水で洗浄したつや消ししたスライドを15枚ま
で入れられるテフロン製枠に設置し、Tollen試薬中に入
れた。10% Ｄ-グルコース３mlを、確実に混じるように
注意深く渦巻かせながら添加した。ついでビーカーを氷
浴から外し、室温に放温させた。ビーカーを水浴（55
℃）に１分間設置し、次いで１分間超音波処理（Branso
n Sonicator,Model B22-4,125W）した。最終的に、銀−
被覆したスライドを蒸留水で数回洗浄し、再び蒸留水中
で30秒間超音波処理した。次いでスライドを吸着質溶液
に暴露する前、数時間蒸留水中に保存した。この方法を
使用することにより、スライドは蒸留水中で１週間まで
安定であることが知見された。

【００８７】表面は透過光では黄色であり、走査電子顕
微鏡により荒く、粒状であることが知見された。表面を
横断する粗面試験機プローブにより、多くの突起が明ら
かになり、その幾つかは高さ10３nmに達していた（図
１）。尖針で表面を引っ掻くことによりできた銀層の断
面から、直径約100nmの一部融合した長球面になってい
ることが明らかになった。銀を引っ掻く操作により、基
質の粗面度は約130nmの厚さであることが知見された。

【００８８】スパッタコーティング−銀ターゲットから
6.75cm離して、2.25rpmで4.5分回転させながら、Perkin
-Elmer Randex Model 2400-85Aを使用してスパッタコー
ティングにより、水晶片を銀75オングストローム層で被
覆した。励起力200W及びアルゴン流速12.25cc/分を使用
した。銀フィルムは透明で、透過光では青かった。2500
倍に拡大した走査電子顕微鏡から、微粉の特徴のない表
面が明らかになった。

【００８９】銀電極−銀電極を、Ni及びCotton，J.Rama
n Spectroscopy,19,429,1988に記載の如く製造した。こ
れらは、偏平に銀のワイヤをガラス管内にTorrシールで
シールすることにより構築した。露出面は、約２×10mm
の寸法の長方形であった。グラインダーで、水中0.3μ
ｍアルミナスラリーを付けて電極を磨き、次いで蒸留水
中で濯ぎ、超音波処理して、表面に付着したアルミナを
総て除去した。この段階の次に、0.1M Na２SO４溶液
中、開始電位−550mV→＋500mV及び−550mVに戻す往復
電位段階からなる、酸化−還元サイクル（ORC）により
電極を粗面化した。参照電極としてAg-AgCl電極、補助
電極としてPt電極を使用した。酸化段階時に通過した全
電荷は、25mC cm−２に等しかった。

【００９０】銀コロイド−Lee及びMeisel,J.Phys.Chem.
86,3391,1982の方法を変形して、銀コロイドを製造し
た。硝酸銀90mgのアリコートを蒸留水500mlに溶解さ
せ、沸騰させた。１%クエン酸ナトリウム溶液10mlを一
度に全部添加し、溶液を45分撹拌すると、この間に銀コ
ロイドが形成した。コロイドを室温に冷却し、さらに精
製せずに使用するために貯蔵した。この製造法から得ら
れた典型的な粒径は、20〜80nmであった。

【００９１】実施例２染料−抗体コンジュゲートの製造抗体（２mg）を１%NaHCO３（pH8.6）２mlに溶解させ、
ジメチルホルムアミド（DMF）中の4-ジメチルアミノア
ゾベンゼン-4'-イソチオシアナート１mg/ml溶液の20μl
アリコートを添加した。混合物を一晩撹拌し、次いでSe
phadex G-25（荒い）カラム（１×30cm）上で脱塩し
た。コンジュゲートの紫外及び可視スペクトルを、DAB
及び抗体単独のスペクトルと比較し、置換度を測定し
た。エリスロシン-抗体コンジュゲートを、DMF中のエリ
スロシン−イソチオシアナートの濃度が2.5mg/mlであっ
た以外には、同一方法で製造した。

【００９２】実施例３DNP-BSAコンジュゲートを形成するためのウシ血清アル
ブミンへのジニトロフェニル基（DNP）の接合形成エタノール（150ml）中の2,4-ジニトロフルオロベンゼ
ン（2ml）の溶液を、蒸留水（100ml）中のウシ血清アル
ブミン（200mg）及びNa２CO３（10g）の溶液と混合し
た。混合物を24時間撹拌し、3000×gで20分間遠心分離
して、沈澱物質を除去し、上清をリン酸塩で緩衝させた
塩水（PBS）６リットルで23時間透析し、次いでPBS２リ
ットルで各々６時間２回、最終的に蒸留水２リットルで
各々６時間２回透析した。透析は、最後の水２リットル
の場合以外は、総ての溶液中に0.02%アジ化ナトリウム
を含んで室温で実施した。透析バッグの内容物を固体と
なるまで凍結乾燥させると、136mgとなった。サンプル
を臭化カリウムペレットに圧縮して、その赤外スペクト
ルをNicolet 60 SX FT 赤外分光計で測定した。1340cm
−１の強い振動帯は、天然BSAに固有のものではなく、
ニトロ基の導入を示していた（データは示されていな
い）。BSAの置換度は、BSA及びニトロ-BSAコンジュゲー
トがそれぞれ2,4,6-トリニトロベンゼン−スルホン酸
（TNBSA）により誘導される度合いを比較することによ
り定めた。TNBSAとの反応後、天然BSAの１mg/ml溶液の3
30nmに於ける平均吸収は、遊離アミノ基が誘導体形成さ
れた結果０から1.5に増加した。DNP-BSAコンジュゲート
の同一濃度では、330nmに於ける当初の吸収が1.2であっ
た（DNP基由来）が、これはTNBSA試薬とインキュベーシ
ョン後でも増加しなかった。本質的にDNP-BSAコンジュ
ゲート中の有効なアミノ基は総て、Sanger試薬によりDN
Pで誘導体形成できたと結論できる。

【００９３】実施例４銀フィルムに吸着したDNP-BSAコンジュゲートによるSER
Sスペクトルの生成新しく製造した銀−被覆スライド（化学沈積）を、遊離
ニジトロベンゼン（DNB）（図２Ａ）またはDNP-BSAコン
ジュゲート（図２Ｂ）を含む緩衝液（pH8.6）中でイン
キュベートし、次いで両方の場合についてSERSスペクト
ルを得た。各々DNP部分（２×10−９BSA）に関してDNB
10−３M及びDNP-BSA 10−７Mで同様のピーク強度が得ら
れた。遊離DNBとDNP-BSAコンジュゲートのDNP部分の間
に知見された表面増強ラマン光散乱の比強度に於ける４
桁もの大きな違いは、フィルム表面の島部分に対する後
者の吸着能力が非常に強いことを示しており、したがっ
てそのDNP部分はSERS増強を示し得る。島部分のないフ
ィルムの10−３Ｍ DNB溶液は、非常に弱いラマンスペク
トル（図２Ｃ）を与える。

【００９４】実施例５表面−増強共鳴ラマン分光学を例証するためのラマン−
活性染料の使用アビジン分子は、pH7.0でＫa＝5.8×10６リットル/mol
の親和力定数で染料HABA４分子を結合する。この染料
は、ラマン光散乱を励起するのに使用し得る波長に主要
スペクトル吸収（pH７でアビジンに結合するとき、最大
吸収＝495nm）を有し、SERRSが可能である。

【００９５】アビジンでの予備コーティング有りまたは
なしで化学的に沈積した銀フィルムをHABAの3mM溶液中
でインキュベーションした。次いでフィルムをHABA溶液
から除去し、PBSで洗浄し、そのラマンスペクトルを測
定した。図３Ａは、HABAを銀フィルムの表面に直接吸収
させるときに得られたスペクトルを示す。光散乱強度の
単一主要ピークが波数1406cm−１で知見され、1549cm−
１にショルダーが、1188及び1139cm−１に弱いピークが
知見された。図３Ｂのスペクトルは、銀フィルムをまず
室温で20分間、アビジン2.5×10−５M溶液中でインキュ
ベートし、次いでHABAを約0.3mMの終濃度に添加し、さ
らに20分間インキュベーションを継続して得られたもの
である。これらの条件下では、ラマン散乱強度の主要ピ
ークは1610cm−１に、幾つかの小さなピークは1160〜14
91cm−１に知見された。アビジンの非-存在下で知見さ
れた1406cm−１の大きなピークは、もはや知見されなか
った。HABAの非-存在下では、アビジン−被覆した銀フ
ィルムは、この領域では認識し得るスペクトルはなかっ
た（図３Ｃ）。

【００９６】実施例６サンドイッチイムノアッセイに於ける染料−抗体コンジ
ュゲート及びラマン読取銀電極を、１%NaHCO３、pH8.6中20μg/ml抗-TSH抗体溶
液の１mlアリコート中、37℃で１時間インキュベート
し、次いでPBS中の１%BSAでさらに１時間37℃でオーバ
ーコートした。次いでフィルムを、Abbott TSH EIAキッ
ト、Abbott No.6207からのTSH抗体標準０、4、10、25ま
たは60μIU/ml中で37℃１時間インキュベートした。PBS
で３回洗浄後、フィルムを40μg/mlの濃度で抗-TSH抗体
コンジュゲート１mlを含む試験管に移し、37℃でさらに
１時間インキュベートし、再洗浄し、SERRSスペクトル
を得た。

【００９７】SERRSスペクトルは、各電極に沿って５箇
所の異なる場所で測定し、結果を記録した。得られた典
型的なスペクトルの混和プロットは、試験したTSH抗原
の５種類の濃度に関して図４に示した。1151cm−１に於
ける平均ピーク強度を使用して、シグナル対濃度曲線を
作った（図５）。同一標準試料を、変形した市販酵素イ
ムノアッセイを使用してアッセイした（Abbott No.620
7，図６）。２つのプロットの比較から、SERRSの読取を
使用して得られた応答は、ゼロ抗原標準に関して例外的
に高い値である以外には、酵素イムノアッセイによって
得られたものと似ていることが知見された。この高いゼ
ロの読取は、再び試験しても不変だったので、酵素イム
ノアッセイでは結果に影響しなかったゼロ標準試料と他
の標準試料との間の組成の違いによるのだろう。

【００９８】実施例７洗浄なしのイムノアッセイ１%アスコルビン酸溶液を、銀コロイド（約0.02%固形
分、30±５nm粒径）に添加して、終濃度１mMとした。コ
ロイド溶液の3.0mlアリコートのそれぞれに、抗-ヒト甲
状腺刺激ホルモン抗体（リン酸塩で緩衝させた塩水中１
mg/ml）各0.015mlを添加した。抗体−被覆ゾルのpHを、
リン酸塩緩衝液で7.4に調節した。

【００９９】抗体−被覆ゾルのサンプルの一つに、60μ
l.U./mlヒト甲状腺刺激ホルモン（HTSH）標準0.015mlを
添加した。第２のサンプルに、０μl.U./mlHTST標準0.0
15mlを添加した。両方の標準は、ブタ血清マトリックス
中に含まれていた。ｐ-ジメチルアミノアゾベンゼン−
抗-TSH（DAB-ANTI-TSH）コンジュゲート0.015mlを各サ
ンプルに添加し、インキュベートした。20分後、表面増
強ラマンスペクトルを記録した。結果は、０μl.U./ml
サンプルと比較して60μl.U./ml HTSHを含むサンプルに
関しては、DAB染料のスペクトルに於ける最強ピークで
ある、1403cm−１のラマンシフトに於けるシグナルが約
２倍の強度を示した。

【０１００】実施例８近赤外励起を用いる蛋白質−染料コンジュゲートに於け
るSERSのデモンストレーション化学的に沈積した銀フィルムを、キュベット中の水に浸
漬し、1.06nmに於けるNd:Yagレーザーからの励起を使用
したBomem ラマン分光計を用いてSERSスペクトルを記録
した。ランダムノイズと識別可能なスペクトルは本質的
になかった。銀表面の非-存在下で、ｐ-ジメチルアミノ
アゾベンゼン−ウシ血清アルブミンコンジュゲートの水
溶液（20mg/ml）も走査した。使用した濃度でノイズと
区別可能な使用し得るスペクトルはほとんど無かった。
このデータを加等してプロットし、実験に関してブラン
クとして使用した（図７の下側）。上記ブランクで使用
した銀フィルムを、染料−蛋白質コンジュゲートを含む
キュベットに添加し、ラマンスペクトルを測定した。ブ
ランク試験からのデータを控除すると、染料のSERSスペ
クトル（図７の上側）が得られ、これは、1400及び1144
cm−１のラマンシフトに於いて強いラマン散乱を示し
た。

【０１０１】実施例９金コロイドの製造清浄な1000mlの丸底フラスコをAlconox（登録商標）石
鹸で洗浄し、数回、蒸留水で濯いだ。フラスコにマグネ
チックスターラーと加熱マントルを装備した。テトラク
ロロ金酸三水和物（0.058g）を蒸留水５mlに溶解した。
フラスコに蒸留水500mlを満たし、撹拌しながら沸騰す
るまで加熱した。金塩溶液、次いで1.0%クエン酸ナトリ
ウム溶液3.8mlをフラスコに添加した。20秒後にコロイ
ドの形成が、明るい黄色溶液から以下の色：紫→灰色→
赤、最終的にラベンダー-赤に変わることにより明らか
になった。凝集は視認できなかった。この方法により作
成したサンプルの電子顕微鏡分析から、粒子は直径50〜
60nm範囲であった。

【０１０２】実施例１０抗-HCG金コロイドSERRS試薬の製造（方法１）金コロイド（10.0ml）を0.02M K２CO３を用いてpH6.5〜
7.0に調節した。ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（HCG）（こ
の試薬を用いる試験に於いて目的とする被分析物質）に
特異的に結合する２種類の抗体（一方はマウスモノクロ
ーナル抗体で他方はポリクローナル抗体）を、別個に5m
M NaCl中で1.00mg/mlに希釈した。金コロイドを２つの
５mlサンプルに区分した。一方のサンプルには、ポリク
ローナル抗体25μlを、他方のサンプルにはモノクロー
ナル抗体25μlを添加した。個々のコロイドサンプルを
緩やかに振盪しながら混合し、次いで室温で10分インキ
ュベートした。インキュベーション後、10g/lのポリエ
チレングリコール（カーボワックス 20M）溶液100μlを
各５mlのアリコートに添加し、これらを室温で１時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、金コロイド
を1.7ml遠心分離管に移し、約5000×ｇで５分間遠心分
離すると、はっきりとペレットになった。上清を除去
し、0.2g/l カーボワックス 20Mで置換した。ペレット
を緩やかに振盪しながら再分散させた。この遠心分離及
び洗浄を全部で３回繰り返した。抗体を含むゾルを再混
合した。表面増強ラマン散乱分光によりアッセイで使用
するためのコロイド試薬を得るために、２種類のコロイ
ド（ポリクローナル−被覆及びモノクローナル−被覆）
の等量を使用前に一緒に混合した。

【０１０３】実施例１１抗-HCG金コロイドSERRS試薬の製造（方法２）金コロイド（30.0ml）を、0.02M K２CO３を使用してpH
6.5〜7.0に調節した。ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（HC
G）（この試薬を用いる試験に於いて目的とする被分析
物質）に特異的に結合する２種類の抗体（一方はマウス
モノクローナル抗体で他方はポリクローナル抗体）を、
別個に希釈した。ポリクローナル抗体を、0.250μg/ml
の濃度に、0.01Ｍクエン酸緩衝液（pH5.3）中で希釈し
た。モノクローナル抗体は、0.250μg/mlの濃度に、５m
M NaCl（pH7.0）中で希釈した。金ゾルを２つの15mlサ
ンプルに分けた。一方のサンプルには、ポリクローナル
抗体150μlを添加し、他方のサンプルには、モノクロー
ナル抗体300μlを添加した。各コロイドを緩やかに振盪
することにより混合し、次いで室温で10分間インキュベ
ートした。インキュベーション後、5mM NaCl（pH7.2）
中10g/lのポリエチレングリコール（カーボワックス 20
M）溶液300μlを各15mlのアリコートに添加し、これら
を室温で１時間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、金コロイドを1.7ml遠心分離管に添加し、約5000
×ｇで５分間遠心分離すると、あきらかにペレットが形
成した。上清を除去し、カーボワックス 20M（5mM NaCl
中10g/l，pH7.2）と置換した。ペレットを緩やかに振盪
させながら再分散させた。遠心分離を２回繰り返した
が、今回は、上清を0.2g/lのカーボワックス 20M、86mM
NaCl，pH7.2で置換した。抗体を含むコロイドを再混和
した。表面増強ラマン散乱分光によりアッセイで使用す
るためのコロイド試薬を得るために、２種類のコロイド
（ポリクローナル−被覆及びモノクローナル−被覆）の
等量を使用前に一緒に混合した。

【０１０４】実施例１２HCGに関するSERRSの洗浄なしのイムノアッセイ HCG標準試料を、ブタ血清０、31、63、125、250、500、
1000及び2000mI.U./mlで作成した。この希釈操作は、濃
縮HCGの小容量を大容量の血清に添加することを包含し
ており、そのため各サンプル中の蛋白質の全量は同一で
あり、存在するHCGのレベルのみが違う。ミクロ滴定ウ
エルを試験用の混合チャンバとして使用し、各ウエルに
所与の濃度のHCG標準試料10μlを添加した。これに金コ
ロイド免疫試薬200μlを添加した。試験を実施するため
に、混合物をウエルから除去し、ミニ試験管に添加し、
クレシルバイオレット水溶液（1.35μg/ml）５μlを添
加した。懸濁液を渦巻かせながら混合し、クレシルバイ
オレット染料由来の表面増強ラマンスペクトルを記録す
ることにより迅速に読み取った。最強のピークは、647.
1nmの励起波長由来の591cm−１のラマンシフトであっ
た。測定したピーク強度は、HCG濃度の関数に従って減
少し、図８に示されるような標準アッセイ曲線が得られ
た。

【０１０５】実施例１３HCGに関するSERRS洗浄なしイムノアッセイ以下の変更点：１．ＨＣＧ標準試料はブタ血清の代わりにヒト血清で作
成した；２．各標準５μlを、10μlの代わりに各ウエルに添加し
た以外には、実施例１２を繰り返した。標準アッセイ曲
線を図９に示す。

【０１０６】実施例１４銀コロイドの製造 1000mlのパイレックス製の丸底フラスコ及びガラススタ
ーラー一式を、王水中一晩浸漬することにより予備洗浄
した。ガラススターラーは、端に直径１インチのガラス
環を融合させたガラス棒からなっていた。キーホルダー
に付けた鍵と同じ様にこの環にさらに２個の１インチ直
径の環を自由に動くように付け、これらの２本の環が
“撹拌棒：paddles”として働くようにした。フラスコ
及びスターラーを水道水を蒸留した水の約1000mlアリコ
ートで10回濯いだ。ついで、これをAlkonox（登録商
標）石鹸溶液で洗浄し、次いで蒸留水で10回以上洗浄
し、最終的にMillipore Milli-Ｑ（登録商標）水系で製
造した蒸留水（18mhos伝導度）で５回洗浄した。

【０１０７】フラスコに“Milli-Ｑ”水500mlを充填し
た。この水に、試薬グレードの硝酸銀90mgを添加し、フ
ラスコを撹拌しながらゆっくりと沸騰させた。沸騰開始
直後、1.0%クエン酸ナトリウム10mlを添加した。５分以
内に反応液は黄色になり、灰−緑色に変化し、最終的に
鈍い不透明な緑色で安定した。沸点近くで全部で45分加
熱した。

【０１０８】実施例１５Ａヒツジ抗-テオフィリンとウシ血清アルブミン（BSA）−
テオフィリンコンジュゲートの間の免疫反応のSERRS検
出法 BSA分子１個当たり、平均して17個のテオフィリン分子
を含むBSA−テオフィリンコンジュゲートを、0.02%クエ
ン酸ナトリウム中100μg/mlに希釈した。ヒツジ抗-テオ
フィリンを、0.02%クエン酸ナトリウム中210μg/mlに希
釈した。酢酸エチル/テトラヒドロフラン/メタノール/
水（1/1/2/2容積比）の混合溶媒中、約20μg/mlで、N,N
-ジメチルアニリン-4-アゾベンゾ-4-チオカルバモイル
エチルアミノエチルジスルフィドからなる染料溶液を調
製した。BSA−テオフィリン20μlを、ヒツジ抗-テオフ
ィリン14μlと一緒に、37℃で10分プレ-インキュベート
した。次いで、銀コロイド0.5mlを添加した。凝集は視
認できなかった。次いで染料溶液５μlを添加し、37℃
で90分インキュベートした。インキュベーション直後
に、表面増強ラマンスペクトルを、488nmに於けるアル
ゴンイオンレーザーの励起を使用して記録した。スペク
トルは、1410cm−１のラマンシフトに於いて、染料のジ
アゾ官能基に帰属される強いピークを示した。

【０１０９】実施例１５Ｂ対照実験この実験に於いては、同一濃度で抗-連鎖球菌IgGを抗-
テオフィリンIgGと置換し、実施例１５Ａの記載と同一
アッセイ条件を実施した。ラマンスペクトルの記録か
ら、幾つかのピークが染料に帰属されることが知見され
たが、レーザー波長488nmに由来するラマンシフト1410c
m−１に最強ピークが知見された。これらのピークの強
度は、抗-テオフィリンを使用した時に使用した場合に
得られた強度のたったの13%であった。

【０１１０】実施例１５Ｃ対照実験この実験に於いては、実施例１５Ａの記載と同一の濃度
及び条件下で、BSAを、抗-テオフィリン抗体と併用した
BSA-テオフィリンコンジュゲートの代わりに使用した。
ラマンスペクトルの記録から、幾つかのピークが染料に
帰属されることが知見されたが、レーザー波長488nmに
由来するラマンシフト1410cm−１に最強ピークが知見さ
れた。これらのピークの強度は、BSA-テオフィリンコン
ジュゲートを使用した場合に得られた強度のたったの16
%であった。

【０１１１】実施例１５Ｄ 20μg/ml染料溶液５μlとコロイド１〜0.5mlを混合する
ことにより染料−標識化金属コロイドを製造でき、この
試薬を実施例１５Ａでコロイド、次いで染料の順次添加
の代わりに使用し得る。染料によるコロイドの不安定化
を避けるために、コロイドは、染料の添加前に、他の蛋
白質（例えば、ウシ血清アルブミン）または市販の界面
活性剤（Tween 20若しくはBrij 35）の希薄（１μg/ml
未満）溶液でオーバーコートし得る。

【０１１２】実施例１６拮抗様式を使用するテオフィリンの洗浄なしイムノアッ
セイテオフィリンを、0.02%クエン酸塩中、140、70、30、
６、2.8、0.55及び0.0μg/mlで溶解した。各濃度のアリ
コート100μlサンプルを試験管中に入れた。実施例７ａ
で記載したヒツジ抗-テオフィリンのアリコート14μlを
各試験管に入れて、室温で30分インキュベートした。実
施例７ａで記載した20μlBSA-テオフィリンコンジュゲ
ートを各試験管に添加し、渦巻かせながら混合し、続い
て実施例１５Ａに記載の如く銀コロイド0.5ml及び染料
溶液５μlを添加した。１分以内にサンプルをラマン分
光計に設置し、488nm励起のアルゴンイオンレーザーを
使用して表面増強ラマンスペクトルを記録した。染料の
ジアゾ官能基に帰属される1410cm−１のラマンシフトに
於けるピークの相対強度を測定し、図１０に示すように
コロイド試験サンプル中に存在するテオフィリン濃度の
関数としてプロットした。

【０１１３】実施例１７ビオチニル化ウシ血清アルブミンと4-ジメチルアミノア
ゾベンゼン-4'-イソチオシアナートとのコンジュゲート
（ビオチン-BSA-DAB）の製造．コンジュゲートの略号
（ビオチン-BSA-DAB）ビオチニル化ウシ血清アルブミン（Sigma Chemical Co.
から購入）（２mg）を１%NaHCO３、pH8.6（２ml）に溶
解し、ジメチルホルムアミド中の１mg/ml 4-ジメチルア
ミノアゾベンゼン-4'-イソチオシアナートの溶液のアリ
コート20μlを添加した。混合物を一晩撹拌し、次いでS
ephadex G-25（荒い）カラム（１×30cm）で脱塩した。

【０１１４】実施例１８SERRSによるビオチニル化ウシ血清アルブミン（BSA）の
ストレプトアビジン−被覆銀コロイドへの結合阻害の洗
浄なし検出ストレプトアビジン（0.02%クエン酸緩衝液中0.1mg/m
l，408μl）を37℃で１時間銀コロイド24mlとインキュ
ベートした。インキュベーション後、“アビジン−被
覆”したコロイドを24個のアリコートに分け、小さなガ
ラス製試験管に入れた。クエン酸緩衝液中の4.4mg/mlビ
オチンのアリコート12μlを12本の試験管に添加した。
試験管24本全部を37℃で45分インキュベートした。クエ
ン酸中、12.5、25、50、75、100及び125μg/mlの濃度で
ビオチニル化BSA-DABコンジュゲートの６種類の希釈液
を製造した。希釈したビオチニル化BSA-DABコンジュゲ
ート溶液の各100μlを、アビジン被覆したコロイドと、
遊離ビオチンに前暴露したアビジン被覆コロイドの両方
につきそれぞれ２個ずつの１mlサンプルに添加して、SE
RRSスペクトルを記録した。遊離ビオチンに前暴露した
サンプルは、ビオチンと接触させなかったものよりも弱
いシグナルを示した。２個の値を平均し、ビオチン−前
暴露サンプルと未暴露サンプルとの間の違いを、添加し
たビオチン−BSA-DABの濃度の関数としてプロットし
た。結果を図１１に示す。

【０１１５】実施例１９膜上に於けるＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）SERRSアッセイ抗-HBsAgは、0.5×４cmニトロセルロース試験片の中央
の位置に固定化する。ブロッターを試験片の上端に固定
する。この試験片の底部を、HBsAgの所定量を含むヒト
血漿120μlからなるサンプルと接触させる。サンプル
は、毛細管作用により固定化抗体を通り越すように上昇
するので、サンプル中のHBsAgは固定化抗-HBsAg抗体に
より捕獲される。次に、２μl/mlビオチニル化抗-HBsAg
抗体（補助の特異的部位）及び表面固定化抗-ビオチン
抗体10μl及び強いSERRSスペクトルを示し得る標識染料
を含む金属コロイドで処理する。あるいは、標識染料
を、金属粒子に固定化した抗-ビオチン抗体につけても
よい。コロイド粒子-染料-抗体複合体は、抗-HBaAgが試
験片に固定化されている位置付近に局在化する。これ
は、コロイド-固定化抗-ビオチン抗体に結合するビオチ
ニル化抗-HBsAgに結合する被分析物質（HBsAg）に結合
する、ニトロセルロースに固定化した抗-HBsAgの間のリ
ガンド結合反応を介して起こる。被分析物質（HBsAg）
の存在及び量は、試験片中央の上記の位置の染料標識の
SERRSスペクトルを測定することにより検出される。

【０１１６】実施例２０硝酸銀のクエン酸塩及び水素還元により製造した銀コロ
イドに於けるSERRSのデモンストレーションオキサジン725染料と混合したメチレンブルー染料の20
対１の希釈混合溶液を水中で製造した。等量を銀コロイ
ドの各サンプルに加えた。一方のサンプルは、クエン酸
ナトリウムで硝酸銀を還元して製造したもので、他方の
コロイドは、硝酸銀を水素還元して製造した。両方のコ
ロイドとも、ラマンシフトピークに関して同一SERRSス
ペクトルを示したが、相対ピーク強度は、図１２に示さ
れるようにコロイド製造に於ける違いを幾らか示してい
る。

【０１１７】実施例２１ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）のSERRSアッセイヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）のβサブユニットに
特異的な抗体を、50nmコロイド銀粒子表面に固定化し、
捕獲試薬を製造した。粒子を乾燥ミルク0.1%溶液でオー
バーコートし、非-特異的結合を抑制した。はっきりし
たSERRSスペクトルを示し得る標識染料（ジメチルアミ
ノアゾベンゼン）をHCGのα-サブユニットに特異的な第
２の抗体につけてコンジュゲートを形成した。捕獲試薬
を0.01molクエン酸緩衝液、pH7.4で希釈して濃度0.05%
とし、同一クエン酸緩衝液中、濃度20μg/mlでコンジュ
ゲートを含む溶液と混合した。50μlアリコートを各
々、HCG０〜200mI.U.を含む６種類の各試験サンプルか
ら取り出し、各々を捕獲試薬−コンジュゲート混合物の
アリコート100μlと混合した。次いで混合物を室温で30
分インキュベートした。この間に、存在するHCGのβサ
ブユニットは固定化抗-β抗体を介して粒子に結合し、
α-サブユニットは抗-α-抗体を介してコンジュゲート
に結合し、これにより、粒子にラマン標識が結合する。
全結合量は存在するHCG量に依存する。インキュベーシ
ョン後、各混合物を吸着パッドにより支持されているフ
ィルタからなる別個のフィルタアセンブリに適用し、未
結合コンジュゲートを含む液体は、フィルタを介して下
の吸着パッドに吸引する。フィルタ表面は、HCG被分析
物質を介してこれらに結合した粒子及びコンジュゲート
を保持している。次いで、捕獲標識分子にSERSまたはSE
RRSスペクトルを表示させるのに十分な光を照射する
と、フィルタ表面の粒子が密に充填しているので増強効
果をさらに増幅し得る。

【０１１８】前述の本発明の好ましい態様は、本発明の
例示及び説明するためのものである。本発明の範囲はこ
れらによって限定されず、付記請求項及びその均等物に
よって定義される。当業者には、上記教示の範囲内で好
ましい態様の種々の変形及び改質が可能である。このよ
うな改質及び変形は、本発明を逸脱するものではなく、
付記請求項によって定義される本発明の範囲に含まれ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】作成した状態での化学的に沈積した銀フィルム
表面を、粗面試験機で探査した際の針入状況を示す図で
ある。

【図２】（Ａ）化学的に沈積した銀フィルムの存在下で
の2,4-ジニトロベンゼン溶液、10−３Ｍ、（Ｂ）化学的に沈積した銀フィルムの存在下での2,4-ジ
ニトロフェニル-BSAコンジュゲート、10−７Ｍ（DNP部
分に関して）、（Ｃ）銀フィルムの非-存在下での2,4-ジニトロベンゼ
ン、10−３Ｍ（特徴をはっきりさせるためにＡ及びＢに
対して縦軸を４倍に拡大した）のラマンスペクトルを示
す図である。スペクトル獲得条件：獲得時間，19秒；電
力，41ｍＷ；励起波長，457.9nm。

【図３】（Ａ）HABAの３mM溶液及び、（Ｂ）HABA0.3mM中で製造したアビジンの2.5×10−５Ｍ
溶液、中でインキュベートした化学的に沈積した銀フィ
ルムから得られたSERRSスペクトルを示す図である。HAB
Aの非-存在下のアビジン吸着表面（Ｃ）からは、この領
域では識別可能なスペクトルは無かった。スペクトル獲
得条件：獲得時間，100秒．電力，50mW；励起波長，45
7.9nm。

【図４】DAB-抗-TSH抗体コンジュゲートを使用するTSH
抗原の“サンドイッチ”イムノアッセイに於いて得られ
た典型的なSERRSスペクトルの混合プロットを示す図で
ある。抗-TSH捕獲抗体で被覆した銀電極を種々の濃度の
TSH抗原でインキュベートし、次いでDAB-抗-TSH抗体コ
ンジュゲートの40μg/ml溶液に移した。（Ａ）銀表面の
非-存在下でのDAB-抗-TSH抗体コンジュゲートの40μg/m
l溶液のSERRSスペクトル。プロット（Ｂ）、（Ｃ）、
（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）は、各々、TSH抗原を０、
４、10、25及び60μIU含む溶液中で捕獲抗体−被覆電極
をインキュベートし、次いでDAB-抗-TSH抗体コンジュゲ
ートの40μg/ml溶液に移して得られたスペクトルを示
す。

【図５】既知のTSH標準試料に関するTSH抗原濃度の関数
として、1410cm−１に於ける平均SERRS強度のプロット
を示す図である。値は、銀電極上の５つの異なる場所か
ら得、平均したものである。測定した各TSH抗原濃度毎
に１本の電極を使用した。括弧内に挿入した数字は、測
定した被分析物質の各濃度に関する変動係数（標準偏差
/平均）である。

【図６】市販の酵素イムノアッセイキット（Abott Labs
No.6207）の試薬を使用して得られた吸収（492nm）対T
SH抗原濃度を示す図である。各データポイントは、４回
の測定の平均を表す。括弧内に挿入した数字は、測定し
た各TSH抗原濃度毎の変動係数（標準偏差/平均）であ
る。

【図７】（下）20mg/mlでp-ジメチルアミノ−アゾベン
ゼンウシ血清アルブミンコンジュゲートの、別個に測定
し、銀表面の非-存在下で実施した溶液状態のスペクト
ルに加等したブランクの銀フィルムのスペクトル、
（上）p-ジメチルアミノアゾベンゼンウシ血清アルブミ
ンコンジュゲートの上記溶液中にブランクと同じ銀フィ
ルムを浸漬することによって得られたスペクトルの近Ｉ
Ｒ励起を用いるSERSスペクトルを示す図である。

【図８】金コロイド、クレシルバイレット染料またはリ
ポーター分子を用いてブタ血清中で製造したヒト絨毛性
ゴナドトロピン（HCG）の標準試料の洗浄なしイムノア
ッセイ及び、HCG濃度の関数としてプロットしたSERRS読
取値を示す図である。

【図９】金コロイド、クレシルバイレット染料またはリ
ポーター分子を用いてヒト血清中で製造したヒト絨毛性
ゴナドトロピン（HCG)の標準試料の洗浄なしイムノアッ
セイ及び、HCG濃度の関数としてプロットしたSERRS読取
値を示す図である。

【図１０】銀コロイド、N,N-ジメチルアニリン-4-アゾ
ベンジル-4-チオカルバモイルエチルアミノエチルジス
ルフィド染料またはリポーター分子を用いて、クエン酸
緩衝液中で製造したテオフィリンの標準試料の洗浄なし
イムノアッセイ及び、テオフィリン濃度の関数としてプ
ロットしたSERRS読取値を示す図である。

【図１１】染料またはリポーター分子［ジメチルアミノ
アゾベンゼン（DAB）］、及びビオチンの両方に接合し
たウシ血清アルブミン［完全なコンジュゲートの略号は
ビオチン-BSA-DABである］の、ビオチン-BSA-DBA濃度の
関数としてプロットしたSERRS読取値による、ストレプ
トアビジン−被覆銀コロイドに対する遊離ビオチンによ
る結合の阻害の洗浄なしの検出を示す図である。

【図１２】還元剤として（Ａ）水素及び（Ｂ）クエン酸
塩のいずれかを用いて製造した、銀コロイド上のメチレ
ンブルー：オキサジン725の20：1混合物の表面増強ラマ
ン散乱（SERRS）スペクトルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トーマス・イー・ロアアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、フアーンデイル・ロード・985 (72)発明者ジエイムス・ジエイ・マーカスアメリカ合衆国、イリノイ・60515、ダウナーズ・グロウブ、サーテイーシツクスス・ストリート・550 (72)発明者テレーゼ・コツトンアメリカ合衆国、アイオワ・50010、エイムズ、ユタ・ドライブ・4134 (72)発明者バーナード・ロスペンドウスキイギリス国、スコツトランド・ジー・ 32・９・エル・ジー、グラスゴウ、サンデイーヒルズ、サンデイーヒルズ・ドライブ・20 (56)参考文献国際公開93／02362（ＷＯ，Ａ１) ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．182（1989）ｐ 388−398 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/532

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被分析物質−媒介リガンド結合事象を観
測することにより、試験サンプル中の被分析物質の存在
または量を検出する方法であって、試験サンプル、特異的結合メンバー、ラマン活性標識及
び表面増強ラマン光散乱を誘導し得る表面を有する粒子
を含む試験混合物を形成するステップ、ここで、被分析
物質、特異的結合メンバー、ラマン活性標識及び粒子の
会合により複合体が形成される；複合体中のラマン活性標識に検出可能なラマンスペクト
ルを生むのに十分な放射エネルギーを試験混合物に照射
するステップ；次いで検出された表面増強ラマン散乱ス
ペクトルに於ける違いを観測するステップ、ここで該違
いが、試験混合物中に存在する被分析物質の量に依存す
る；とを含む該方法。
【請求項２】ラマン活性標識が特異的な結合メンバー
にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】ラマン活性標識が粒子にあることを特徴
とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】特異的な結合メンバーが粒子にあること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】標識化特異的結合メンバーが粒子にある
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】特異的な結合メンバーが標識化粒子にあ
ることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】特異的な結合メンバーが、特異的な結合
メンバー及び被分析物質からなる第１の特異的な結合対
の一方であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】ラマン活性標識が特異的結合メンバーと
粒子の両方にあることを特徴とする請求項１に記載の方
法。
【請求項９】試験混合物がさらに第２の特異的結合メ
ンバーを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】第２の特異的結合メンバーが、特異的
結合メンバーと被分析物質からなる第１の特異的結合対
の一方であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】第２の特異的な結合メンバーが、第２
の特異的な結合メンバーと被分析物質からなる第２の特
異的な結合対の一方であり、第２の特異的な結合メンバ
ーは第１の特異的な結合メンバーと異なることを特徴と
する請求項９に記載の方法。
【請求項１２】第２の特異的な結合メンバーが表面増
強ラマン光散乱を誘導し得る表面を有する第２の粒子に
あることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】第１及び第２の粒子が同一物質からな
ることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】照射エネルギーにより表面増強共鳴ラ
マン散乱が起きることを特徴とする請求項１に記載の方
法。
【請求項１５】さらにエンハンサーを複合体に添加す
ることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】試験混合物中の被分析物質−媒介リガ
ンド結合事象を観測することにより、体液から誘導した
試験サンプル中の被分析物質の存在または量の測定法で
あって、試験サンプル、特異的結合メンバーにより認識される被分析物質エピト
ープを発現する被分析物質類似体を含み、媒介分子を介
して直接または間接的にラマン活性標識につながってい
る標識化被分析物質類似体及び表面増強ラマン光散乱を
誘導し得る表面を有する粒子と結合した特異的結合メン
バーを含む粒状捕獲試薬を含む試験混合物を形成し；粒子上の特異的結合メンバーに対する標識化被分析物質
類似体の結合の程度が、被分析物質の存在により影響さ
れるように、標識化被分析物質類似体を粒子上の特異的
結合メンバーに結合させ；試験混合物中の結合した標識化被分析物質類似体上のラ
マン活性標識が検出可能なラマンスペクトルを発生する
のに十分な放射エネルギーを試験混合物に照射し；次い
で試験混合物中に存在する被分析物質に依存する、検出
した表面増強ラマン散乱スペクトルの違いを観測するこ
とを含む該方法。
【請求項１７】多孔性物質による、ラマン活性標識に
会合した粒子の分離段階をさらに含むことを特徴とする
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】放射エネルギーにより表面増強共鳴ラ
マン散乱が起きることを特徴とする請求項１６に記載の
方法。
【請求項１９】さらに試験混合物にエンハンサーを添
加することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の
方法。
【請求項２０】試験混合物中の被分析物質−媒介リガ
ンド結合事象を観測することにより、試験サンプル中の
被分析物質の存在または量を検出する方法であって、被分析物質の類似体と粒状捕獲試薬を含む試験サンプル
との試験混合物を形成するステップ、ここで粒状捕獲試
薬が表面増強ラマン光散乱を誘発し得る表面を有する該
粒状捕獲試薬に結合した特異的結合メンバーを含み、該
粒子がラマン−増強標識に会合している；試験混合物を、近位端及び遠位端を持つクロマトグラフ
ィー物質上に載置するステップ、該クロマトグラフィー
物質が、被分析物質−類似体に結合し得、捕獲部位に固
定化された捕獲試薬を含む；キャピラリー作用により近位端から遠位端へむかって試
験混合物を移動させるステップ；検出可能なラマンスペクトルを発生させるのに十分な放
射エネルギーを捕獲部位に照射するステップ；及び試験
混合物中に存在する被分析物質の量に依存する、表面増
強ラマン散乱スペクトル中の違いを観測するステップと
を含む該方法。